Este protocolo pode fornecer uma nova estratégia para identificar eficazmente os materiais genuínos de Clematidis armandii caulis e seus adulterantes. Este método pode ser usado em pesquisas de qualidade de materiais medicinais e fornece uma referência para estudar os padrões de qualidade de outros materiais medicinais chineses. Para iniciar a preparação da amostra, triture a matéria-prima para uniformizar o tamanho das partículas, passando-as através de uma malha de nylon com um diâmetro interno apropriado.
A transferência pesou com precisão dois gramas da matéria-prima moída para um balão cónico de 50 mililitros rolhado antes de adicionar 50 mililitros de metanol ao balão. Colocar a rolha no balão em ultrassom aquecido a 600 watts e 40 kilohertz durante 30 minutos. No final da incubação, coe a solução de extrato medicinal através do papel de filtro.
Após coação, transferir quatro mililitros da solução de metanol contendo os extractos medicinais para um balão aferido de 10 mililitros. Em seguida, adicione seis mililitros de água e misture a solução. Deixe a solução assentar por 10 minutos.
Para a análise por HPLC das amostras. Comece preparando as fases móveis e defina o programa de gradiente de HPLC conforme descrito no manuscrito. Filtrar a amostra através de uma membrana filtrante microporosa de 0,45 mícron e submetê-la a uma análise por HPLC.
Para cada amostra, realizar a análise seis vezes ao dia. Para avaliar a estabilidade da solução da amostra, analise a mesma solução de amostra armazenada à temperatura ambiente por 0, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 horas após a preparação. Pegue seis repetições da mesma amostra e detecte sua impressão digital em HPLC.
Importe os dados relevantes para o software denominado Sistema de Avaliação de Similaridade de Impressões Digitais Cromatográficas de Medicina Tradicional Chinesa ou SESCF TCM versão 2012. Importe o tempo de retenção e a área de pico para todos os 10 lotes de amostras autênticas de Chuanmutong, bem como cinco lotes de adulterantes para o SESCF TCM para análise. No menu principal, clique no espectro de referência definido e vá para a janela de configurações de parâmetros para definir a impressão digital cromatográfica de referência da espécie autêntica de Chuanmutong como referência.
Em seguida, defina o método de geração de espectro de controle como o método mediano com a largura da janela de tempo de 0,5. Em seguida, clique em calibração de vários pontos no menu principal, selecione os picos e, em seguida, selecione a opção de correspondência de pico como picos marcados. Finalmente, clique em Calcular Similaridade para realizar uma análise de similaridade das amostras com base nas impressões digitais de cromatograma de referência de Chuanmutong.
Para realizar a análise de cluster sistêmico, abra um software de análise estatística relevante e clique no arquivo para importar os dados de 10 lotes de amostras autênticas e cinco lotes de adulterantes para o software. No menu, na guia Classificação, clique em Análise e Agrupamento do Sistema. Selecione as áreas de pico comuns de 10 lotes de amostras autênticas e cinco lotes de adulterantes como variáveis.
Defina o número de clusters como quatro. Em seguida, clique em Método para selecionar o Método de Clustering como conexão entre grupos. Escolha o intervalo de medição como correlação de Pearson e use a guia Ok para desenhar o mapa de análise de cluster.
Para análise de componentes principais ou PCA, abra o software de análise de dados. Clique no arquivo no menu e crie um novo projeto regular. Importe a área de pico de 12 picos comuns em uma planilha do Excel ou similar do sistema HPLC.
Pressione o botão Concluir para concluir a importação de dados. Para definir o tipo de modelo com PCA, clique em Novo para criar um novo modelo e, em seguida, ajuste os dados usando o ajuste automático e adicione guias. Vá para pontuações para obter o mapa de pontuação PCA.
Para usar a Análise de Discriminação de Mínimos Quadrados Parciais Ortogonais ou OPLSDA. Gere o mapa de pontuação do PCA, conforme demonstrado anteriormente. Defina o tipo de modelo com o OPLSDA clicando em Novo e Novo como modelo um Antes de ir para a escala na seleção de par para todos, em seguida, clique em AutoAjuste nas pontuações para gerar o mapa de pontuação OPLSDA.
Para estimar a importância e projeção da variável, vá para o menu do software de análise de dados e vá para Analisar, seguido de definir o número para 200 sob por mutações. Obtenha os valores do quadrado R e do quadrado Q da pontuação OPLSDA e clique em VIP e VIP preditivo para obter o mapa VIP. As impressões digitais de HPLC das 10 amostras autênticas de Chuanmutong mostraram 12 picos comuns distintos, dos quais os relativamente grandes e bem resolvidos.
O pico número 10 foi utilizado como pico de referência para estimar os tempos relativos de retenção dos picos de repouso. As amostras autênticas demonstraram graus de similaridade muito próximos de um, implicando alta similaridade em boa consistência. No entanto, os graus de semelhança entre os cinco lotes de adulterantes e o controle Chuanmutong foram bastante baixos.
Observou-se que as impressões digitais por HPLC dos cinco adulterantes diferiram das amostras autênticas, principalmente na região com tempos de retenção variando de 28 a 55 minutos. A ACP mostrou uma semelhança óbvia entre as variedades autênticas e sua diferença em relação aos adulterantes, com exceção do CC adulterante.Resultados semelhantes também foram obtidos a partir da análise de agrupamento quando a distância de classificação foi de 20. A matriz de pontuação gerada a partir do OPLSDA não indicou intersecção entre os pontos amostrais das amostras autênticas e os adulterantes.
Mais uma vez, o CC adulterante se assemelhava mais às variedades autênticas do que aos outros adulterantes. De acordo com o mapa VIP, os picos com valores superiores a um foram identificados como os principais componentes marcadores causadores da diferença entre as amostras autênticas e os adulterantes. O conteúdo de beta-sitosterol, um componente ativo encontrado em Chuanmutong foi detectado em todos os cinco lotes de adulterantes, mas o conteúdo variou muito.
Este protocolo estabelece vários métodos de análise para refletir todas as informações sobre materiais medicinais de múltiplos ângulos e em toda a forma de estimar a autenticidade dos materiais medicinais Chuanmutong.
