Esse modelo permitirá que os pesquisadores nos estágios pré-clínicos críticos determinem com mais precisão a eficácia antimicrobiana de novas formulações e dê aos pesquisadores maior controle sobre o design e a formulação de medicamentos. Este modelo permite resultados reprodutíveis rápidos em um ambiente de ferida representativo. Reduz a necessidade de animais criados especificamente e facilita a tradução mais rápida de antimicrobianos tópicos para infecções de feridas para a clínica.
Os principais desafios são a contaminação e a destreza. Uma técnica asséptica rigorosa e paciência com o processamento de tecidos são essenciais; a remoção precisa e proposital do retalho é necessária para o sucesso deste método. Comece com a desinfecção do fórceps, expondo-os à esterilização por calor seco a 200 graus Celsius por uma hora.
Autoclave todos os artigos de vidro a 121 graus Celsius por 15 minutos antes do uso. Desinfete a secção da testa da lâmpada derramando aproximadamente 100 mililitros de solução de dióxido de cloro de 200 PPM na área da amostra. Raspe a seção da testa usando cortadores elétricos, seguido de uma lavagem com 200 mililitros de solução de dióxido de cloro de 200 PPM.
Limpe a área usando etanol e um rolo azul e cubra a área da amostra com creme de depilação. Após 35 minutos, raspe suavemente o creme de depilação usando uma ferramenta de raspagem e avalie a área da amostra. Repita o processo de depilação se uma quantidade significativa de pelos permanecer.
Enxaguar a área de amostra limpa com 200 mililitros de solução de dióxido de cloro seguida de etanol e um rolo azul. Use um soco de biópsia estéril de oito milímetros para cortar uma amostra de pele de oito milímetros da área preparada. Em seguida, remova a amostra usando pinça estéril e bisturi de lâmina número 15, garantindo que toda a gordura cutânea seja removida.
Coloque as amostras em um frasco estéril de 0,5 litro cheio de PBS estéril. Em seguida, transfira-os para tubos estéreis de 50 mililitros cheios de 50 mililitros de solução de dióxido de cloro de 200 PPM. Inverta o tubo duas vezes e deixe-o esterilizar por 30 minutos.
Transfira as amostras para um tubo de 50 mililitros preenchido com 40 mililitros de PBS estéril. Após a lavagem do PBS, coloque cada amostra de pele em um poço separado de uma placa de 24 poços. Adicione 350 microlitros do meio pré-aquecido em um poço, mantendo a amostra na interface ar-líquido.
Sele as placas de 24 poços com uma vedação de placa permeável a gás antes de colocar a placa para incubação em uma incubadora de tecido umidificado a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, retirar o meio de cultura e enxaguar as amostras em 500 microlitros de PBS estéril. Remova os antibióticos residuais da amostra, tratando-os com meios livres de antibióticos a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 24 horas.
Se a turbidez ou infecção fúngica se desenvolver no meio livre de antibióticos, descarte a amostra. Em seguida, prepare um tubo de 50 mililitros com 10 mililitros de caldo de soja tríptico estéril. Em seguida, transfira várias colônias de Staphylococcus aureus de uma placa de ágar fresco de S.aureus para o caldo e incube o tubo a 37 graus Celsius e 150 RPM por 18 horas.
Depois de centrifugar os tubos a 4.000 G por três minutos, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de PBS estéril. Repita a lavagem PBS duas vezes antes de ajustar o inóculo para a densidade óptica de 0,6 a comprimentos de onda de 600 nanômetros usando PBS estéril. Confirme a carga de inóculo por uma contagem manual de placas viáveis.
Para infectar a amostra de pele, prepare uma placa fresca de 24 poços com 400 microlitros de meio livre de antibióticos pré-aquecidos e adicione as inserções de 24 poços usando pinça estéril. Remova a mídia das amostras de pele. Lave-os com 500 microlitros de PBS estéril e remova a lavagem.
Use pinças estéreis para segurar suavemente a amostra no fundo do poço. Use uma biópsia de punção de quatro milímetros para perfurar a amostra de pele a uma profundidade aproximada de um a dois milímetros e fazer um retalho central da ferida. Em seguida, use um bisturi de lâmina número 15 e pinças de tecido Allis de dentes estéreis para remover a camada superior do retalho da ferida.
Uma vez que todas as amostras tenham sido feridas, transfira-as para as 24 inserções de poço usando pinça estéril. Pipetar 15 microlitros do inóculo bacteriano para o leito da ferida antes de incubar por 24 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de tecido umidificada. Para períodos de incubação mais longos, remova o meio, substitua-o por um meio fresco a cada 24 horas e incube as placas nas mesmas condições.
Para determinar a carga bacteriana, remova o meio do fundo dos poços. E usando pinça estéril, transfira cada amostra para um tubo separado de 50 mililitros preenchido com um mililitro de PBS estéril. Em seguida, retire as bactérias da superfície do leito da ferida homogeneizando a superfície da amostra com um homogeneizador de ponta fina.
Certifique-se de que o leito da ferida esteja em contato direto com a ponta do homogeneizador. Uma vez que todas as amostras são processadas, vórtice cada amostra antes de transferir 20 microlitros de homogeneizado para o poço correspondente de uma placa de 96 poços contendo 180 microlitros de PBS estéril. Diluir serialmente cada homogeneizado da amostra para 1 vezes 10 para o negativo 7, e pipetar 10 microlitros do homogeneizado diluído para uma placa de ágar de soja tríptica em triplicado.
Incubar a placa de ágar de soja tríptica a 37 graus Celsius e, após 18 horas, contar o número de colônias para determinar as unidades formadoras de colônias ou UFC para cada amostra. Um regime apropriado de esterilização da pele foi identificado usando diferentes tratamentos por diferentes períodos de tempo. A integridade tecidual foi monitorada por histologia, seguida de coloração com hematoxilina e eosina imediatamente após o tratamento.
Um tratamento de 30 minutos com dióxido de cloro foi o tratamento mais eficaz, com esterilização reprodutível do tecido cutâneo, preservando a integridade tecidual. Um filme branco no leito da ferida foi evidente no tecido 48 horas após a infecção. Embora o modelo de arranhões tenha abrigado um maior número médio de UFCs após 24 horas, a técnica de retirada do retalho produziu resultados mais consistentes.
Após 48 horas, aproximadamente 100 vezes mais UFCs bacterianas foram recuperadas do tecido ferido em comparação com o inóculo, indicando uma infecção bem-sucedida. Seções histológicas coradas de Gram do tecido infectado indicaram a presença de células de S.aureus no leito da ferida, que estava ausente nas seções de tecido não infectado. Após este procedimento, pode-se realizar imuno-histoquímica para estudar a resposta tecidual, coloração de grama modificada para visualizar a localização bacteriana e contagens de placas viáveis após a exposição antimicrobiana para testar a eficácia antimicrobiana.
Para os pesquisadores que desenvolvem novos antimicrobianos, esse modelo proporcionará maior controle da otimização do chumbo, reduzirá a dependência de testes em animais caros e rigidamente regulamentados e permitirá a rápida tradução de antimicrobianos para a clínica.
