O campo de pesquisa shigella atualmente carece de ensaios bem definidos para examinar o papel funcional dos anticorpos gerados pela imunização ou infecção. Este ensaio representa um método bem definido para qualificar essas respostas imunológicas e medir a atividade bactericida de anticorpos específicos shigella. A principal vantagem deste ensaio é que ele permite uma análise de alto rendimento de múltiplas amostras.
As técnicas utilizadas neste protocolo reduzem consideravelmente o tempo prático e o tempo geral de ensaio para medir a matança bacteriana direta de anticorpos e amostras de soro. Para começar, incubar as amostras em um banho de água morna a 56 graus celsius por 30 minutos para aquecer e ativar as amostras de teste. Obtenha uma placa de ensaio e 20 microliters de tampão de ensaio para colunas de uma a doze linhas A a G.Adicione 20 microliters de tampão de ensaio às colunas um e dois de microliters H.Load 30 de cada amostra de ensaio e duplicar para a linha H da placa de ensaio.
Para começar a realizar diluições seriais triplas das amostras de teste, use uma pipeta multicanal para remover 10 microliters dos poços 3H a 12H. Transfira as amostras para os poços correspondentes na linha G e pipeta para cima e para baixo 8 a 10 vezes para misturar bem a amostra. Em seguida, remova 10 microliters desses poços.
Transfira para os poços correspondentes na linha F e pipeta para cima e para baixo 8 a 10 vezes para misturar. Continue este processo de diluição serial através da linha A.Depois de misturar os poços na linha A, remova e descarte 10 microliters dos poços 3A a 12A para que o volume final em todos os poços seja de 20 microliters. Recupere um frasco de caldo bacteriano alvo congelado e descongele-o à temperatura ambiente.
Em seguida, diluir as bactérias em 20 mililitros de tampão de ensaio. de acordo com o fator de diluição ideal predeterminado. Usando uma pipeta multicanal, adicione 10 microliters de bactérias diluídas a cada poço da placa de ensaio.
Recupere um frasco de Baby Rabbit Compliment congelado e um frasco de calor congelado ativado BRC. Use água corrente fria para descongelar os frascos à temperatura ambiente. Em seguida, misture 100 microliters de BRC ativados por calor com 400 microliters de tampão de ensaio.
Adicione 50 microliters desta solução BRC ativada por calor de 20% para todos os poços na primeira coluna. Misture um mililitro de BRC nativo com quatro mililitros de tampão de ensaio. Adicione 50 microliters desta mistura de 20% a todos os poços nas colunas de dois a doze.
Coloque a placa um shaker de placa por 10 a 15 segundos para misturar suavemente a placa de ensaio. Incubar a placa de ensaio em uma incubadora microbiológica por duas horas. Enquanto isso, retire as tampas das duas placas de Ágar LB e coloque as placas de frente para cima em um armário de segurança biológica por 40 a 60 minutos para secar.
Quando a incubação estiver completa, transfira a placa de ensaio para o gelo molhado e incubar por 10 a 20 minutos para parar a reação. Usando uma pipeta de doze canais, misture os poços na linha H e a placa spot 10 microliters da mistura de reação na parte inferior de uma placa LBA. Incline imediatamente a placa e deixe as manchas funcionarem por cerca de 1,5 a 2 centímetros.
Repita este procedimento para as linhas G, F e E, detectando-as acima da linha anterior. Incubar as placas LBA à temperatura ambiente até que a solução seja absorvida nas placas LBA. Em seguida, coloque as tampas nas placas e transfira-as de cabeça para baixo em uma incubadora microbiológica para incubar durante a noite.
No dia seguinte, adicione 25 mililitros de sobreposição Agar a 55 graus celsius, contendo 100 microgramas por mililitro TTC e 0,1% de azida de sódio a cada placa LBA. Incubar a 37 graus celsius por duas horas para permitir que as bactérias sobreviventes desenvolvam uma cor vermelha. Em seguida, use uma câmera digital para fotografar as placas.
Transfira as imagens para um computador e use o software Enumerating da Colônia Integrada da NIST para analisar as imagens conforme descrito no protocolo de texto. As placas representativas da LBA demonstram que o desenvolvimento de cores ocorreu após a adição de incubação e sobreposição durante a noite, com todas as colônias sobreviventes sendo visíveis em vermelho. A matança bacteriana é claramente vista para todas as amostras testadas nas três primeiras diluições.
Uma diminuição na matança bacteriana é vista à medida que as amostras são diluídas mais acima da placa e o soro é menos concentrado. As contagens de microcolonia são então realizadas usando o software NIST. A contagem média de UFC para cada diluição de cada amostra é então calculada, assim como o valor de morte de 50%.
Este valor de morte de 50% é então aplicado às CFUs médias para cada diluição de soro para determinar os valores necessários para calcular o SBA KI. Este protocolo conta com revestimento bacteriano consistente e uniforme em LB Auger. Uma boa técnica de revestimento e inclinação permitirá o crescimento de microcolônias discretas e contagem precisa de colônias. Esta técnica usa Shigella virulento ao vivo e requer técnica asséptica apropriada e EPI para garantir que as bactérias sejam tratadas com segurança de acordo com os procedimentos bsl 2.
