Reconhecemos o apoio do NIH concede P30ES013508 e 5T32GM008076. Agradecemos também a Thermo Scientific para o acesso a PENEIRA 2.0 e drs. Eugene Ciccimaro e Mark Sanders da Thermo Scientific para discussões úteis.

1. Exemplo de Extração de Células <ol><li> Para uma placa de células cm 10: recolha de 1,5 ml de suspensão de células em meio erguido num tubo de centrífuga de 10 ml de vidro pré-rotulados. Para as linhas de aderentes, as células devem ser levantadas com raspagem suave em 1,5 ml de meio mantidas em gelo Opcional:. Se forem utilizados padrões internos, adicione uma aliquota adequada nesta etapa. Comentário: Têmpera do metabolismo celular é crucial para determinados metabolitos. Para análise de metabolitos sensíveis ao tempo, os procedimentos tais como a extracção de metanol frio deve ser considerada. 17 </li><li> Adicionar 6 ml de clorofórmio (CHCI3) / metanol (CH 3 OH) (2:1, v / v) a cada um dos tubos de vidro de 10 ml contendo as amostras. Defina as amostras em um shaker ou multi-vortexer em velocidade baixa por 30 min. Após agitação, as amostras são centrifugadas com uma configuração de baixa aceleração / desaceleração em 1935 xg durante 10 min a 4 ° C para separar completamente as fases. Opcional </em&gt;: Para evitar o uso de CHCI3, a extracção pode ser realizada com diclorometano (CH 2 Cl 2) 18,12. </li><li> Utilizando uma haste longa pipeta Pasteur, transferir a camada orgânica (inferior) para um novo tubo de centrífuga de 10 ml de vidro pré-rotulados. Continue a 4.1. </li><li> Transferir a fase aquosa superior mais tarde a um tubo de plástico de 2 ml de Eppendorf limpo. Evapora-se a amostra sob atmosfera de azoto. Continue a 2.6.2 para dessalinização fase aquosa ou continuar a 4.1 para a análise direta. </li></ol> 2. Extracção de Amostra de soro <ol><li> Transferir 20 uL de soro para um tubo Eppendorf de 2 ml de plástico Opcional:. Se forem utilizados padrões internos, adicione uma aliquota adequada nesta etapa. </li><li> Adicionar 190 mL de CH3OH e vortex por 10 segundos. </li><li> Adicionar 380 mL de CHCI3 e vortex durante 10 seg. </li><li> Adicionar 120 mL de H 2 O para induzir a separação de fases. Agitar as amostras para 10 seg e deixa-se equilibrar à temperatura ambiente durante 10min. </li><li> Centrifugar as amostras a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C para separar as fases. </li><li> Transferir a fase orgânica inferior a um tubo de plástico de 2 ml de Eppendorf limpo. Continue a 4.1. </li><li> Transferir a fase aquosa superior mais tarde a um tubo de plástico de 2 ml de Eppendorf limpo. Evapora-se a amostra sob atmosfera de azoto. </li><li> Re-suspender a amostra em 200 ul de H2O Ácido ou base de reagentes (0,1% de ácido acético, ácido fórmico ou de hidróxido de amónio a 0,1%) pode ser usado para extrair os metabolitos preferencialmente sensíveis ao pH. Sonicar durante 20 min em gelo para re-suspender a amostra completamente. </li><li> Activa as colunas de giro C18 com 500 mL de CH3OH. </li><li> Equilibrar a coluna de spin com duas lavagens de 500 ul de H2O e, em seguida, carregar a amostra. Se são utilizados reagentes de ácido / base de manter esta concentração nas etapas de lavagem. </li><li> Lava-se com 500 mL de H2O para dessalinizar a amostra. Novamente, se os reagentes de ácido / base são usados ​​manter esta concentração na lavagempassos. </li><li> Eluir com dois volumes de 200 ul de 80% CH 3 OH em ​​H 2 O em 2 ml de um tubo pré-rotulados Eppendorf limpo. Novamente, se os reagentes de ácido / base são usados ​​manter esta concentração nas etapas de lavagem. Continue a 4.1. </li></ol> 3. Extracção de Amostra de Tecido <ol><li> Dependendo do tecido, usar-se entre 10-100 mg de tecido congelado. Adicionar toda a peça de tecido para um tubo Eppendorf de 2 ml de retenção de grandes quantidades de pré-rotuladas com 1 ml de PBS (1 M, pH 6,8) num banho de gelo Opcional:. Se forem utilizados padrões internos, adicioná-la ao tampão, antes de adicionar o tecido. </li><li> Homogeneizar o tecido no gelo com um moedor de tecido elétrica por 30 segundos em cada Eppendorf. Entre amostras, limpe o triturador de tecidos em dois tubos separados contendo CH3OH e H2O, respectivamente. </li><li> Transferir o homogenato de tecido com uma pipeta de plástico de 10 ml para um tubo de centrífuga de vidro pré-rotulados. Após a transferência, lavar cada tubo Eppendorf2x com 1 ml de CH3OH e adicionar as lavagens ao homogeneizado de tecido no interior dos tubos de vidro. </li><li> Adicionar 4 ml de CHCl 3 a cada um dos tubos de vidro contendo 10 ml do homogeneizado de tecido e CH3OH lavagens. Defina as amostras em um shaker ou multi-vortexer em velocidade baixa por 30 min. </li><li> Após agitação, centrifugação das amostras, com um nível baixo de aceleração / desaceleração em 1935 xg durante 10 min para separar completamente as fases opcionais:. Para evitar a utilização de clorofórmio, extracções foram desenvolvidos com CH 2 Cl 2. </li><li> Utilizando uma haste longa pipeta Pasteur, transferir a camada orgânica (inferior) para um novo tubo de centrífuga de 10 ml de vidro pré-rotulados. Continue a 4.1. </li><li> Utilizando uma haste longa pipeta Pasteur, transferir a fase aquosa para um novo tubo de centrífuga de 10 ml de vidro pré-rotulados. Ir para 2.6.2 para dessalinização ou continuar a 4.1. </li></ol> 4. Re-suspensão e Filtração de amostras para UPLC <ol><li> Evaporar o samples em gás nitrogênio. </li><li> Reconstituir secou-se as amostras num volume apropriado de solução de partida para o método de UPLC desejada (ver Tabela 1). 50-100 ul é geralmente um volume de ressuspensão desejável. Suavemente vortex e / ou pipeta da amostra cima e para baixo para ajudar na dissolução dos analitos. </li><li> Transfira a amostra num tubo de um filtro de nylon de 0,22 e de rotação de até 14.000 x g até a amostra ter passado completamente através do filtro (~ 5 minutos). Certifique-se de que não há precipitados visíveis que permanece na amostra. </li><li> Transferir o sobrenadante da amostra filtrada para um frasco UPLC pré-rotuladas com inserção. Tampão frasco, em seguida, apertar o frasco de forma a remover quaisquer bolhas a partir do fundo do frasco de amostra. Colocar a amostra no auto-amostrador refrigerado (4-5 ° C). </li></ol> 5. Setup UPLC <ol><li> Usando o software de controle para o cromatógrafo líquido, criar uma corrida para a amostra biológica baseado fora das condições previstas no <strong&gt; Tabela 1. Em seguida, criar um método para a fase aquosa fora das condições listadas na Tabela 1 Opcional:. Se um conjunto conhecido de analitos alvo são de grande interesse, optimizar as condições de UPLC utilizando o análogo marcado pesada destes compostos, e gerar um método que utiliza estas condições . </li><li> Permitir que a UPLC equilibrar adequadamente. Isto deve incluir uma iniciação completa de solventes antes de anexar uma coluna, e seguindo as instruções do fabricante para o volume de equilíbrio de uma nova coluna (geralmente 3-5 volumes de coluna). Manter um registro de partida de volta pressões para ajudar a diagnosticar problemas futuros. </li></ol> 6. Setup Espectrômetro de Massa <ol><li> Utilizando o software de controlo para o espectrómetro de massa de alta resolução, criar um método de modo positivo, utilizando as condições listadas na Tabela 2. Em seguida, utilizando as mesmas condições, criar um método opcional de modo negativo:. Se um conjunto conhecido de analitos alvo são de elevada interest, fonte e optimizar as condições de óptica utilizando o análogo marcado pesada destes compostos, e gerar um método que utiliza estas condições. </li><li> Limpar e calibrar o instrumento, estabelecer uma pulverização estável no espectrómetro, e que haja tempo para que a solução de calibração para dissipar de forma adequada a partir da fonte e óptica. Estabilidade aceitável de pulverização deve dar um 3-5% RSD de intensidade ao longo de pelo menos 100 scans com a injecção da solução de calibração com a mesma taxa de fluxo como a LC método a ser utilizado. </li><li> Configure a seqüência para todas as amostras, ajustar o volume de injeção adequado, e executar um espaço em branco antes da primeira amostra. Se houver suspeita de reporte ou matriz de efeitos entre amostras, execute blanks / lavagens adequadas. As amostras devem ser configurados de modo randomizado, utilizando um gerador de números aleatórios e uma chave para evitar os efeitos de lote introduzidas pela análise. Comentário: amostras de controle de qualidade, incluindo as normas de isótopos estáveis ​​ou padrões analíticos dos prováveis ​​alvos pode serextremamente valioso na solução de problemas e assegurando resultados confiáveis ​​e reprodutíveis, e válido. Uma repetição técnica de um só amostra padrão seguido por um branco de solvente pode ser utilizado para aceder desvio de intensidade do sinal e o tempo de retenção, bem como o arrastamento em ensaio em branco. </li><li> Comece a seqüência e monitorar periodicamente para problemas, incluindo flutuações de pressão ou perda de intensidade do sinal ao longo do curso. Se forem detectados problemas graves, interromper a corrida, e repita a partir do 6.2. </li></ol> 7. Análise diferencial <ol><li> Dois fluxos de trabalho são apresentados para esse protocolo. A primeira é através PENEIRA 2.0, software de análise diferencial etiqueta livre de propriedade vendido por Thermo Fisher. O segundo fluxo de trabalho é através XCMS online, uma plataforma livre através do Instituto de Pesquisa Scripps. 11 Antes de iniciar a análise diferencial, verificar manualmente as TICs ou olhar cromatogramas filtradas para qualquer composto conhecido na amostra para garantir a reprodutibilidade das corridase injeção / UPLC / spray de estabilidade em todas as amostras. </li><li> PENEIRA <ol><li> Transfira os arquivos de dados brutos. Desde o espectrômetro de massa para o disco rígido da estação de trabalho onde PENEIRA está instalado. (Nota: a funcionar PENEIRA com os dados armazenados em uma unidade conectada em rede ou porta USB não é aconselhável, pois pode limitar a velocidade de análise). </li><li> Abrir peneira, e começar uma nova experiência. </li><li> Carregar os arquivos apropriados em peneira. </li><li> Atribuir grupos de comparação e selecione um arquivo único de referência para permitir a peneira para gerar os parâmetros para análise. </li><li> Siga as instruções e ajustar os parâmetros de acordo com requisitos de qualquer experiência individual. Muitas vezes, é aconselhável começar com parâmetros rigorosos e, em seguida, voltar e soltar os parâmetros conforme as definições mais generosas podem alongar o tempo de análise. </li><li> Carregar a lista de aduto correta para o modo positivo ou negativo nos parâmetros. </li></ol></li><li> XCMS online <ol><li> Converta arquivosem um formato aceitável para XCMS Online. No nosso caso, nós convertemos a mzXML formato 19. </li><li> XCMS abertas online, e criar emprego. </li><li> Carregar e nomear conjuntos de dados. Apenas dois conjuntos de dados (por exemplo, controle vs tratamento) podem ser carregados como XCMS stand-alone é limitada a comparações head-to-head. </li><li> Selecione as configurações desejadas na lista drop-down. Os parâmetros pré-povoadas estão disponíveis para diferentes configurações de instrumentação, e estes podem ainda ser modificados para as necessidades experimentais. No nosso caso, usamos as configurações de HPLC-Orbi2. </li><li> Enviar e confirme trabalho. </li></ol></li><li> Análise de Dados <ol><li> Para peneira e XCMS uma lista de quadros e recursos, respectivamente, será preenchida uma vez que a análise for concluída. Certifique-se de que o alinhamento LC sobrepõe quaisquer picos marco. Se qualquer uma das corridas LC desalinhados mostram grande desvio em picos marco isso pode indicar um problema com a amostra. Opcional: Para a peneira, se as normas internas são utilizadas, localizeo grupo pico correspondente e normalizar o quadro selecionado. Para XCMS On-line, a normalização pode ser feito em uma planilha após a exportação. </li><li> Plotar os dados por meio do coeficiente de variação (CV) em uma amostra da população, como (por exemplo, amostras de controle). Qualquer grandes valores de CV pode indicar um problema com um ou mais amostras. Classificar a lista com base em características desejadas (por exemplo, valor de p &lt;0,05, Mudança Fold&gt; 1.5, baixo desvio padrão dentro de um grupo, etc). </li><li> Examine cada pico para o alinhamento apropriado de pico em todos os grupos, a integração de pico, o pico de forma Gaussian, a intensidade do sinal, isótopos e atribuição aduto. </li><li> Exportar dados como desejado para uma análise mais aprofundada ou para gerar listas de massa direcionados para a confirmação e n experimentos MS. </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Irrelevantes metabolômica oferece uma ferramenta poderosa para investigar biotransformações endógenos ou xenobióticos, ou a captura de um perfil metabólico de uma amostra de interesse. A saída das escalas técnica com a resolução e sensibilidade da tecnologia utilizada para separar e analisar a amostra, a capacidade de lidar com grandes conjuntos de dados gerados, bem como a capacidade para extrair o conjunto de dados para obter informações úteis (por exemplo, a pesquisa de banco de dados de massa e...

Devido aos recentes avanços tecnológicos no campo da HRMS, irrelevantes, hipótese de geração de metabolômica abordagens tornaram-se uma abordagem viável para análise de amostras complexas. Uma espectrômetros de massa, capazes de facilitar a resolução de 100.000 rotina baixa parte por milhão (ppm) de precisão em massa tornaram-se amplamente disponível a partir de vários fornecedores. 2,3 Esta precisão massa permite uma maior especificidade e confiança em um trabalho preliminar de identidade analito, reconhecimento de padrões de isótopos, e identificação aduto. 4 Quando acoplado com um procedimento de extracção apropriado e de alto desempenho LC ou UPLC, misturas complexas podem ser analisados ​​com especificidade adicional derivado a partir de dados de tempo de retenção. UPLC 5 possui uma maior eficiência cromatográfica e permite uma maior sensibilidade, resolução e análise do tempo fazendo uma maior cobertura do metaboloma possível. 6 As grandes conjuntos de dados resultantes pode ser integrado em qualquerde software de análise diferencial múltiplo e minado para os padrões úteis ou analitos de interesse individuais. 7,8,9,10,11 sucessos putativos podem ser identificados inicialmente usando uma combinação de algoritmos de detecção de pico, a previsão fórmula exata massa base química, a previsão de fragmentação e pesquisa de banco de dados de produtos químicos. Esta abordagem permite a priorização de metas para demorado identificação estrutural completa ou para o desenvolvimento de mais sensível e mais específico de diluição isotópica estável reação UPLC / selecionada ou múltipla monitoramento / MS estudos que são os métodos padrão ouro atual para a quantificação de 12. A natureza variável das amostras biológicas tem levado a optimização de protocolos para extracção de urina 13, as células 14, 15 de soro, ou de tecido 16. Este protocolo características extracções de células, soro e tecido. Sempre que necessário, comentários e referências adicionais foram incluídas para modificaçãoções do processo para tratar a inclusão de isótopos estáveis, ou pela inclusão de metabolitos especialmente instáveis.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W7-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (CH3CN)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A996-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (CH3OH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A464-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CH3Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td>Hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (CH2Cl2)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>61030-1000</td>
			<td>To replace chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl Ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>346136</td>
			<td>To replace chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid (FA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate (HCOONH4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78314</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSpin C18 Columns</td>
			<td>Nest Group Inc</td>
			<td>SS18V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Centrifuge Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>73785-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>CLS-4301-015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Vials (glass)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>60000751CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Inserts (glass)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT094171</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Vials (plastic)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002640</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &mu;m Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8169</td>
			<td>nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf Tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3229-1</td>
			<td>Low Retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ XL-Orbitrap</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC/UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>nanoACQUITY UPLC</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source</td>
			<td>Michrom</td>
			<td>Thermo Advance Source</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Analysis Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SIEVE 2.0</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoACQUITY C18 BEH130</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003546</td>
			<td>1.7 &mu;m particle size, 150 mm x 100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acentis Express C8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54262</td>
			<td>2.7 &mu;m particle size, 15 cm x 200 &mu;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms)

Apresentamos aqui um fluxo de trabalho para analisar os perfis metabólicos para amostras biológicas de interesse, incluindo: as células, soro ou tecido. A amostra é primeiro separado em fracções polares e não polares por uma extracção de fase líquido-líquido, e parcialmente purificada para facilitar a análise a jusante. Ambos aquosas (metabolitos polares) e orgânicos fases (metabólitos não-polares) da extracção inicial são processados ​​para pesquisar uma ampla variedade de metabolitos. Os metabolitos são separados por diferentes métodos de cromatografia líquida com base em suas propriedades de partição. Neste método, apresentamos microfluxo ultra eficiência (UP), os métodos de LC, mas o protocolo é adaptar a fluxos mais elevados e pressões mais baixas. Introdução no espectrômetro de massa pode ser, quer através de condições de origem optimizado gerais ou composto. A detecção de uma ampla gama de iões é efectuada em modo de varrimento completo no modo positivo e negativo numa larga gama m / z usando alta resolução num recentemente cinstrumento alibrated. Etiqueta livre de análise diferencial é realizada em plataformas de bioinformática. Aplicações dessa abordagem incluem triagem metabólica caminho, descoberta de biomarcadores e desenvolvimento de medicamentos.

Os resultados apresentados mostram os dados selecionados a partir de um tratamento de 6 horas de células de glioblastoma SH-SY5Y com o pesticida e inibidor do complexo I mitocondrial rotenona. Para resumir, apenas a fase de dados de modo positivo orgânicos é apresentada. As amostras foram processadas e analisadas como descrito acima (Figura 1, Tabela 1, Tabela 2) e carregou-se duas plataformas de análises diferenciais para o marcador livre de quantificação, peneira e XCMS linha. Embora um grande n...

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Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Irrelevantes metabolômica fornece uma hipótese gerando instantâneo de um perfil metabólico. Este protocolo irá demonstrar a extracção e análise de metabolitos a partir de células, soro ou tecido. Uma gama de metabolitos são pesquisadas utilizando extracção de fase líquido-líquido, cromatografia líquida de microfluxo UltraPerformance /-espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS), acoplado ao software de análise diferencial.

Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

untargeted-metabolomics-from-biological-sources-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

22.2K visualizações.  University of Pennsylvania. Irrelevantes metabolômica fornece uma hipótese gerando instantâneo de um perfil metabólico. Este protocolo irá demonstrar a extracção e análise de metabolitos a partir de células, soro ou tecido. Uma gama de metabolitos são pesquisadas utilizando extracção de fase líquido-líquido, cromatografia líquida de microfluxo UltraPerformance /-espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS), acoplado ao software de análise diferencial.

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

Grande Escala Profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Química

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Analisando Dynamics proteína utilizando hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

Rápida de alta capacidade: Identificação de Espécies de material botânico Usando Direct Análise em Tempo Real alta resolução Espectrometria de Massa

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Análise de respiração em tempo real usando o Nanoelectrospray secundário ionização acoplada a espectrometria de massa de alta resolução

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Vigilância de drogas de alto rendimento e abrangente utilizando espectrometria de massa Multisegment eletroforese capilar-injeção

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

Corrosão por imagem na interface metal-Paint usando espectrometria de massa de íons secundários de tempo de voo

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

3D Depth Profile Reconstruction of Segregated Impurities Using Secondary Ion Mass Spectrometry

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial resolution (~1 &#181;m). Furthermore, it describes how to obtain realistic three-dimensional (3D) distributions of segregated impurities/dopants in solid state materials. Direct 3D depth profile reconstruction is often difficult to achieve due to SIMS-related measurement artifacts. Presented here is a method to identify and solve this challenge. Three major issues are discussed, including the i) nonuniformity of the detector being compensated by flat-field correction; ii) vacuum background contribution (parasitic oxygen counts from residual gases present in the analysis chamber) being estimated and subtracted; and iii)&#160;performance of all steps within a stable timespan of the primary ion source. Wet chemical etching is used to reveal the position and types of dislocation in a material, then the SIMS result is superimposed on images obtained via scanning electron microscopy (SEM). Thus, the position of agglomerated impurities can be related to the position of certain defects. The method is fast and does not require sophisticated sample preparation stage; however, it requires a high-quality, stable ion source, and the entire measurement must be performed quickly to avoid deterioration of the primary beam parameters.

The presented method describes how to identify and solve measurement artifacts related to secondary ion mass spectrometry as well as obtain realistic 3D distributions of impurities/dopants in solid state materials.

Reconstrução de perfil de profundidade 3D de impurezas segregadas usando espectrometria de massa de íons secundários

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Caracterizando modificações de RNA em neurônios únicos usando espectrometria de massa

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of NPAAs can provide crucial information about cellular uptake and/or function, metabolic pathways, and potential toxicity. &#946;-methylamino-L-alanine (BMAA) is a neurotoxic NPAA produced by various algae species and is associated with an increased risk for neurodegenerative diseases, which has led to significant research interest. There are numerous ways to extract AAs for analysis, with liquid chromatography-tandem mass spectrometry being the most common, requiring protein precipitation followed by acid hydrolysis of the protein pellet. Studies on the presence of BMAA in algal species provide contradictory results, with the use of unvalidated sample preparation/extraction and analysis a primary cause. Like most NPAAs, protein precipitation in 10% aqueous TCA and hydrolysis with fuming HCl is the most appropriate form of extraction for BMAA and its isomers aminoethylglycine (AEG) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). The present protocol describes the steps in a validated NPAA extraction method commonly used in research and teaching laboratories.

The present protocol describes the extraction of non-protein amino acids from biological matrices via trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation and acid hydrolysis before analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Extração de Aminoácidos Não Proteicos de Cianobactérias para Cromatografia Líquida - Análise de Espectrometria de Massas em Tandem

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...