Este trabalho foi apoiado pela iniciativa InnoHK e pelo Governo da Região Administrativa Especial de Hong Kong; Centro de Pesquisa em Visão SHARP; e o Centro de Pesquisa para Inovação em Medicina Chinesa (RCMI) da Universidade Politécnica de Hong Kong.

Os indivíduos assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes da participação no estudo. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana da Universidade Politécnica de Hong Kong e aderiu aos princípios da Declaração de Helsinque.
1. Coleta de fluido lacrimal humano com tira de Schirmer
<ol><li>Use luvas e higienize para evitar a contaminação da amostra.</li>
	<li>Verifique se a embalagem interna está intacta, estéril e não expirou.</li>
	<li>Dobre ligeiramente o topo da tira de Schirmer para dentro na marca de 0 mm, conforme indicado próximo à ponta do semicírculo da tira (Figura 1).</li>
	<li>Retire a tira da embalagem interna segurando a extremidade da tira e evite o contato direto com a área de coleta da amostra de 0 a 25 mm.</li>
	<li>Peça ao sujeito que olhe para longe da posição da tira a ser colocada.</li>
	<li>Puxe a pálpebra inferior suavemente para baixo e prenda a extremidade da tira no fórnice inferior, próximo à região lateral do canto (Figura 2). Repita o mesmo procedimento no outro olho.</li>
	<li>Peça ao sujeito que feche suavemente as pálpebras para minimizar a irritação.</li>
	<li>Coletou-se líquido lacrimal por cerca de 5 min ou, preferencialmente, amostra lacrimal de 15-20 mm.</li>
	<li>Peça ao sujeito para abrir os dois olhos, puxar a pálpebra inferior suavemente e retirar as tiras do sujeito.</li>
	<li>Inspecionar o comprimento hidratado na tira de Schirmer e registrar a quantidade coletada em mm.</li>
	<li>Seque a tira com um aquecedor de estrutura padrão e limpo até que o fluido esteja completamente seco. NOTA: O aquecimento excessivo que poderia potencialmente carbonizar o papel de filtro deve ser evitado.</li>
	<li>Insira cada tira de Schirmer seca em um criotubo rotulado e guarde-a preferencialmente em um local fresco e seco no escuro até processamento posterior.</li>
</ol>2. Preparação de produtos químicos e reagentes
<ol><li>Tampão de lise (5% SDS, 50 mM TEAB, pH 7,5), 20 mL<ol><li>Pipetar 1 mL de TEAB 1 M e 80 μL de ácido fosfórico a 12%. Vórtice e sonicate brevemente para remover bolhas. Completar até 20 mL com água deionizada.</li>
		<li>Pesar 1 g de SDS e adicionar à solução com oscilação até dissolver.</li>
	</ol></li>
	<li>Tampão de precipitação proteico (metanol 90%, TEAB 100 mM, pH 7,1), 10 mL<ol><li>Adicionar 893 μL de TEAB 1 M e 92 μL de água deionizada.</li>
		<li>Adicionar 15 μL de ácido fosfórico a 85% em peso e 9 ml de metanol à solução e vórtice brevemente.</li>
	</ol></li>
	<li>Tampão de digestão (50 mM TEAB), 1 mL<ol><li>Adicionar 50 μL de TEAB 1 M e completar até 1 mL com água deionizada.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de ditiotreitol (TDT) a 200 mM, 500 μL<ol><li>Pesar 15 mg de TDT e dissolver em 500 μL de água deionizada; vórtice brevemente. NOTA: Preparar antes de usar.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de iodoacetamida (IAA) 400 mM, 200 μL<ol><li>Pesar 15 mg de IAA e dissolver em 200 μL de água deionizada; vórtice brevemente. NOTA: Prepare antes de usar e evite a luz.</li>
	</ol></li>
	<li>ácido fórmico a 0,2%, acetonitrila a 50%, 10 mL<ol><li>Preparar 10 mL de acetonitrila a 50% em água deionizada.</li>
		<li>Adicionar brevemente 20 μL de ácido fórmico e vórtice.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de ácido fórmico a 0,2%, 10 mL<ol><li>Adicionar 20 μL de ácido fórmico a 10 mL de água deionizada e vórtice brevemente.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de ácido fórmico a 0,1%, 10 mL<ol><li>Adicionar 10 μL de ácido fórmico a 10 mL de água deionizada; vórtice brevemente.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Extração de proteínas em tiras de Schirmer
<ol><li>Cortar e descartar a extremidade frontal além da marca de 0 mm da tira para remover a contaminação potencial devido ao contato dos tecidos conjuntivais com tesouras limpas de aço inoxidável.</li>
	<li>Cortar a tira em intervalos de 1 mm em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (Figura 3).</li>
	<li>Adicionar 100 μL de tampão de lise ao tubo da microcentrífuga e vórtice a 1.000 rpm, temperatura ambiente por 1 h em um termomisturador.</li>
	<li>Centrifugar brevemente e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Mova as tiras para as pontas da pipeta de 200 μL usando pinças limpas. Colocar as pontas no mesmo tubo a partir do passo 3.4 com suporte e centrifugar à temperatura ambiente a 4.000 × g durante mais 1 minuto para a máxima recuperação da amostra restante na tira.</li>
	<li>Medir a concentração de proteínas usando ácido bicinconínico (BCA) ou ensaio proteico compatível.</li>
</ol>4. Preparação da amostra com armadilhagem em suspensão
<ol><li>Normalizar as amostras para 50 μg de proteína com base no resultado do ensaio proteico.</li>
	<li>Adicionar 200 mM de TDT numa proporção de 1:10 (v/v, TDT: amostra) a uma concentração final de 20 mM de TDT e incubar a 95 °C durante 10 minutos.</li>
	<li>Arrefecer a solução proteica até à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicionar 400 mM de IAA numa proporção de 1:10 (v/v, IAA: amostra) para uma concentração final de 40 mM de IAA e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
	<li>Adicionar 12% de ácido fosfórico aquoso numa proporção de 1:10 (v/v, ácido: amostra) para uma concentração final de 1,2% de ácido fosfórico e vórtice brevemente.</li>
	<li>Adicione tampão de ligação às proteínas numa proporção de 1:6 (v/v, amostra: tampão) e vórtice brevemente. NOTA: Nesta etapa, a partícula de proteína coloidal deve ser formada, e a solução aparecerá translúcida se a quantidade de proteína for suficiente.</li>
	<li>Desencape a Micro Coluna de Rotação de Aprisionamento de Suspensão e monte a coluna de spin em um tubo de microcentrífuga de 2 mL para coletar o fluxo.</li>
	<li>Adicionar até 200 μL de mistura de lisado proteico acidificado na coluna.</li>
	<li>Centrifugar a coluna a 4.000 × g por 20 s. Particulados proteicos foram aprisionados; Repita até que as amostras sejam carregadas na coluna.</li>
	<li>Adicionar 150 μL de tampão de ligação às proteínas e centrifugar a 4.000 × g por 20 s para lavar a proteína em suspensão. Repita 3x.</li>
	<li>Monte a Microcoluna de Aprisionamento de Suspensão em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicionar 20 μL de tampão de digestão TEAB 50mM contendo protease na proporção de 1:25 (p/p, tripsina: proteína) no filtro dentro da coluna de spin, evitando bolhas e espaço de ar entre o filtro e a solução de digestão.</li>
	<li>Tampe a Coluna Micro de Rotação de Aprisionamento de Suspensão para evitar a evaporação. Incubar a 47 °C durante 1 h num misturador; Não agite ou vomite durante a digestão.</li>
	<li>Peptídeos eluídos com 40 μL de TEAB 50 mM por força centrífuga a 4.000 × g por 20 s.</li>
	<li>Adicionar 40 μL de AG a 0,2% e centrifugar a 4.000 × g por 20 s.</li>
	<li>Adicionar 35 μL de AG a 0,2%, acetonitrila a 50% e centrifugar a 4.000 × g por 20 s.</li>
	<li>Piscina três eluados e seque com uma centrífuga a vácuo.</li>
	<li>Conservar a -80 °C congelador a temperatura ultrabaixa até nova análise. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>5. Reconstituir peptídeos para análise por espectrometria de massa
<ol><li>Reconstituir a amostra com 12 μL de AG 0,1%, vórtice e centrífuga brevemente.</li>
	<li>Meça a concentração de peptídeos com um Kit de Ensaio de Peptídeos.</li>
	<li>Normalizar a concentração de peptídeo para 0,5 μg/μL em AG a 0,1%.</li>
	<li>Transfira a mistura peptídica para um frasco de amostra automática e esteja pronta para análise por espectrometria de massa.</li>
</ol>6. Aquisição de Amostras por Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massas em Tandem
<ol><li>Carregar 3 μg do peptídeo com tampão de carga isocrático (0,1% AG, 5% ACN) em uma coluna armadilha (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) a uma taxa de fluxo de 2 μL/min por 15 min.</li>
	<li>Fracionar os peptídeos usando uma coluna nanoanalítica de fase reversa (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) a uma taxa de fluxo de 350 nL/min em um gradiente de separação de 155 min. Use a fase móvel A compreendendo uma mistura de 0,1% de ácido fórmico (v/v), 5% de ACN (v/v) em água e a fase móvel B contendo 0,1% de AG (v/v), 98% de ACN (v/v) em água. Use o seguinte gradiente: 0-0,5 min: 5% B, 0,5-90 min: 10% B, 90-120 min: 20% B, 120-130 min: 28% B, 130-135 min: 45% B, 135-141 min: 80% B, 141-155 min: 5% B.</li>
	<li>Execute a aquisição dependente de dados (DDA) com uma faixa de varredura TOF-MS entre 350 a 1800 m/z com um tempo de acumulação de 250 ms e um tempo de exclusão de alvo dinâmico de 18 s. Em seguida, execute uma varredura MS/MS a 100 a 1.800 m/z no modo de alta sensibilidade com um tempo de acumulação de 50 ms para os 50 principais precursores por ciclo com um limite de 125 cps para o sinal MS/MS com um estado de carga de +2 a +4.</li>
	<li>Analise dados brutos com o software referenciado ou outros mecanismos compatíveis com um banco de dados de referência no FASTA a partir do banco de dados UniProt acessível publicamente.</li>
</ol>

Descoberta de biomarcadores não invasivos para proteômica lacrimal usando LC-MS

<ol>
	<li>Ma, J. Y. W., Sze, Y. H., Bian, J. F., Lam, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+mass+spectrometry+proteomics+in+tear+biomarker+discovery+for+multifactorial+ocular+diseases+(Review).">Critical role of mass spectrometry proteomics in tear biomarker discovery for multifactorial ocular diseases (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (5), 83 (2021).</li><li>Tse, J. S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+clinical+data+and+tear+proteomics+to+assess+efficacy,+ocular+surface+status,+and+biomarker+response+after+orthokeratology+lens+wear.">Integrating clinical data and tear proteomics to assess efficacy, ocular surface status, and biomarker response after orthokeratology lens wear.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 10 (11), 18 (2021).</li><li>Cheung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tear+proteome+dataset+in+response+to+daily+wear+of+water+gradient+contact+lens+using+SWATH-MS+approach.">Human tear proteome dataset in response to daily wear of water gradient contact lens using SWATH-MS approach.</a> Data in Brief. 36, 107120 (2021).</li><li>Tse, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+on+assessment+of+safety+and+tear+proteome+change+in+response+to+orthokeratology+lens+-+Insight+from+integrating+clinical+data+and+next+generation+proteomics.">Data on assessment of safety and tear proteome change in response to orthokeratology lens - Insight from integrating clinical data and next generation proteomics.</a> Data in Brief. 29, 105186 (2020).</li><li>Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+analysis+of+human+tear+fluid+biomarkers+specific+for+ocular+and+systemic+diseases+in+the+context+of+3P+medicine.">Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3P medicine.</a> The EPMA Journal. 12 (4), 449-475 (2021).</li><li>Ponzini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+tear+proteomics+for+noninvasive+biomarker+discovery.">Mass spectrometry-based tear proteomics for noninvasive biomarker discovery.</a> Mass Spectrometry Reviews. 41 (5), 842-860 (2022).</li><li>HaileMariam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Trap,+an+ultrafast+sample-preparation+approach+for+shotgun+proteomics.">S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).</li><li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+proteomics:+evaluation+of+different+sample+preparation+workflows+for+quantitative,+reproducible,+and+improved+depth+of+analysis.">Urine proteomics: evaluation of different sample preparation workflows for quantitative, reproducible, and improved depth of analysis.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).</li><li>Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in-solution,+FASP,+and+S-Trap+based+digestion+methods+for+bottom-up+proteomic+studies.">Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).</li><li>Sze, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pH+reversed-phase+fractionated+neural+retina+proteome+of+normal+growing+C57BL/6+mouse.">High-pH reversed-phase fractionated neural retina proteome of normal growing C57BL/6 mouse.</a> Scientific Data. 8 (1), 27 (2021).</li><li>Marchione, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYPERsol:+High-quality+data+from+archival+FFPE+tissue+for+clinical+proteomics.">HYPERsol: High-quality data from archival FFPE tissue for clinical proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 19 (2), 973-983 (2020).</li><li>Chhuon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+S-Trap-based+approach+to+the+analysis+of+T+cell+lipid+raft+proteome.">A sensitive S-Trap-based approach to the analysis of T cell lipid raft proteome.</a> Journal of Lipid Research. 61 (11), 1512-1523 (2020).</li><li>Hayoun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+fast+proteotyping+of+microorganisms+by+tandem+mass+spectrometry.">Evaluation of sample preparation methods for fast proteotyping of microorganisms by tandem mass spectrometry.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1985 (2019).</li><li>Templeton, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SPEED,+S-Trap,+and+in-solution-based+sample+preparation+methods+for+mass+spectrometry+in+kidney+tissue+and+plasma.">Comparison of SPEED, S-Trap, and in-solution-based sample preparation methods for mass spectrometry in kidney tissue and plasma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6290 (2023).</li><li>Ding, Z., Wang, N., Ji, N., Chen, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+technologies+for+cancer+liquid+biopsies.">Proteomics technologies for cancer liquid biopsies.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 53 (2022).</li><li>N&#228;ttinen, J., Aapola, U., Jylh&#228;, A., Vaajanen, A., Uusitalo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+capillary+and+Schirmer+strip+tear+fluid+sampling+methods+using+SWATH-MS+proteomics+approach.">Comparison of capillary and Schirmer strip tear fluid sampling methods using SWATH-MS proteomics approach.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 9 (3), 16 (2020).</li><li>Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+biomarkers+in+tear+fluid:+from+sampling+to+preanalytical+processing.">Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing.</a> Scientific Reports. 11 (1), 10064 (2021).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Para obter resultados precisos usando este método, luvas descartáveis sem energia devem ser usadas em todos os procedimentos desde a coleta da amostra lacrimal para evitar a contaminação da amostra. É importante evitar bolhas e lacunas de ar entre o filtro e a solução da amostra em cada etapa, utilizando microcolunas giratórias. Se o volume da amostra for maior que a capacidade das colunas, recomenda-se repetir o processo. Este protocolo provou ser mais eficiente do que o protocolo tradicional em solução em termos de tempo de preparação, recuperação de proteína e identificação de proteína total. Isso ocorre em grande parte porque as amostras passam pela maioria dos procedimentos necessários na mesma coluna, ao contrário do método em solução, que envolve várias etapas de transferência, como precipitação de acetona, digestão e limpeza (dessalinização), o que aumenta a probabilidade de variações nos dados resultantes.
Além das amostras lacrimais coletadas pelo método microcapilar16,17, esse fluxo de trabalho FASP com microcoluna de aprisionamento de suspensão fornece um método alternativo de preparação de amostras que permite a preparação rápida e robusta de amostras lacrimais coletadas com tiras de Schirmer, com preparação mínima do material e etapas fáceis de serem seguidas. Isso permite a preparação reprodutível de amostras lacrimais para grandes estudos de coorte em várias doenças oculares ou condições com melhor recuperação de peptídeos e identificação de proteínas pela EM em procedimentos em solução. Este processo confiável pode ser utilizado regularmente na preparação de amostras de biomarcadores lacrimais para pesquisa e outros fins clínicos. Mais importante ainda, requer treinamento mínimo da equipe para coleta no local e elimina a necessidade de armazenamento de amostras em um freezer. As amostras são secas no local para minimizar a autólise e degradação de proteínas. Assim, isso permite o envio conveniente pelo correio para facilitar a análise a jusante, em vez de usar tubos microcapilares.

A proteômica lacrimal tem recebido atenção para explorar potenciais biomarcadores de doenças e condições oculares 1,2,3,4,5,6, para acessar a patogênese da condição ocular e sistêmica, bem como para explorar a vantagem da coleta não invasiva de amostras lacrimais usando tiras de Schirmer. O avanço tecnológico da espectrometria de massas de última geração permitiu a quantificação de proteínas em rasgos em escala de microlitros com precisão e precisão não possíveis no passado. Os métodos de preparo das amostras ainda não estão padronizados. Um fluxo de trabalho robusto e padronizado de preparação de amostras é essencial para o sucesso da aplicação clínica na pesquisa de biomarcadores de proteína lacrimal. O fluxo de trabalho de preparação de amostras de armadilhagem em suspensão (S-Trap) foi recentemente relatado como um método eficaz e sensível de preparação de amostras para ampla análise proteômica a jusante 7,8. No entanto, essa estratégia não tem sido bem relatada na análise do proteoma lacrimal humano, superando a preparação de amostra auxiliada por filtro (FASP) e a digestão em solução em termos de eficiência da digestão enzimática e do maior número de identificação de proteínas por análise espectrométrica de massa9. A abordagem baseada em S-Trap foi demonstrada na preparação de tecido retiniano 10, tecido fixado em formalina, incluído em parafina (FFPE) 11, células 12, microrganismo 13 e biópsias líquidas14,15.
Este protocolo descreve um fluxo de trabalho quantitativo integrado de amostras clínicas para proteína digerida enzimaticamente para a descoberta de um painel não invasivo de biomarcadores de proteína lacrimal com uma estratégia técnica rápida, reprodutível e robusta. Resumidamente, o fluido lacrimal foi coletado usando uma tira padrão de Schirmer e imediatamente seco com um aquecedor de quadro oftálmico para evitar autólise proteica à temperatura ambiente. As proteínas totais incluídas foram extraídas usando tampão de lise dodecil sulfato de sódio (SDS) a 5%, de acordo com a sugestão do fabricante, seguido de dosagem proteica. O lisado extraído foi então submetido à redução padrão com ditiotreitol (TDT) e alquilação com iodoacetamida (IAA).
Após acidificação com ácido fosfórico, a coluna de suspensão contendo 90% de metanol e 100 mM de trietilamônio bicarbonato (TEAB) foi adicionada às proteínas agregadas. A amostra foi então transferida para uma nova microcoluna de aprisionamento de suspensão. Digestão enzimática com tripsina grau sequencial na proporção de 1:25 (p/p, tripsina: proteína) a 47 °C por 1 h. Os peptídeos resultantes foram então eluídos por centrifugação, sequencialmente com TEAB 50 mM, ácido fórmico (AG) aquoso a 0,2% e acetonitrila (ACN) a 50% contendo AG a 0,2%. Os peptídeos eluídos foram secos a vácuo e reconstituídos em AG 0,1 %. A concentração do peptídeo foi medida e ajustada para 0,5 μg/μL para análise espectrométrica de massas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>9 mm Plastic Screw Thread Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4000-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, LCMS Grade</td>
			<td>Anaqua</td>
			<td>AC-1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge MiniSpin plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, ACS reagent, &#8805;96%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frame Heater OPTIMONSUN Electronic</td>
			<td>Breitfeld &#38; Schliekert GmbH</td>
			<td>1203166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA), BioUltra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>Anaqua</td>
			<td>MA-1292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>368632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>345245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>TripleTOF 6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schirmer Ophthalmic Strips</td>
			<td>Entod Research Cell UK Ltd</td>
			<td>I-DEW Tearstrips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-Trap Micro Column</td>
			<td>Protifi</td>
			<td>C02-micro-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSTART 9 mm Screw Caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CHSC9-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Eksigent</td>
			<td>NanoLC 400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protein suspension-trapping sample preparation for tear proteomics by liquid chromatography-tandem mass spectrometry

O fluido lacrimal é um dos biofluidos de fácil acesso que pode ser coletado de forma não invasiva. A proteômica lacrimal tem o potencial de descobrir biomarcadores para diversas doenças e condições oculares. A coluna de aprisionamento de suspensão tem sido relatada como um fluxo de trabalho de preparação de amostras eficiente e fácil de usar para a ampla aplicação da análise proteômica a jusante. No entanto, essa estratégia ainda não foi bem estudada na análise do proteoma lacrimal humano. O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho integrado de amostras lacrimais humanas clínicas a peptídeos purificados para pesquisa não invasiva de biomarcadores de proteína lacrimal usando espectrometria de massa, que fornece informações sobre biomarcadores e monitoramento de doenças quando combinado com análise de bioinformática. Uma preparação de amostra de aprisionamento de suspensão de proteínas foi aplicada e demonstrou a descoberta do proteoma lacrimal com procedimentos rápidos, reprodutíveis e fáceis de usar, como uma preparação universal e otimizada de amostras para análise de fluido lacrimal humano. Em particular, o procedimento de aprisionamento em suspensão superou a preparação de amostras em solução em termos de recuperação de peptídeos, identificação de proteínas e menor tempo de preparação da amostra.

Tear proteomics has received attention to explore potential biomarkers for ocular diseases and conditions1,2,3,4,5,6, to access the pathogenesis of the ocular and systemic condition, as well as to exploit the advantage of non-invasive tear sample collection using Schirmer strips. The technological advancement of next-generation mass spectrometry has enabled protein quantification in microliter-scale tears with accuracy and precision not possible in the past. Sample preparation methods are not yet standardized. A robust and standardized sample preparation workflow is essential for the success of clinical application in tear protein biomarker research. The suspension trapping (S-Trap) sample preparation workflow was recently reported as an effective and sensitive sample preparation method for broad downstream proteomic analysis7,8. Yet, this strategy has not been well-reported in the analysis of human tear proteome, outperformed filter-aided sample preparation (FASP) and in-solution digestion in terms of enzymatic digestion efficiency and the greater number of protein identification by mass spectrometric analysis9. The S-Trap-based approach was demonstrated in the preparation of retinal tissue 10, formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue11, cells12, microorganism13, and liquid biopsies14,15.
This protocol describes an integrated quantitative workflow from clinical samples to enzymatically digested protein for the discovery of a non-invasive tear protein biomarker panel with a rapid, reproducible, and robust technical strategy. Briefly, tear fluid was collected using a standard Schirmer strip and immediately dried with an ophthalmic frame heater to prevent protein autolysis at room temperature. Embedded total proteins were extracted using 5% sodium dodecyl sulfate (SDS) lysis buffer according to the manufacturer&#39;s suggestion, followed by protein assay measurement. The extracted lysate then underwent standard reduction with dithiothreitol (DTT) and alkylation with iodoacetamide (IAA).
After acidification with phosphoric acid, suspension trapping column protein precipitation buffer containing 90% methanol and 100 mM triethylammonium bicarbonate (TEAB) was added to aggregate proteins. The sample was then transferred into a new suspension trapping micro column. Enzymatic digestion with done with sequencing grade trypsin at a 1:25 ratio (w/w, trypsin: protein) at 47 &#176;C for 1 h. The resulting peptides were then eluted via centrifugation, sequentially with 50 mM TEAB, 0.2% aqueous formic acid (FA), and 50% acetonitrile (ACN) containing 0.2% FA. The eluted peptides were vacuum-dried and reconstituted in 0.1 % FA. The peptide concentration was measured and adjusted to 0.5 &#181;g/&#181;L for mass spectrometric analysis.

Autor em destaque: Avançando na análise do fluido lacrimal usando um protocolo padronizado para pesquisa proteômica 

Preparação de amostra de suspensão de proteínas para proteômica lacrimal por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem

Our research aims to demonstrate the use of a protein suspension trapping sample preparation, known as S trap for mass spectrometry-based research. This protocol employs a rapid, reproducible, and standardized sample preparation of human tear fluid sample collected using the for translational research in ophthalmology. Human tear fluid is a body fluid that can be collected for non-invasive molecular tests in ophthalmology.There is a lot of standardized methods of tear fluid collection and sample preparation, which are critical to successful clinical research of diseases and conditions. Non-standardized methods are difficult to compare and interpret between methodologies and therefore affect chemical outcomes. This protocols allows tear body fluid sampling and storage at room temperature.This helps with easier sample collections and shipping. It provides a rapid and robust peptide extractions for mass spectrometer analysis, which improves peptide recovery and identifications. This protocol has minimal sample preparation steps to minimize error and uncertainties.The fast and superior performance of protein identification and quantification by mass spectrometry will facilitate clinicians and researchers in the development of non-invasive molecular tests. Optimize the sample preparation will always be one of the critical steps. Regardless of the detection method, the clinical value of human tear fluid is yet to be fully investigated.The proposal sample preparation method would hopefully open the door for potential clinical application in the near future.

Este protocolo permite a coleta de amostras lacrimais com Tiras de Schirmer que são armazenadas secas à temperatura ambiente antes do posterior preparo da amostra para análise por espectrometria de massa. O fluxo de trabalho de preparação de amostra auxiliada por filtro (FASP) com microcoluna de aprisionamento de suspensão permitiu a preparação rápida da amostra em horas, em comparação com os procedimentos de digestão em solução comumente adotados em dias que exigem incubação noturna. O rendimento da recuperação peptídica foi significativamente maior (p < 0,001) do que o protocolo padrão de digestão em solução e com boa reprodutibilidade a um coeficiente de variação (%CV) < 7%. Um pool de amostras de lágrimas foi repetido em seis réplicas técnicas com 74,2 ± 5,0% de recuperação de peptídeos e 52,8 ± 1,6% de recuperação de peptídeos em amostras preparadas com procedimentos em solução. Uma amostra de lágrima agrupada com uma quantidade de proteína de 36,3 μg foi cravada na tira de Schirmer e extraída como descrito anteriormente, a eficiência de extração da proteína foi de 81% (29,5 ± 6,8 μg, média ± DP).
Ambos os fluxos de trabalho carregaram 3 μg de peptídeos no MS, e a pesquisa DDA produziu um total de 1.183 ± 118 proteínas (5.757 ± 537 peptídeos distintos) e 874 ± 70 proteínas (4.400 ± 328 peptídeos) a 1% FDR no grupo de aprisionamento em suspensão e no grupo em solução, respectivamente. A análise da ontologia gênica (GO) utilizando o sistema de classificação PANTHER revelou proteomas muito semelhantes para ambas as abordagens, sendo a ligação, a atividade catalítica e a regulação da função molecular suas principais funções moleculares (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig01.jpg"> Figura 1: Dobre a parte superior da tira de Schirmer na marca de 0 mm antes da aplicação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig02.jpg"> Figura 2: Posição da tira de Schirmer durante a coleta da lágrima. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig03.jpg"> Figura 3: Ilustração do manuseio da tira de Schirmer antes da extração da proteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig04.jpg"> Figura 4: Gráfico de pizza ilustrando a análise da ontologia gênica para os proteomas identificados usando o fluxo de trabalho em solução e o fluxo de trabalho de armadilhagem de suspensão, usando o sistema de classificação Panther. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Este protocolo descreve um método para coletar amostras lacrimais usando tiras de Schirmer e um fluxo de trabalho quantitativo integrado para a descoberta de biomarcadores não invasivos de proteína lacrimal. O fluxo de trabalho de preparação de amostras de aprisionamento de suspensão permite a preparação rápida e robusta de amostras lacrimais e análise por espectrometria de massa, resultando em rendimentos de recuperação de peptídeos e identificação de proteínas mais altos do que os procedimentos padrão em solução.

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...

Nossa pesquisa tem como objetivo demonstrar o uso de uma preparação de amostra de aprisionamento de suspensão de proteínas, conhecida como armadilha S para pesquisas baseadas em espectrometria de massas. Este protocolo emprega uma preparação rápida, reprodutível e padronizada de amostras de fluido lacrimal humano coletadas usando o para pesquisa translacional em oftalmologia. O fluido lacrimal humano é um fluido corporal que pode ser coletado para testes moleculares não invasivos em oftalmologia.Há muitos métodos padronizados de coleta de fluido lacrimal e preparação de amostras, que são críticos para o sucesso da pesquisa clínica de doenças e condições. Métodos não padronizados são difíceis de comparar e interpretar entre metodologias e, portanto, afetam os resultados químicos. Este protocolo permite a amostragem e armazenamento do fluido corporal lacrimal à temperatura ambiente.Isso ajuda a facilitar a coleta e o envio de amostras. Ele fornece extrações de peptídeos rápidas e robustas para análise de espectrômetros de massa, o que melhora a recuperação e identificação de peptídeos. Este protocolo tem etapas mínimas de preparação da amostra para minimizar erros e incertezas.O desempenho rápido e superior da identificação e quantificação de proteínas por espectrometria de massas facilitará clínicos e pesquisadores no desenvolvimento de testes moleculares não invasivos. Otimizar a preparação da amostra será sempre uma das etapas críticas. Independentemente do método de detecção, o valor clínico do fluido lacrimal humano ainda não foi totalmente investigado.Espera-se que o método de preparação da amostra proposto abra as portas para uma potencial aplicação clínica em um futuro próximo.

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Research

JoVE Journal

Medicine

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

1.2K visualizações.  The Hong Kong Polytechnic University. Nossa pesquisa tem como objetivo demonstrar o uso de uma preparação de amostra de aprisionamento de suspensão de proteínas, conhecida como armadilha S para pesquisas baseadas em espectrometria de massas. Este protocolo emprega uma preparação rápida, reprodutível e padronizada de amostras de fluido lacrimal humano coletadas usando o para pesquisa translacional em oftalmologia. O fluido lacrimal humano é um fluido corporal que pode ser coletado para testes moleculares não invasivos em...

Vídeo: Autor em destaque: Avançando na análise do fluido lacrimal usando um protocolo padronizado para pesquisa proteômica 

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for several ocular diseases and conditions. The suspension trapping column has been reported to be an efficient and user-friendly sample preparation workflow for the broad application of downstream proteomic analysis. Yet, this strategy has not been well-studied in the analysis of human tear proteome. The present protocol describes an integrated workflow from clinical human tear samples to purified peptides for non-invasive tear protein biomarker research using mass spectrometry, which provides insights into disease biomarkers and monitoring when combined with bioinformatics analysis. A protein suspension trapping sample preparation was applied and demonstrated the discovery of tear proteome with fast, reproducible, and user-friendly procedures, as a universal, optimized sample preparation for human tear fluid analysis. In particular, the suspension trapping procedure outperformed in-solution sample preparation in terms of peptide recovery, protein identification, and shorter sample preparation time.

This protocol describes a method for collecting tear samples using Schirmer strips and an integrated quantitative workflow for discovering non-invasive tear protein biomarkers. The suspension trapping sample preparation workflow enables fast and robust tear sample preparation and mass spectrometric analysis, resulting in higher peptide recovery yields and protein identification than standard in-solution procedures.

Medicina

Collection of Human Tear Fluid Using Schirmer Strip

Begin by wearing gloves and sanitizing hands to prevent sample contamination. Check that the inner packaging of the Schirmer strip is sterile, unexpired, and intact. Next, bend the top of the Schirmer strip slightly inward at the zero millimeter mark near the semicircle tip.Remove the strip by holding the end avoiding direct contact with the zero to 25 millimeter sample collection area. Instruct the subject to look away. Then gently pull down the lower eyelid.Hook the strip end in the lower fornix near the lateral canthus region. After repeating the process for the other eye, ask the subject to close their eyelids gently to minimize irritation. Collect the tear fluid for approximately five minutes until a 15 to 20 millimeter tear sample is obtained.Instruct the subject to open their eyes. Gently pull down the lower eyelid and remove the strips. Next, inspect the hydrated length on the strip and record the collected amount in millimeters.Dry the strip using a standard clean frame heater until the fluid evaporates. Once dried, place the Schirmer strip into a labeled cryo tube and store it in a cool dark place for further processing.

Coleta de fluido lacrimal humano utilizando tira de Schirmer

Protein Extraction from Human Tear Using Schirmer Strip

Begin by cutting and discarding the front end of the Schirmer strip containing the dried human tears beyond the zero millimeter mark. Then cut the strip into one millimeter intervals and place the pieces in a 1.5 milliliter micro centrifuge tube. Next, add 100 microliters of lysis buffer to the micro centrifuge tube.Vortex it at 1000 RPM at room temperature for one hour in a thermo mixer. After brief centrifugation, transfer the supernatant to a new 1.5 milliliter micro centrifuge tube. Using clean forceps, move the strips into 200 microliter pipette tips.Place the tips back into the same micro centrifuge tube, then centrifuge it for maximum sample recovery. Measure the protein concentration using bicinchoninic acid or a compatible protein assay.

Extração de proteína da lágrima humana usando tira de Schirmer

Suspension-Trapping Sample Preparation of Human Tear Protein

Begin by normalizing the human tear protein samples to 50 micrograms of protein. Then add 200 millimolar dithiothreitol, or DTT, to a final concentration of 20 millimolar DTT, incubated at 95 degrees Celsius for 10 minutes. After cooling the protein solution to room temperature, add 400 millimolar iodoacetamide to a final concentration of 40 millimolar, then incubate in the dark at room temperature for 10 minutes.Next, add 12%aqueous phosphoric acid in a one to 10 ratio, resulting in a 1.2%final concentration. Vortex the mixture briefly to mix the solution. Add protein binding buffer in a one to six ratio before vortexing again.Uncap the suspension trapping micro spin column and assemble the spin column onto a two milliliter microcentrifuge tube to collect flowthrough. Add up to 200 microliters of acidified protein lysate mixture into the column. Centrifuge the column at 4000 G for 20 seconds.Next, add 150 microliters of protein binding buffer and centrifuge as before to wash the suspended protein. Assemble the suspension trapping micro column onto a new 1.5 milliliter microcentrifuge tube. Carefully add 20 microliters TEAB digestion buffer onto the filter inside the spin column, avoiding bubbles and air gaps.Securely cap the suspension trapping micro spin column to prevent evaporation. Incubate at 47 degrees Celsius for one hour in a thermal mixer without shaking. Elute peptides with 40 microliters of 50 millimolar TEAB.Then centrifuge it at 4000 G for 20 seconds. Now add 40 microliters of 0.2%formic acid and centrifuge as before. Lastly, add 35 microliters of 0.2%formic acid and 50%to acetonitrile before centrifuging again.Pull the three eluents and dry them using a vacuum centrifuge. Once dried, store the samples at 80 degrees Celsius for future analysis. The data dependent acquisition search yielded a total of 1183 plus or minus 118 proteins in the suspension trapping group, and 874 plus or minus 70 proteins at 1%FDR in the in-solution group.Gene ontology analysis revealed similar proteomes for both approaches with main function as binding catalytic activity and molecular function regulation.