Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de reparação e regeneração de tecidos sobre as associações entre as vias citoprotetores, o estresse oxidativo e a resposta de cicatrização da ferida. A principal vantagem desta poderosa técnica é que você pode medir espécies reativas de oxigênio em uma ferida, em tempo real, para determinar seu impacto na regeneração tecidual. Demonstrando o procedimento comigo estará Jennifer Kwong, uma assistente de pesquisa no meu laboratório.
Use um glucometer para medir a glicemia de cada camundongo diabético anesthetizado de oito a 12 semanas. E use um aparador de cabelo e creme depilatório para remover o cabelo dorsal do primeiro animal. Use lenços álicos duas vezes para limpar a pele exposta e cobrir o animal para que apenas a área cirúrgica seja exposta.
Quando o álcool secar, use socos de biópsia estéril de 10 milímetros para criar duas feridas de espessura total de 10 milímetros que se estendem através do carnosus panniculus de acordo com uma técnica bem estabelecida de cicatrização de feridas excisionais. Use uma folha de silicone de 0,5 milímetros de espessura com recortes circulares de 10 milímetros para abrir as feridas e fixar os stints com suturas de seda interrompidas 4/0. Em seguida, coloque os ratos em uma almofada de calor com monitoramento até a recuperação completa, antes de retornar à sua gaiola individual, fornecendo toalhas de papel como material adicional de aninhamento por duas semanas.
No dia seguinte, aplique o controle absurdo de gel RNA interferindo ou um pequeno gel Keap1 experimental interferindo no topo da ferida de cada animal e enrole cada torso com curativo de filme transparente para manter o gel no lugar enquanto deixa os membros livres. No terceiro dia do experimento, carregue uma seringa de um milímetro equipada com uma agulha de calibre 27 com solução L-012 recém-preparada e enrole a seringa para proteger a solução da luz. Para imaginar as feridas, remova suavemente o curativo transparente de cada um dos ratos sem perturbar as feridas e coloque os ratos na câmara de imagem de um sistema de imagem de bioluminescência.
Defina o fluxo do sistema de imagem e os níveis de oxigênio da câmara de indução para um litro por minuto e imagem dos ratos por bioluminescência e campo brilhante na linha de base. Em seguida, limpe os abdômens com lenços umedecidos e injete cinco miligramas de solução L-012 por 200 gramas de peso corporal, IP, em cada rato uma vez que o álcool secou. Injetar a solução L-012 sem perturbar as feridas na pele dorsal é fundamental, pois qualquer distorção afetará a trajetória de cicatrização da ferida e a interpretação dos dados.
Certifique-se de que o animal está seguro em recumbência dorsal antes da injeção. Imediatamente após a injeção, coloque os camundongos de volta em seus respectivos locais na câmara de imagem e imagem dos animais por um minuto a cada quatro minutos durante um período de imagem de 60 minutos, definindo a ferida de 10 milímetros como a região de interesse para determinar o nível de espécies reativas de oxigênio. Em seguida, coloque os ratos em uma almofada de calor com monitoramento até a recuperação completa antes de devolver os animais para suas gaiolas individuais.
Três dias após a criação de feridas bilaterais de acordo com o modelo de ferida excisional estabelecida, nenhuma bioluminescência é observada antes da injeção de L-012. Após a injeção intraperintoneal da solução L-012, a bioluminescência é observada nas áreas da ferida onde espécies de oxigênio reativa são detectadas. O registro da bioluminescência por um minuto a cada quatro ou cinco minutos ao longo de 60 minutos demonstra a saturação bioluminescente da região de interesse ao longo do tempo, com o tempo ideal de imagem para alcançar a saturação L-012 completa observada em cerca de 50 minutos.
A bioluminescência em cada região de interesse de ferida antes e depois da injeção de L-012 em pequenos RNAs interferentes ou camundongos tratados com RNA interferentes keap1 podem então ser calculados dividindo as contagens totais de intensidade de luz pela área. A análise das seções de tecido silvestre do dia 10 para confirmar a precisão da medição do nível de nível de espécies de oxigênio reativos pela coloração de H&E revela uma redução da infiltração celular em pequenas feridas tratadas keap1 interferindo em comparação com pequenos tecidos tratados sem sentido interferindo, indicando uma morfologia inflamatória reduzida nos animais experimentalmente tratados com gel. A análise da imuno-reatividade de F4/80, um marcador de macrófago proteico em seções de tecido silvestre, indica um número reduzido de macrófagos em pequenas feridas tratadas keap1 interferentes em comparação com pequenas feridas tratadas sem sentido interferindo, ressaltando ainda mais a validade deste método.
Ao tentar este procedimento, certifique-se de confirmar que o L-012 não está expirado e agitar a solução em um lugar protegido contra a luz. Após este procedimento, sondas direcionadas e métodos baseados em imuno-ensaio podem ser usados para estudar a localização subcelular de espécies reativas de oxigênio e seus correlatos, permitindo uma rápida avaliação das intervenções e mecanismos que afetam as estatísticas redux das feridas.
