The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia M&#252;nch for technical support.

Todos os experimentos com tecidos ou sangue amostras humanas devem ser aprovados por um comitê de ética e conduzida de acordo com todas as orientações dadas na votação ética. 1. Cellular Enriquecimento <ol><li> Tumores líquidos / separação de células activadas por fluorescência. <ol><li> Isolar células mononucleares de medula óssea ou amostra de sangue através da realização de lise de eritrócitos com cloreto de amónio ou por gradiente de densidade de Ficoll centrifugação. <ol><li> Para a lise de eritrócitos, combinar um ml de amostra com 4 ml de solução de cloreto de amónio. Incubar a solução em gelo durante 5 - 10 min. Adicionar 40 ml de salino tamponado com fosfato (PBS) + 2% de soro fetal de vitelo (FCS) e centrifugar durante 5 minutos a 400 xg e 4 ° C. </li><li> Para Ficoll centrifugação em gradiente, camada de 10 ml de amostra em 15 ml de FicollHypaque para formar duas camadas distintas (cuidado para não perturbar as camadas). Centrifuga-se a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente (15 - 25 ° C) cuidadosamente e colher os mononuclearescélulas recolhidas na interfase. </li><li> Girar as células e levá-los até em PBS + 2% FCS. Centrifuga-se a 400 xg durante 5 min e tomar-se em 1 ml de PBS + 2% FCS. Tomar uma alíquota como controle negativo e uma alíquota para cada corante fluorescente usado na mancha final. </li></ol></li><li> Incubar com anticorpos marcados por fluorescência úteis para isolar a população de células leucémicas em diluição, de acordo com as instruções do fabricante em gelo durante 30 min. Também manchar as alíquotas utilizados para a compensação com cada um dos anticorpos individualmente. Lavar duas vezes com PBS + 2% de FCS. NOTA: Os anticorpos utilizados foram de ratinho anti-humano contra CD117-PE (clone 95C3), CD34-FITC (clone 8G12) e CD33-PE (clone P67.6). </li><li> Células filtrar através de 35 um filtro de células, o ideal é usar tubos com filtro de células integradas no cap. </li><li> Adicionar mancha de viabilidade celular (por exemplo, 7-AAD). Classificar células usando um separador de células adequado 11 (Figura 2). Recolher as células em Isc<html> Modificado por Dulbecco de ove Médio (IMDM) contendo 10% de FCS. </li></ol></li><li> Os tumores sólidos / captura de Laser microdissection. <ol><li> Para as experiências descritas, foram utilizadas amostras de FFPE de espécime de câncer de pulmão. Para esta finalidade tecido de cancro de pulmão foi imediatamente fixado em formalina a 4% tamponado após ressecção cirúrgica e pedaços de cerca de 3 x 2 x 1 cm em caso embebidos em parafina para análise posterior. </li><li> Os cortes de 5-10 mm de espessura do embebido em parafina (FFPE) amostra fixado em formol com um micrótomo. Montagem de secções em lâminas de membrana coberta por película e seco a 37 ° C durante 1 h. Desparafinar e hidratar as secções montadas por incubação sucessiva em xileno, etanol absoluto, 70% e água, durante 1 min cada. </li><li> Corar as secções com hematoxilina durante 20 segundos e, em seguida, enxaguar com água da torneira. Recolha a população de células de interesse através de um sistema de captura de microdissecção a laser (ver também 12). </li></ol></li></ol>title &quot;&gt; 2. extração de proteínas <ol><li> Tumores líquidos. <ol><li> Centrifuga-se a suspensão de células a partir do passo 1.1.5 a 400 xg, 4 ° C durante 4 minutos e desprezar o sobrenadante. Lavar duas vezes com 500 ul de PBS frio e centrifugação durante 5 min a 400 xg e 4 ° C </li><li> Adicionar 40 ul de tampão de lise por 10 6 células e incubar durante 15 min em gelo (10 5 células (aprox. 10 ug de proteína total) deve ser o número mínimo de células). Centrifuga-se o lisado a 14.000 xg, a 4 ° C durante 10 minutos e transferir o sobrenadante (lisado celular limpo) para um novo tubo de reacção. Desprezar o pelete. </li></ol></li><li> Tumores sólidos. <ol><li> Adicionar 60 ul de tampão de lise do tecido com o tecido microdissecados e incubar durante 15 min em gelo, recolher o fluido por centrifugação curta e transferir a suspensão para um novo tubo de reacção. Sonicar o lisado em gelo durante 3 min. </li><li> Adicionar 15 ul de 20% de dodecilsulfato de sódio (SDS) para uma alcançar um co final de SDSncentration de 4%. Incubar o tecido microdissecados a 99 ° C num bloco de aquecimento durante 1 hora e agitada a 600 rpm. Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g, 18 ° C durante 10 minutos e transferir o sobrenadante para um novo tubo. </li></ol></li></ol> 3. Estabelecimento de um SILAC de Spike-in Quantificação Padrão (Super-SILAC padrão) NOTA: O padrão de quantificação consiste em uma mistura de proteínas marcadas com SILAC derivado 4-6 linhas de células que correspondem ao tipo de tumor de interesse. Para atingir a máxima sobreposição entre o proteoma de referência marcado com SILAC e do proteoma derivado de tumor, uma análise do componente principal deve ser realizada antes que as linhas de células são seleccionadas para o padrão de quantificação 14. <ol><li> Análise de componentes principais (PCA). <ol><li> Para determinar os padrões de linhas de células de expressão de proteínas, cultivar cerca de dez linhas de células diferentes em meios de cultura de células apropriado. Lisam as células como descritono passo 2.1. Prepare os lisados ​​celulares para espectrometria de massa como descrito na etapa 6.1. </li><li> Analisar o padrão de cada linha celular expressão da proteína em um de alta resolução, o espectrômetro acoplado à cromatografia líquida de massa (nanoLC-MS / MS). </li><li> Analisar os dados brutos resultantes usando uma MaxQuant mercadorias livres e realizar uma análise principal-componente utilizando o software associado, como Perseus 16,17. </li><li> Selecione 4-6 linhas celulares que mostram a maior diversidade entre os seus perfis de expressão de proteínas e usá-los para gerar o padrão spike-in Super-SILAC. </li></ol></li><li> SILAC-rotulagem e verificação de etiquetas. <ol><li> Cultivar as linhas celulares seleccionadas para, pelo menos, cinco ciclos de células em meio de cultura de células apropriado SILAC, em que a arginina e a lisina são marcados com isótopos estáveis ​​de carbono e de azoto (meio SILAC) 4. </li><li> Lise das células, tal como descrito no passo 3.1 e preparar lisados ​​celulares por espectrometria de massa como descrito na etapa 6.1.Medir a eficácia de incorporação de rotulagem SILAC por nanoLC-MS / MS. Analisar os dados em bruto resultantes com MS MaxQuant e determinar a eficácia do processo de rotulagem SILAC. Isto é conseguido através da contagem do número de péptidos identificados na sua marcada (pesado) e as suas formas endógenas (luz), e o cálculo da razão (pesado) / (luz pesada +). Eficiência de marcação deve ser superior a 98%. </li></ol></li><li> Combinação de proteomas SILAC e validação. <ol><li> Cultive e expandir linhas de células seleccionadas de acordo com instruções do fabricante em meio SILAC apropriado. Lise das células, tal como descrito no passo 2.1 para tumores líquidos ou como descrito no passo 3.2 para tumores sólidos e determinar a concentração de proteína para cada lisado celular. </li><li> Misture quantidades equimolares de proteína de cada linha celular e dividir a mistura em aliquota. Snap-congelar as alíquotas e armazenar a -80 ° C até que a medição. Para uma experiência que você precisa 20 - 50 mg de padrão Super-SILAC. Tome cuidado para preparar o standard em excesso como alterar o padrão dentro de uma série de experiências devem ser evitados. </li></ol></li></ol> 4. Medição da concentração de proteína e Spike-in <ol><li> Tumores líquidos. <ol><li> Usando o ensaio de quantificação de proteína determinar as concentrações de proteína dos respectivos lisados ​​celulares e o padrão Super-SILAC. </li><li> Misture quantidades iguais de lisado celular foi afastada e o padrão Super-SILAC e, subsequentemente, adicionar o dodecil sulfato de lítio (LDS) tampão (25% do volume da amostra) e agente redutor (10% do volume da amostra). </li><li> Aquece-se a solução resultante em um bloco de aquecimento a 72 ° C durante 10 min. Opcionalmente, armazenar as proteínas desnaturadas resultantes à temperatura de -80 ° C. </li></ol></li><li> Tumores sólidos. <ol><li> Para a medição da concentração de proteína num leitor de placas, misturar um padrão de albumina de soro bovino (BSA) a diluição série solução, o lisado e o padrão Super-SILAC apropriado com uma proteína comercialmente disponívelssay em uma placa de 96 poços, e agita-se durante 1 min, incubar durante tempo indicado e medir a absorvância, tal como indicado pelo fabricante. NOTA: A alta concentração de SDS e ditiotreitol (DTT) no lisado é um problema para a maioria dos ensaios disponíveis para a determinação da concentração de proteína. </li><li> Misture quantidades iguais de lisado clarificado e o padrão Super-SILAC com 200 ul de ureia na unidade de filtro e centrifugar a 14000 xg durante 30 min a 20 ° C. Não use mais de 50 ul de ligado clarificado e o padrão Super-SILAC. Evitar a temperaturas abaixo de 15 ° C, de modo que a ureia não se cristalizar. </li></ol></li></ol> 5. A separação da amostra e Proteína Digest <ol><li> Tumores líquidos. <ol><li> Separados 30 - 100 ug de proteína total por pista num 4 - gradiente de gel de SDS-PAGE a 12%. Proteínas mancha com Coomassie Blue O / N. Retire o excesso de corante Coomassie de duas lavagens subsequentes com água. </li><li> Corte cada pista a partir do gel e dividi-loem 23 fatias de tamanho igual, independentemente do padrão de coloração gel. Processe as fatias de gel em separado, cada uma em 0,6 ml em frasco de polipropileno. </li><li> Lavam-se as fatias de gel com água e metanol / água (50:50, v / v), reduzir com DTT 10 mM por incubação durante 30 min a 56 ° C. Alquilar as fatias de gel com 55 mM de iodoacetamida (IAA), por incubação de 60 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Entre os passos de manipulação de amostra, lavar com fatias de acetonitrilo durante 15 minutos e seco num SpeedVac para remover o excesso de solvente e melhorar a absorção da solução de reagente. </li><li> Realizar de clivagem de protease através da hidratação fatias de gel foram secas com a quantidade mínima de solução de tripsina porcina (12,5 ng / mL em 0,025 M de bicarbonato de amónio aquoso) durante 16 horas a 37 ° C. </li><li> Adicionar 10 ul de água a fatia de gel e incubar durante 15 min a 37 ° C. Adicionar 80 ul de acetonitrilo e incubar durante 15 min a 37 ° C. Centrifugar a 15.800 xg, por 1 min. Recolher o sobrenadante e armazenar em um separadas 0,6 mltubo. </li><li> Adicionar 65 ul de 5% de ácido fórmico a solução, vortex e incubar durante 15 min a 37 ° C. Adicionar 65 ul de acetonitrilo e incubar durante 15 min a 37 ° C. Centrifugar a 15.800 xg por 1 min. Recolhe-se o sobrenadante e adicionar-se ao sobrenadante da etapa anterior. Evapora-se o sobrenadante combinado até à secura num concentrador de vácuo. </li></ol></li><li> Tumores sólidos. <ol><li> Para remover SDS de lisado tecido usar o seguinte protocolo FASP, também descrito como na referência 15. </li><li> Depois da primeira centrifugação descrito no passo 5.2.3 adicionam-se mais 200 ul de ureia 8 M sobre o filtro, e ainda de centrifugação a 14000 xg durante 20 min a 20 ° C. Descartar o filtrado por escoamento. </li><li> Adicionar 100 ul de IAA e misturar num termomisturador a 600 rpm durante 1 min. Incubar o filtro durante 20 min a 20 ° C no escuro. Centrifuga-se o filtro a 14000 xg durante 10 min a 20 ° C. </li><li> Adicione 100 ml de ureia para o filtro e centrifuge a 14.000 xg, durante 15 min a 20 ° C. Repita este passo mais uma vez. </li><li> Adicionar 100 ul de NH 4 HCO 3 ao filtro e centrifugar a 14000 xg durante 10 min a 20 ° C. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Adicionar 40 ul de NH 4 HCO 3 + 1 ml (= 0,4 ug) de tripsina e misturar em termomisturador a 20 ° C durante 600 rpm, 1 min. Incubar o O filtro / N numa câmara húmida a 37 ° C. Transferir o filtro para novos tubos de recolha. </li><li> Centrifuga-se o filtro a 14000 xg durante 10 min a 20 ° C. Adicionar 50 ul de NH 4 HCO 3 e centrifugar o filtro a 14000 g durante 10 min a 20 ° C. Armazenar os péptidos resultantes à temperatura de -20 ° C até à medição espectrométrica de massa. </li><li> Para a medição da concentração de péptido, 50 uL de distribuir o fluxo de passagem e que resulta de uma série de diluições apropriadas de triptofano puro em uma placa de 96 poços. Medir a fluorescência do triptofano. Converter a concentração resultante detriptofano a concentração de péptido, como 0,1 ug de triptofano corresponde a 9 ug de proteína. </li></ol></li></ol> 6. Análise de Cromatograf ia Líquida e Espectrometria de Massa <ol><li> Redissolver peptídeos em tampão de carga de 30 ul durante 5 minutos num banho de ultra-sons. Girar para baixo numa centrífuga a 15.800 xg durante 1 min e pipetar a solução límpida em um frasco de auto-amostrador MS. </li><li> Injectar 5 ul de amostra por análise usando o amostrador automático do sistema nanoLC-MS / MS. Concentre-se e peptídeos dessalinizar on-line em uma fase reversa C18 pré-coluna (0,15 mm de diâmetro x 20 mm com 5 mm de tamanho de poros do material C18) montado em qualquer uma configuração de coluna ventilada ou uma configuração pré-coluna de comutação. </li><li> Péptidos separados numa fase inversa C18 Microcoluna (0,075 mm Dl x 200 mm de auto-embalada com 3 mm ou menor tamanho de poros do material numa coluna C18 de nanospray auto-pack tais como PicoFrit, utilizando um gradiente de 90 min de 5&gt; acetonitrilo a 35% vs 0,1% de ácido fórmico. aquosa a 300 nl /min. Transferência eluente em um quadrupolo híbrido / espectrômetro de massa Orbitrap através de uma fonte de íons nanospray. </li><li> Analisar peptídeos usando um método de dados Top15 dependente aquisição (MS m / z gama 350 -. 1600, alvo resolução 70.000 FWHM, alvo AGC 1 x 10 6, tempo de enchimento máximo 60 ms MS / MS começar a massa 100, alvo resolução 17.500 FWHM, AGC Meta 2 x 10 5, tempo de preenchimento máximo 60 ms MS / MS limite de 3 x 10 4, incluem estados cobram 2 -. 5, Normalizado Collision Energia NCE 25%, dinâmica de exclusão de 15 segundos). </li></ol> Análise 7. Dados <ol><li> Para análise dos dados usar o software MaxQuant 16 disponíveis gratuitamente. Um protocolo detalhado para a análise dos dados é descrito em bioinformática 16,17. Para a análise, combinar arquivos de dados brutos de todas as fatias de uma pista SDS-PAGE em um único experimento 17. </li></ol>

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Os autores não têm qualquer conflito de interesses ou outros assuntos para divulgar.

Perfis de espectrometria de massa de proteomas-celulares de cancro derivadas de pacientes é necessária para a descoberta de novos biomarcadores preditivos de diagnóstico / bem como para se obter uma melhor compreensão da biologia das células do cancro, que pode por sua vez conduzir à identificação de novos alvos potenciais drogas. No entanto, tais análises de espectrometria de massa são altamente desafiador, em particular porque várias questões pré-analíticos têm de ser resolvidos, se se quiser obter resultados robustos e biologicamente relevantes. O fluxo de trabalho experimental descrito aqui permite a caracterização proteômica quantitativa de proteomas derivados de subpopulações celulares de ambos os tumores sólidos e líquidos. É necessário efectuar o enriquecimento inicial de células tumorais, quer por FACS com base nas células-sortingor microdissecação para evitar a contaminação por células do microambiente do tumor. Além disso, estas técnicas permitem isolar subpopulações celulares de interesse. Estudos com células-biológico recentes têm demôniostrated que determinadas subpopulações celulares têm propriedades de iniciação do tumor e são, portanto, altamente relevante para a patogênese do câncer 19,20. Como espectrometria de massa tornou-se mais sensível nos últimos anos, as análises proteômicas quantitativos são viáveis ​​para as pequenas quantidades de proteína que podem ser derivadas de alguns milhares de células, tornando possível para se concentrar em populações de células funcionalmente relevantes. A configuração aqui apresentado pode ser utilizado para identificar e validar novos biomarcadores de diagnóstico em amostras de FFPE. Por isso, promete bea ferramenta útil para a melhoria do diagnóstico clínico, a data ainda há uma falta de biomarcadores moleculares em número e em qualidade adequada para vários tipos de câncer. Exemplos importantes de diagnósticos diferenciais difíceis, para os quais biomarcadores estão faltando, são a discriminação entre câncer de pulmão primário de metástases no pulmão, carcinoma colangiocelular intrapancreatic e adenocarcinoma do pâncreas, assim como diferemciação de neurofibroma entre tumores benignos e de bainha de nervo periférico altamente malignas. Além disso, nós e outros demonstraram que a elucidação quantitativa de assinaturas proteomic pode ser útil no estudo da biologia celular de cancro em geral, e para revelar biomarcadores preditivos da resposta terapêutica em doentes com cancro 21. Duas desvantagens atuais do método aqui apresentado são a exigência de ampla amostra de transformação manual e a demanda de nanoLC-MS / MS tempo de aquisição. Enquanto o primeiro pode ser abordada, movendo a preparação da amostra para por exemplo, formatos de 96 poços e usando processamento robótico, este último vai exigir uma mudança na estratégia de aquisição de espectrometria de massa. Uma vez que os subconjuntos de proteínas-alvo foram identificadas, que pode estar associada com, por exemplo, classificação de tumores, prevemos a concepção de métodos de espectrometria de massa-alvo que fornecem leituras quantitativas para estes subconjuntos com um esforço bastante reduzido de separação, eportanto, com a correspondente redução do tempo de aquisição. Se o tempo de aquisição necessária requerida pode ser reduzida 24-36 hr (tumores líquidos) ou 3 h (tumores sólidos) para, por exemplo, 1 hora usando espectrometria de massa e a separação de péptidos unidimensional simples, então o ganho em rendimento resultante alvo Pode ser utilizado para aumentar significativamente o número de réplicas biológicas e técnicas examinados, com a melhoria correspondente na significância dos resultados de quantificação. Abordagens de espectrometria de massa visados ​​já foi demonstrado ser uma ferramenta adequada para a verificação de associados a cancro da proteína biomarcadores candidatos-22, e têm sido desenvolvidos para um ponto onde eles são promissores para a validação ou mesmo como uma potencial ferramenta para o uso clínico de rotina 23 , 24.

Proteômica baseada em espectrometria de massa surgiu e agora é uma disciplina amplamente utilizado em biologia celular e investigação biomédica translacional. Os avanços técnicos no campo, foi possível estudar os processos celulares complexos em linhas de células e modelos animais, como milhares de proteínas podem ser identificadas em um único experimento de espectrometria de massa 1,2. Progresso semelhante foi feita por análise de várias modificações pós-traducionais tais como a fosforilação ou ubiquitinação, embora isto geralmente requer fluxos de trabalho à medida para o enriquecimento e a análise dos dados para cada tipo de modificação 2,3. Além disso, o envolvimento das estratégias de rotulagem químicas e metabólicas, incluindo SILAC, permite a quantificação precisa relativa de proteínas e PTMs, tornando este método particularmente atraentes para a descoberta de processos celulares básicos, diagnóstico biomarcadores e alvos potenciais drogas em cancro humano 4. No entanto,vários desafios precisam ser superados em relação à análise proteômica dos cânceres humanos primários 5. Em primeiro lugar, as amostras de cancro humano apresentam frequentemente um elevado grau de heterogeneidade celular que é devido à presença de vários tipos de células que pertencem ao microambiente tumoral, incluindo células do sistema imunológico e fibroblastos. Em segundo lugar, a evolução clonal leva a diversidade genética dentro de si os tumores, resultando na existência de várias subpopulações celulares com propriedades funcionais distintas. De acordo com o conceito atual de algumas células-tronco do câncer, sendo as forças motrizes do desenvolvimento e progressão do câncer, análise proteômica dessas subpopulações celulares (funcionalmente altamente relevantes) é esperado para ser de grande importância para uma melhor compreensão dos mecanismos oncogênicos relevante para a aplicação clínica 6. Em terceiro lugar, os perfis de expressão de proteínas quantitativos de grandes conjuntos de amostras são muitas vezes necessários para a identificação de Biomar clínico fiávelkers; esta não pode ser conseguida por marcação química, tais como iTRAQ 7, enquanto que as estratégias de marcação metabólica - contando, como o fazem, com a proliferação celular 4 - não têm aplicação. Em quarto lugar, a maioria das amostras de tumores sólidos que estão disponíveis são fixados em formalina, o que complica a análise de espectrometria de massa proteoma devido à formação de ligações cruzadas de proteína 8. Por fim, a maioria dos fluxos de trabalho existentes proteômica requerem quantidades significativas de processamento de amostras e aquisição de dados, tornando a análise dos números de amostras relevantes para a investigação clínica difícil, e chamando para novo fluxo de trabalho paradigmas 9,10. Para enfrentar esses obstáculos, desenvolvemos uma montagem experimental que combina ou célula de citometria de fluxo de classificação 11 ou captura a laser microdissection 12,13 para o enriquecimento celular com uma estratégia de Super-SILAC 14 a introduzir uma norma interna global para análise por espectrometria de massa global. Ao utilizar o método aqui descrito, é possível quantificar até 8.000 proteínas em amostras de tumores humanos individuais derivadas de cancros, quer líquido ou sólido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">660 nm Kit</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:151px;">22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture medium depleted of arginine and lysine</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">88421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution</td>
			<td style="width:181px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:151px;">161-0436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialyzed fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:181px;">PAA</td>
			<td style="width:151px;">A15-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diffuser caps for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS-sorter</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">FACSAria III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ionic Detergent Compatibility Reagent</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td>22663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser-capture microdissector</td>
			<td style="width:181px;">MMI&#160;</td>
			<td style="width:151px;">cell cut plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LDS buffer&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane slides for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcon YM-30</td>
			<td style="width:181px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">MRCF0R030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0335PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Picofrit Self-Pack Columns</td>
			<td style="width:181px;">New Objective</td>
			<td style="width:151px;">PF360-75-15-N-5</td>
			<td>Mass Spectrometry Column/Emitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reducing agent</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 3 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 5 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled arginine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">CLM-2265-H-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled lysine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">DLM-2640-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, NB Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">3728301</td>
			<td>for in-gel digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">V5111</td>
			<td>for in-solution digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buffer and solutions</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF,&#160; 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.05 M NH4HCO3</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;5% aqueous formic acid.</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative mass spectrometric profiling of cancer-cell proteomes derived from liquid and solid tumors

Análises aprofundadas de proteomas de células de câncer são necessários para elucidar pathomechanisms oncogênicos, assim como para identificar alvos potenciais drogas e biomarcadores de diagnóstico. No entanto, os métodos para caracterização proteômica quantitativa de tumores derivados do paciente e em particular as suas subpopulações celulares são muito insuficientes. Aqui nós descrevemos um experimental set-up que permite a análise quantitativa de proteomas de subpopulações de células de câncer derivada de tumores líquidos ou sólidos. Isto é conseguido através da combinação de estratégias de enriquecimento celulares com espectrometria de massa baseia-Super-SILAC seguido por análise quantitativa dos dados de bioinformática. Para enriquecer subconjuntos celulares específicos, tumores líquidos são primeiro immunophenotyped por citometria de fluxo seguido de FACS-ordenação; para os tumores sólidos, por captura de laser de microdissecação é usado para purificar as subpopulações celulares específicos. Num segundo passo, as proteínas são extraídas das células purificadas e posteriormente combinados com um específico para o tumor,SILAC marcado padrão espiga em que permite a quantificação da proteína. A mistura de proteína resultante é submetido a electroforese em gel ou filtro ou Aided Preparação da Amostra (FASP) seguido por digestão tríptica. Finalmente, os péptidos trípticos são analisados ​​utilizando um espectrómetro de massa de quadrupolo-Orbitrap híbrido, e os dados obtidos são processados ​​com pacotes de software de bioinformática, incluindo MaxQuant. Por meio do fluxo de trabalho aqui apresentado, até 8000 proteínas podem ser identificados e quantificados em amostras derivadas de pacientes, e os perfis de expressão de proteínas resultantes podem ser comparados entre pacientes para identificar as assinaturas de proteómica ou de diagnóstico potenciais alvos de drogas.

Perfilamento Proteomic de tumores líquidos e sólidos a partir de pacientes é uma abordagem promissora para a descoberta de novos biomarcadores preditivos e de diagnóstico. No entanto, o procedimento de preparação da amostra e análise de espectrometria de massa são um desafio, devido à complexidade das amostras e a necessidade de quantificar a proteína preciso em grandes conjuntos de amostras. O procedimento experimental descrito acima começa com o isolamento de células de interesse, quer por escolha de células activado por fluorescência ou por captura a laser microdissecação. Para esta finalidade, as células de aspirados de medula óssea derivadas de doentes ou de amostras de sangue foram coradas com anticorpos marcados com fluorescência contra marcadores de superfície definidos de interesse antes de triagem baseada em FACS e lise celular. Para enriquecer tipos celulares a partir de cortes de tecidos, estes têm que ser primeiramente montadas em lâminas adequadas para permitir a captura a laser microdissection. Para esta finalidade t montarele secções de tecido em lâminas de membrana apropriados e utilizar uma captura por laser microdissector de acordo com as instruções do fabricante. A seleção das áreas e células de interesse requer um conhecimento adequado sobre o histomorfologia de tecido normal e neoplásico. As células extraídas são então transferidos para um tubo de recolha apropriado. As experiências iniciais deve ser realizada a fim de definir a quantidade de tecido necessário para a extracção de uma quantidade suficiente de proteína (10 pg de proteína mínima total) para cada novo tecido de interesse. Cada amostra microdissecados é tratada com 60 ul de tampão de lise do tecido. Para a lise eficiente, células de amostras de tecido têm de ser ultra-sons durante 3 minutos e após a adição de 15 ul de SDS amostras são incubadas num termomisturador a 99 ° C durante 1 h para remover as reticulações da proteína induzida por formalina. Centrifugação vai finalmente facilitar a recolha do ligado celular desmarcada. Para cada doença de interest (líquido e tumores sólidos) a Super-SILAC padrão quantificação adequada tem de ser estabelecido 14. Um padrão adequado devem representar mais de 90% das proteínas expressas nas amostras de interesse. Para a preparação de um padrão de quantificação, as linhas celulares relacionadas ao câncer de interesse deve primeiro ser analisados ​​por espectrometria de massa para determinar os seus perfis de expressão de proteínas e análise de componentes principais, posteriormente, deve ser realizada. 4 - 6 linhas celulares diferentes, com padrões de expressão diferencial da proteína deve ser escolhido e SILAC-arginina marcada com &quot;pesadas&quot; e lisina. Eficiência de marcação deve ser verificada por nanoLC-MS / MS e deve ser maior do que 98%. Em seguida, as linhas celulares deverão ser lisadas na mesma maneira como a respectiva amostra derivada de paciente e, subsequentemente, quantidades equimolares de proteína de cada amostra e o padrão espiga em SILAC deve ser misturado. Um passo crítico para a quantificação de proteína precisa de amostras clínicas of interesse é a mistura precisa de quantidades de proteína equimolares das amostras derivadas de pacientes e o SILAC spike-in padrão de quantificação. Para determinar a concentração de proteína de lisados ​​derivados de células classificadas, vários ensaios de quantificação de proteína pode ser utilizado. Para os lisados ​​celulares a partir de células derivadas de tecido é necessário um ensaio que pode lidar com altas concentrações de SDS e DTT no lisado. As concentrações de proteína das amostras derivadas de pacientes e o padrão espiga em SILAC deve ser medido antes de cada vez combinação com as respectivas amostras clínicas, a fim de assegurar a mistura correcta, que é fundamental para fazer mesmo centenas de amostras comparáveis. Depois de a mistura de quantidades iguais de digestão espiga em amostras padrão e de lisado, obtidos a partir de tumores líquidos são misturados com LDS, aquecidas num termomisturador a 72 ° C durante 10 min e, subsequentemente, submetidas a 1D-PAGE e em gel do separadas proteínas com tripsina. As amostras obtidas a partir detecidos são liberados a partir de SDS e digeridas com tripsina usando a abordagem FASP, conforme estabelecido pela Wisniewski et al. 15 Os péptidos trípticos obtidos podem ser quantificados por medição da fluorescência de triptofano, que é de interesse especial para amostras de tecidos como a quantidade de péptidos libertados do filtro difere entre 15% e 75% em comparação com as quantidades de proteína inicialmente carregados no filtro. Para este efeito, podemos medir a fluorescência do triptofano. A comparação com uma série de diluições de triptofano apropriado permite a quantificação dos peptídeos, como 1,1 ug de triptofano corresponde a cerca de 100 ug de péptido. Se necessário, as amostras derivadas de processamento especialmente FASP pode ser pré-purificado em qualquer estágio dicas comerciais ou caseiros embalados com (RP-C18) de material de fase inversa C18 antes de o colocar no sistema nanoLC / MS / MS 18. A análise por espectrometria de massa é realizada num elevado-Resolução, sistema de espectrometria de massa de alta sensibilidade. Em resumo, as amostras de péptidos são dessalinizados e preconcentrados sobre uma pré-coluna RP-C18, e separado numa coluna analítica RP-C18 acoplado directamente ao espectrómetro de massa. Para atingir profundidade suficiente de análise, que empregam ou uma combinação de SDS-PAGE prefraccionamento proteína com 40 min gradientes RP-C18 (para tumores líquidos) ou injeções individuais com longas 2-3 hr gradientes RP-C18 (para tumores sólidos tratados pela FASP ). MS espectros foram adquiridos com resolução de 70.000 FWHM ou melhor, para permitir a quantificação precisa de pares SILAC por integração dos picos de perfis cromatográficos. Para a identificação de proteínas, um método de aquisição dependente dos dados Top15 é usado para gerar um grande número de péptido espectros MS / MS para a identificação de proteínas e de péptidos. A partir dos dados brutos resultantes, identificação e quantificação de proteínas são alcançados pelo sistema de dados com o software de procura MaxQuant contra um UniProt Knowledgebase banco de dados Human Proteome seqüência completa 17 anos. Em MaxQuant software (versão actual 1.5.0.25) são péptidos identificados a partir da adquirida espectro MS / MS pelo seu fragmento de péptido correspondente contra espectros in silico derivado da base de dados de sequência de proteína. Ao mesmo tempo, um precursor de ião perfis isotópicos são extraídos em torno dos seus tempos de retenção cromatográficos, e as suas áreas de pico integradas são utilizados para a quantificação relativa da luz: pares de péptidos pesados ​​gerados por meio de rotulagem SILAC. Identidades de péptidos e as intensidades relativas são então atribuídos às propriedades correspondentes de proteína. Software Perseus (atual versão 1.5.0.15) é então usado para realizar uma avaliação mais aprofundada estatística jusante dos resultados do processamento MaxQuant, incluindo amostra-a-amostra comparações, PCA e de agrupamento hierárquico. Utilizando a montagem experimental descrita nós identificaram e quantificaram-se a 8.000 proteínas de tão pouco como 30 ug de proteína totalderivadas de tumores líquidos. Até 2500 proteínas a partir de amostras de tumores sólidos podem ser identificados e quantificados numa abordagem proteómica espingarda com um gradiente de LC de apenas 2 horas, permitindo a análise de centenas de amostras clínicas de um tempo relativamente curto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig1highres.jpg" /> Figura 1. fluxo de trabalho Experimental. As principais etapas de enriquecimento celular-subconjunto, isolamento de proteínas, spike-in do padrão de quantificação e análise por espectrometria de massa são mostrados para os tumores sólidos e líquidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig2highres.jpg" /> Figura 2. Cellular strategi enriquecimentoes. FACS triagem e LCM. (A) a estratégia gating Exemplar retratando gating em uma população de células leucêmicas manchada de CD117 adquirida por um separador de células. (B) microdissection captura Laser de tecido do tumor sólido. As secções de tecido de 5 - 10 mm de espessura foram montadas em lâminas de membrana coberta por película antes da coloração. Região de interesses foi selecionado manualmente para captura a laser microdissection. São mostrados seções antes microdissection com a região de interesse marcado amarelo e depois microdissection. A barra de escala de 50 mm está incluído na figura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig3highres.jpg" /> Figura 3. A análise de agrupamento de proteomas de células humanas de câncer. Análise de agrupamento não supervisionado de prperfis de expressão otein de tumores sólidos e líquidos foi realizada utilizando a plataforma computacional Perseus. AC - Adenocarcinoma, SCC - carcinoma de células escamosas, SCC-Met - metástases carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, R - replicar técnico.

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Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Quantitative Mass Spectrometric Profiling de proteomas de células do cancro da derivadas do líquido e tumores sólidos

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

quantitative-mass-spectrometric-profiling-cancer-cell-proteomes

Research

JoVE Journal

Medicine

16.0K visualizações.  University Medical Center, Göttingen. In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Vídeo: Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

Mapeamento de heterogeneidade de expressão da proteína em tumores usando imunofluorescência Quantitative

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Medicina

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Análise quantitativa de proteomas cromatina na Doença

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

Identificação de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Inserções de transposões em tumores sólidos utilizando Linker mediada por PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Método para obtenção de células do cancro do ovário primárias de amostras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.