Esses protocolos permitem quantificação de resolução de células únicas, co-expressão de marcadores e uma análise especial usando amostras de tecido congelado com estatação fixa e parafina parafina para elucidar os papéis das células imunes no câncer. Esta técnica é uma ferramenta poderosa que facilita a caracterização simultânea de um marcador 40 em uma única seção de tecido, preservando amplamente a estrutura do tecido nas amostras. O passo crítico é a otimização e validação de anticorpos.
A não conclusão da etapa pode resultar em imagens de baixa qualidade que podem comprometer a retenção de dados e resultados reprodutíveis de alta qualidade. Comece girando para baixo todos os anticorpos contendo tubos a 10.000 x G por cinco minutos, adicione anticorpos individuais ao tampão de bloqueio e misture bem. Não perturbe a parte inferior do tubo de anticorpos ao cano-lo.
Filtre o painel de anticorpos pré-molhando um dispositivo de filtro centrífugo de 0,1 micrômetro com 100 microliters de tampão de bloqueio. Gire o filtro a 10.000 x G por dois minutos e remova o fluxo de tampão de bloqueio com uma pipeta. Em seguida, transfira o painel de anticorpos para uma coluna de giro e gire o filtro a 10.000 x G por dois minutos.
Descarte a coluna de giro e use o fluxo através como o painel de anticorpos filtrado. Para a coloração do anticorpo, remova o tampão de bloqueio dos slides, derrubando cada slide de lado e tocando suavemente as bordas contra um limpador de tarefas. Coloque os slides em uma câmara de umidade e adicione 100 a 200 microliters de mistura mestre de anticorpos ao tecido.
Adicione slides de controle positivos e negativos ao lote de coloração e incubar os slides a 4 graus Celsius durante a noite. Para configurar o instrumento, faça login no software de controle e clique em Wake Up, se o instrumento estiver no modo de sono. Clique em Trocar amostra para carregar um slide e, em seguida, clique em Continuar abrindo a porta.
Coloque o slide no slot de carregamento com uma amostra voltada para cima e a etiqueta à direita, clique em Continuar a fechar a porta. Selecione o projeto e selecione o nome de slides para a amostra carregada. Visualize a imagem panorâmica no painel de imagem óptica de slide para o campo de exibição ou seleção FOV, clique no menu Mode e selecione O Detector de Elétrons Secundário, em seguida, clique no menu modo de imagem e escolha QC 300 micrômetro.
Clique em Jog Stage para controlar o local FOV e clique nas setas para navegar e selecione a posição do FOV. Clique em adicionar FOV, defina 400 micrômetros por 400 micrômetros como o tamanho do campo e selecione Fine como o Modo de Imagem e 1 milissegundo de Dwell Time, clique em Confirmar. Depois de criar uma lista de FOV, proceda ao foco da imagem e ajuste a Estigmas movendo o feixe para uma região de tecido que não será imageda.
Ajuste os parâmetros até que uma imagem central clara seja obtida, clique em Iniciar Run. As imagens adquiridas serão automaticamente carregadas e armazenadas no aplicativo de gerenciamento de imagens baseado na Web. A matriz mostrada aqui descreve a porcentagem de crosstalk derivada da pureza da sonda e óxidos.
Aqui as caixas azuis indicam maior ou igual a 0,5% de crosstalk e caixas claras indicam menos de 0,5% de crosstalk. Para as tags de massa, sondas que contribuíram com pelo menos 0,5% de crosstalk em nenhum canal, um ou dois canais, ou mais de dois canais são mostrados aqui. Canais em massa que recebem pelo menos 0,5% de crosstalk de nenhuma sonda, uma ou duas sondas, ou mais de duas sondas também são mostrados.
As imagens representativas de coloração em diferentes tecidos como adenocarcinoma pulmonar, rim não neoplásico e amígdalas são retratadas aqui. Uma imagem de uma seção de tecido de amígdalas manchada usando essa técnica e visualizada usando um programa de software de análise de imagem digital de terceiros antes de filtrar e corrigir é apresentada aqui. A imagem da mesma seção sob as mesmas condições após as etapas de filtragem e correção é mostrada aqui.
Esse método gera imagens que podem ser carregadas para um software de análise de imagem digital de terceiros, permitindo análises abrangentes como compartimentação de tecidos, segmentação celular, co-expressão de marcadores, bem como análise de vizinhos e análises distantes. Métodos de imagem altamente multiplex estão disponíveis através de pesquisas. Ao construir diferentes painéis, os pesquisadores podem investigar amostras de câncer, normal, paraneoplásica, inflamatória e infecciosa.
