Os autores gostariam de agradecer a L. Pieters, T. Thiron e G. De Smet pelo suporte técnico. Agradecemos a todos os voluntários que doaram sangue para o estudo. O trabalho foi financiado pela Fundação de Pesquisa - Flandres (FWO) sob Grant (T000118N).

Para este estudo, amostras de sangue foram coletadas por punção venosa de 30 doadores saudáveis com idade entre 17 e 65 anos. Os dados de NM de 20 doadores foram reutilizados do artigo de Beyls et al.8 A coleta das amostras de sangue está de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética do Hospital Universitário de Ghent (número de registro:2019/1565), Bélgica. Consentimento informado foi obtido de todos os participantes. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e reagentes usados neste protocolo.
1. Coleta de amostras de sangue
<ol><li>Antes de começar, certifique-se de que o consentimento informado por escrito dos participantes esteja disponível e que as diretrizes éticas sejam seguidas adequadamente.</li>
	<li>Coletar sangue em tubos de Li-Heparina e armazenar em temperatura ambiente até estar pronto para processamento para criopreservação.</li>
</ol>2. Criopreservação de sangue total
OBS: Todas as etapas até a colheita das células são realizadas de forma asséptica em fluxo de ar laminar estéril.
<ol><li>Para criopreservar 1 mL de sangue, fazer 1 mL de meio de congelamento misturando 800 μL de Soro Fetal de Bezerro (FCS) e 200 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). NOTA: O meio de congelamento é preparado em um volume igual às amostras de sangue que precisam ser congeladas.</li>
	<li>Para criopreservação de sangue total, transferir a amostra de sangue do tubo heparinizado para tubos centrífugos de 15 ou 50 mL NOTA: A capacidade do tubo depende do volume do sangue.</li>
	<li>Vórtice o sangue a baixa velocidade com adição contínua , mas gota a gota , de um volume igual de meio de congelamento.</li>
	<li>Transfira 2 ml de mistura de sangue congelado para criópoles (2 ml) onde cada alíquota tem 1 ml de amostra de sangue misturada com 1 ml de mistura congelante.</li>
	<li>Congelamento gradual gradual<ol><li>Transfira os crióscos para uma criocaixa contendo isopropanol e coloque em um congelador (-80 °C) durante a noite.</li>
		<li>Transfira os criófrascos para nitrogênio líquido para uso a longo prazo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Descongelamento do sangue criopreservado
NOTA: Para limitar o tempo total do processo de descongelamento, um máximo de 8 crióscos (2 mL cada) devem ser manuseados por vez.
<ol><li>Preparação<ol><li>Pré-aquecer 200 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a 37 °C antes de descongelar o sangue.</li>
		<li>Preparar uma solução de trabalho do meio de cultura necessário em condições estéreis. Certifique-se de que o meio por cultura inclua 1,6 mL de meio completo: meio Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com penicilina/estreptomicina (0,5%), 0,2 mL de FCS, 20 μL de piruvato de sódio e 2 μL de β-mercaptoetanol. NOTA: Uma vez que um número significativo de células sanguíneas pode ser perdido durante o descongelamento, o sangue descongelado é cultivado em pequenos poços como placas de 24 poços com um volume total de 2 mL. Uma placa de poço múltiplo por dose é usada.</li>
		<li>Para cada cultura, indicar o código doador e A/B na tampa, juntamente com a data e dose, conforme sugerido abaixo (Figura 1).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig01.jpg"> Figura 1: Sugestão de disposição de placa de 24 poços para cultura de sangue total para o ensaio do micronúcleo. Marque os poços e indique os códigos dos doadores em locais apropriados na tampa. Para cada amostra de paciente, os poços duplicados devem ser adjacentes uns aos outros. Note que é um layout sugestivo para um colimador 10 x 10 e pode ser alterado de acordo com o tamanho do colimador ou amostras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2"><li>Passos para descongelar e cultivar sangue total<ol><li>Aqueça o banho-maria a 37 °C.</li>
		<li>Retire os criósculos necessários do nitrogênio líquido (o número depende das necessidades, como o número de doses). NOTA: Um criovial contém 1 mL de sangue e 1 mL de meio de congelamento. Portanto, duas culturas podem ser configuradas com sangue de um criovial.</li>
		<li>Descongelar parcialmente os crióvios no banho de água morna (até que pequenos cristais de gelo ainda sejam vistos).</li>
		<li>Retire os frascos para injetáveis do banho-maria e limpe o exterior dos frascos com papel de seda estéril.</li>
		<li>Em um exaustor de fluxo de ar laminar estéril, abra os frascos muito lentamente para evitar que bolhas de ar formadas dentro dos tubos se derramem.</li>
		<li>Ressuspenda o conteúdo de cada frasco para injetáveis e transfira-o individualmente para um tubo de centrífuga cónica de 15 ml (1 tubo por frasco para injetáveis).</li>
		<li>Aos respectivos tubos, adicione gota a gota 1 mL de PBS morno (37 °C) enquanto gira suavemente o tubo. Ressuspenda com uma pipeta P1000.</li>
		<li>Para diluição e lavagem uniforme, adicionar gota a gota 7 mL de PBS pré-aquecido (37 °C) e ressuspender com uma pipeta P1000.</li>
		<li>Centrifugar o sangue durante 8 minutos a 180 × g (com regulação na aceleração 1, travão 1) à temperatura ambiente.</li>
		<li>Durante esta etapa de espera, preencha os poços vazios (exceto aquele onde as células serão cultivadas) com 500 μL de PBS.</li>
		<li>Coloque as placas de poço de volta na incubadora para pré-aquecer.</li>
		<li>Uma vez concluída a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando para trás aproximadamente 1 mL para evitar perturbar o pellet celular.</li>
		<li>Ressuspender o pellet no sobrenadante restante com uma pipeta P1000.</li>
		<li>Adicionar gota a gota 8 mL de PBS quente (37 °C) nos respectivos tubos enquanto gira suavemente os tubos. Depois, ressuspenda com uma pipeta P1000.</li>
		<li>Centrifugar o sangue ressuspendido por 8 min a 180 × g (com ajuste na aceleração 9, freio 9).</li>
		<li>Durante essa etapa de espera, transferir 200 μL de meio de cultura para cada um dos poços marcados.</li>
		<li>Mantenha as placas de volta na incubadora para permanecer a 37 °C.</li>
		<li>Após a centrifugação, remova o sobrenadante em um movimento contínuo (para evitar perturbar a pastilha de células soltas), mas deixe para trás aproximadamente 80 μL do sobrenadante.</li>
		<li>Ao pellet, adicionar 280 μL de FCS (temperatura ambiente) e ressuspender (para um volume total de 360 μL).</li>
		<li>Transferir 180 μL da suspensão celular para cada poço e ressuspender (= 0,5 mL de "sangue"/cultura). O volume total em cada poço é agora de 380 μL, resultando em uma camada média de 2 mm.</li>
		<li>Incubar as placas numa incubadora de CO2 a 37 °C durante, pelo menos, 10 minutos antes da irradiação.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Ensaio G0 MN
<ol><li>Retire as placas da incubadora e irradie a cultura celular com as doses necessárias, como raios X de 0,5, 1 e 2 Gy (220 kV, 13 mA, 0,15 mm) à temperatura ambiente. Use amostras simuladas irradiadas como controle para identificar rendimentos espontâneos de MN.</li>
	<li>Imediatamente após a irradiação, adicionar 1,62 mL de meio de cultura (37 °C) a cada poço.</li>
	<li>Para estimular a divisão celular em linfócitos T, adicione 40 μL de Fitohemaglutinina (PHA) a cada poço e ressuspenda completamente.</li>
	<li>Coloque estas placas de volta na incubadora (5% CO2, 37 °C). NOTA: Esta será a hora de início do ensaio.</li>
	<li>Bloquear a citocinese 23 h após a estimulação adicionando 8 μL de citocalasina B (6 μg/mL) por poço e ressuspender adequadamente.</li>
	<li>Colher as culturas celulares 70 h após a estimulação/tempo de cultivo. Ressuspender e transferir as células para um tubo de 15 mL. Enxaguar cada poço com 2 mL de PBS e adicionar este PBS ao respectivo tubo de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar os tubos durante 8 min a 180 × g, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante, mas deixe aproximadamente 500 μL sobre o pellet.</li>
	<li>Vórtice o pellet (a toda velocidade) e, durante o vórtice, adicione lentamente 2 mL de cloreto de potássio frio (KCl, 4 °C).</li>
	<li>Centrifugar imediatamente as células a 180 × g durante 8 min.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante, deixando aproximadamente 500 μL do sobrenadante.</li>
	<li>Vórtice o pellet (a toda velocidade) e, durante o vórtice, adicione lentamente 2 mL do fixador a frio 1 (metanol/ácido acético/solução de Ringer na proporção de 4:1:5).</li>
	<li>Deixar os tubos de amostra durante a noite a 4 °C (mínimo 12 h e máximo 96 h).</li>
	<li>Centrifugar por 8 min a 180 × g.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Vórtice o pellet (a toda velocidade) e, durante o vórtice, adicione lentamente 2 mL do fixador a frio 2 (metanol/ácido acético na proporção de 4:1).</li>
	<li>Centrifugar por 8 min a 180 × g.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Vórtice o pellet (a toda velocidade) e, em seguida, adicione lentamente (dropwise), enquanto vórtice, 2 mL de fixador frio 2 ao pellet.</li>
	<li>Deixar os tubos de amostra a 4 °C (mínimo 12 h e máximo 96 h).</li>
	<li>Limpe as lâminas com isopropanol e rotule-as corretamente. NOTA: Use adesivos impressos para rotular, pois a tinta do marcador é facilmente limpa durante o processamento.</li>
	<li>Centrifugar os tubos de amostra durante 8 min a 180 × g.</li>
	<li>Transfira o sobrenadante para outro tubo para concentrar as células de acordo com o tamanho do pellet.</li>
	<li>Vórtice a pelota.</li>
	<li>Solte 40 μL das células fixas em uma lâmina seca e limpa.</li>
	<li>Deixe as lâminas secar em temperatura ambiente. Guarde as lâminas em uma caixa ou manche imediatamente para observação.</li>
</ol>5. Coloração laranja de acridina (AO)
<ol><li>Imergir as lâminas em corante AO por 1 min, seguido de uma lavagem rápida na água destilada e, em seguida, colocar as lâminas em tampão fosfato (pH 6,8) por 1 min.</li>
	<li>Retire as lâminas da solução tampão e com papel de seda limpo, seque a parte de trás das lâminas e coloque as lâminas em um papel de seda limpo.</li>
	<li>Solte 20 μL do tampão fosfato em cima da lâmina e cubra-a suavemente com uma lamínula limpa, evitando bolhas de ar.</li>
	<li>Sele estas lâminas com cimento de silicone. NOTA: Como o AO é sensível à luz e desaparece com o tempo, para um bom contraste e fluorescência, recomenda-se a pontuação das lâminas dentro de 5 dias após a coloração. Guarde sempre as lâminas em câmara fria (4 °C), quando não examinadas.</li>
</ol>6. Pontuação de lâminas manchadas
<ol><li>Coloque sua lâmina sob um microscópio de fluorescência e examine 1.000 células binucleadas (BNs). Conte manualmente MNs, que são um dos seis biomarcadores de toxicidade. Para isso, peça a dois escores independentes que examinem 500 células/lâmina de BN sob a mesma ampliação. OBS: A seguir estão alguns destaques dos critérios de pontuação, conforme recomendado por Fenech para pontuar as lâminas coradas9<ol><li>Selecione uma célula BN procurando células bem arredondadas com citoplasma intacto, com dois núcleos bem distintos de aproximadamente o mesmo tamanho, forma regular e padrão de coloração. Certifique-se de que o citoplasma da célula BN é distinguível do citoplasma da célula adjacente.</li>
		<li>Escore um MN, observando que ele é morfologicamente idêntico, mas menor que os núcleos principais; mesmo o maior MN não pode ter mais de 1/3 do diâmetro dos núcleos principais. Pontuar um MN somente se ele não tocar os núcleos principais ou, pelo menos, o limite micronuclear for distinguível do limite dos núcleos principais.</li>
	</ol></li>
</ol>

Examinando o rendimento de micronúcleos em amostras de sangue total irradiadas

<ol>
	<li>Grade, M., Difilippantonio, M. J., Camps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+chromosomal+aberrations+in+solid+tumors.">Patterns of chromosomal aberrations in solid tumors.</a> Recent Results in Cancer Research. 200, 115-142 (2015).</li><li>Jiao, Y., Cao, F., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+cell+death+and+its+mechanisms.">Radiation-induced cell death and its mechanisms.</a> Health Physics. 123 (5), 376-386 (2022).</li><li>Roederer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+architecture+of+the+human+immune+system:+a+bioresource+for+autoimmunity+and+disease+pathogenesis.">The genetic architecture of the human immune system: a bioresource for autoimmunity and disease pathogenesis.</a> Cell. 161 (2), 387-403 (2015).</li><li>Bankoglu, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cryopreservation+on+DNA+damage+and+DNA+repair+activity+in+human+blood+samples+in+the+comet+assay.">Effect of cryopreservation on DNA damage and DNA repair activity in human blood samples in the comet assay.</a> Archives of Toxicology. 95, 1831-1841 (2021).</li><li>Zijno, A., Saini, F., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+cryopreserved+isolated+lymphocytes+for+the+analysis+of+micronuclei+with+the+cytokinesis-block+method.">Suitability of cryopreserved isolated lymphocytes for the analysis of micronuclei with the cytokinesis-block method.</a> Mutagenesis. 22, 311-315 (2007).</li><li>Sioen, S., Cloet, K., Vral, A., Baeyens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytokinesis-block+micronucleus+assay+on+human+isolated+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells.">The cytokinesis-block micronucleus assay on human isolated fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells.</a> Journal of Personalized Medicine. 10 (3), 125 (2020).</li><li>Cheng, L., Wang, L. E., Spitz, M. R., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserving+whole+blood+for+functional+assays+using+viable+lymphocytes+in+molecular+epidemiology+studies.">Cryopreserving whole blood for functional assays using viable lymphocytes in molecular epidemiology studies.</a> Cancer Letters. 166 (2), 155-163 (2001).</li><li>Beyls, E., Baeyens, A., Vral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytokinesis-block+micronucleus+assay+for+cryopreserved+whole+blood.">The cytokinesis-block micronucleus assay for cryopreserved whole blood.</a> International Journal of Radiation Biology. 97 (9), 1252-1260 (2021).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Ramachandran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+thawing+of+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+use+in+high-throughput+human+immune+monitoring+studies.">Optimal thawing of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells for use in high-throughput human immune monitoring studies.</a> Cells. 1 (3), 313-324 (2012).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLoS One. 12 (11), e0187440-e0187517 (2017).</li><li>Alam, I., Goldeck, D., Larbi, A., Pawelec, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+lymphocyte+subset+analysis+using+material+from+frozen+whole+blood.">Flow cytometric lymphocyte subset analysis using material from frozen whole blood.</a> Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 33 (2), 128-139 (2012).</li><li>Langenski&#246;ld, C., Mellgren, K., Abrahamsson, J., Bemark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+blood+cell+subtype+concentrations+from+frozen+whole+blood+samples+using+TruCount+beads.">Determination of blood cell subtype concentrations from frozen whole blood samples using TruCount beads.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 94B, 660-666 (2018).</li><li>Braudeau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+reliable+whole+blood+freezing+method+for+flow+cytometry+immuno-phenotyping+and+functional+analyses.">An easy and reliable whole blood freezing method for flow cytometry immuno-phenotyping and functional analyses.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 100 (6), 652-665 (2021).</li><li>Thierens, H., Vral, A., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+dosimetry+using+the+micronucleus+assay+for+lymphocytes:+interindividual+differences+in+dose+response.">Biological dosimetry using the micronucleus assay for lymphocytes: interindividual differences in dose response.</a> Health Physics. 61 (5), 623-630 (1991).</li><li>Vral, A., Fenech, M., Thierens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+micronucleus+assay+as+a+biological+dosimeter+of+in+vivo+ionising+radiation+exposure.">The micronucleus assay as a biological dosimeter of in vivo ionising radiation exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 11-17 (2011).</li><li>Vral, A., Thierens, H., Baeyens, A., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+micronucleus+and+G2-phase+assays+for+human+blood+lymphocytes+as+biomarkers+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation:+limitations+imposed+by+intraindividual+variability.">The micronucleus and G2-phase assays for human blood lymphocytes as biomarkers of individual sensitivity to ionizing radiation: limitations imposed by intraindividual variability.</a> Radiation Research. 157 (4), 472-477 (2002).</li><li>Pajic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-individual+variability+in+the+response+of+human+peripheral+blood+lymphocytes+to+ionizing+radiation:+comparison+of+the+dicentric+and+micronucleus+assays.">Inter-individual variability in the response of human peripheral blood lymphocytes to ionizing radiation: comparison of the dicentric and micronucleus assays.</a> Radiation and Environmental Biophysics. 54, 317-325 (2015).</li><li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+inter-laboratory+variation+in+the+scoring+of+micronuclei+and+nucleoplasmic+bridges+in+binucleated+human+lymphocytes:+results+of+an+international+slide-scoring+exercise+by+the+HUMN+project.">Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project.</a> Mutation Research. 534 (1-2), 45-64 (2003).</li><li>Miszczyk, J., Rawoj&#263;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+culturing+technique+on+human+peripheral+blood+lymphocytes+response+to+proton+and+X-ray+radiation.">Effects of culturing technique on human peripheral blood lymphocytes response to proton and X-ray radiation.</a> International Journal of Radiation Biology. 96 (4), 424-433 (2020).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O protocolo modificado para a aplicação do ensaio CBMN é uma maneira relativamente fácil e conveniente de armazenar amostras de sangue a granel. O procedimento descreve todos os detalhes minuciosos, mas importantes, que precisam ser cuidados durante a criopreservação e o ensaio CBMN. Outros protocolos de laboratório normalmente usam 10% de DMSO na mistura de congelamento, enquanto nossa mistura de congelamento contém 20% de DMSO juntamente com 80% de FCS7. Como essa mistura de congelamento é adicionada em volumes iguais à amostra de sangue total, a concentração final também é de 10% de DMSO. Para melhorar a taxa de sobrevivência celular e estimular a divisão celular, adicionamos 1% de piruvato de sódio e 0,1% de beta-mercaptoetanol ao meio de cultura completo (cRPMI). Isso está de acordo com o protocolo de cultura celular estabelecido pelo nosso grupo de pesquisa 6,8.
Embora o problema da aglomeração celular durante o descongelamento não pudesse ser resolvido completamente neste protocolo, a segregação celular foi melhor do que os outros protocolos convencionais. Em vez da adição consistente e abrupta de meios de cultura para recuperar as células após o descongelamento, obtivemos melhores resultados quando PBS pré-aquecido (37 °C) foi adicionado gota a gota durante as etapas de lavagem. Essa melhora ajuda na redução do estresse celular e minimiza a aglomeração com uma alta recuperação comprovada das células. Além disso, nenhuma diferença clara na viabilidade celular pôde ser observada quando PBS foi usado sobre RPMI. Foi validado pelo grupo que a duração do período de criopreservação (até 1 ano) não afetará o rendimento de NM, tanto em amostras irradiadas quanto em não irradiadas 6,8. Estudos sugerem que a boa viabilidade celular e a proliferação de CMSP podem ser alcançadas com o congelamento gradual a baixas temperaturas (nitrogênio líquido), seguido da adição gradual de meio pré-aquecido durante o descongelamento10,11. Pesquisadores mostraram que as subpopulações de linfócitos T no sangue total descongelado são comparáveis àquelas observadas em CMSP descongeladas12. Além disso, está comprovado que os subtipos celulares recuperados de amostras criopreservadas de sangue total são semelhantes aos observados em amostras de sangue total fresco13,14.
Se examinarmos os resultados indicativos obtidos no relato, veremos que o aumento linear quadrático com a dose (Figura 3) está de acordo com outros relatos da literatura sobre micronúcleos induzidos por transferência linear de energia (LET)15,16. A variabilidade nos rendimentos de NM observada nas amostras de sangue total criopreservado (Tabela 1) está em linha com a relatada para hemoculturas a fresco 8,17,18. O protocolo aqui descrito foi validado em sangue total fresco e criopreservado de 20 voluntários sadios8. O índice de divisão nuclear (NDI), importante parâmetro de proliferação celular observado nesserelato8, foi concordante com o sugerido para sangue total fresco19,20. Em conjunto, este protocolo otimizado de criopreservação de sangue total e ensaio de micronúcleo modificado proporciona um melhor rendimento celular e, portanto, a adaptação deste protocolo é recomendada para avaliações de radiossensibilidade. Uma vez que a reprodutibilidade do protocolo já foivalidada8, sugere-se sua aplicabilidade em estudos de larga escala e multicêntricos.

Desde sua descoberta, o uso da radiação ionizante (RI) tem sido motivo de debate entre os pesquisadores devido aos seus efeitos adversos sobre os seres vivos. O efeito prejudicial geralmente se manifesta por danos ao DNA, como quebras de fita dupla (DSBs), e a falha no reparo desses DSBs leva a aberrações cromossômicas e mutações, que são importantes características do câncer 1,2. Tais aberrações cromossômicas podem ser examinadas por ensaios citogênicos, como o ensaio de micronúcleo em bloqueio de citocinese (CBMN). Micronúcleos são fragmentos cromossômicos retardatários que não podem ser incorporados aos núcleos filhas e, portanto, são deixados para trás durante a mitose.
O CBMN é uma técnica citogenética confiável e comumente utilizada para avaliar danos cromossômicos em indivíduos expostos à radiação ionizante in vivo ou in vitro. Sangue total fresco ou células mononucleares isoladas do sangue periférico (PBMCs) podem ser usadas no ensaio CBMN. O sangue total fresco é principalmente o material biológico de escolha, uma vez que o isolamento e o processamento de CMSP podem ser demorados e são acompanhados por uma perda de plasma sérico que atua como meio de suporte para a sobrevivência e crescimento celular. Para alcançar um bom rendimento de células binucleadas, o sangue total fresco deve ser processado imediatamente após a coleta. No entanto, a necessidade de processamento imediato pode ser logisticamente desafiadora durante restrições de tempo. Além disso, quando se supõe que muitas amostras sejam adquiridas por um período prolongado ou coletadas em pontos distantes dos centros de processamento, o armazenamento de amostras de sangue fresco pode ser um fator limitante 3,4.
Além disso, para permitir a análise repetida de NM no mesmo indivíduo/paciente, o congelamento de amostras de sangue seria benéfico. Uma forma de armazenar linfócitos para posterior aplicação do ensaio CBMN é por meio do congelamento de CMSP isoladas 5,6. Essa técnica, no entanto, requer várias etapas de processamento antes que as PBMCs possam ser congeladas. Portanto, a criopreservação de sangue total representaria uma alternativa simples e eficiente em termos de tempo para a criopreservação de CMSP isoladas. Apenas um trabalho relata o uso de sangue total criopreservado para análise de metáfase7.
Como a criopreservação de sangue total ofereceria muitas vantagens no campo do biomonitoramento, biodosimetria e avaliação da radiossensibilidade, nosso grupo otimizou um protocolo de criopreservação para sangue total que permite a aplicação do ensaio CBMN8. Demonstramos que os linfócitos presentes nas hemoculturas criopreservadas mantêm sua integridade genômica e capacidade de proliferação por pelo menos 1 ano. Neste trabalho, descrevemos detalhadamente o procedimento de criopreservação e o protocolo de ensaio CBMN, que foi otimizado por Beyls et al.8, e relatamos os achados obtidos para amostras de sangue congelado de 30 indivíduos saudáveis. Para o ensaio CBMN, as hemoculturas foram irradiadas in vitro com doses de 0,5, 1 e 2 Gy para avaliar a resposta de MN em linfócitos de amostras de sangue total criopreservado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell suspension plate&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% alcohol</td>
			<td>ChemLab</td>
			<td>CL00.1807.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>8,18,75,52,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine orange</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>235474-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>C5670-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1365</td>
			<td>22 x 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobox (Mr.Frosty)</td>
			<td>Nalgene, Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 2ml</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A04573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalsin B&#160;</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>C6762-10</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>D4540-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GURR buffer</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>10582013</td>
			<td>phosphate buffer (pH 6.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>1,04,93,60,250</td>
			<td>75 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>1,04,87,30,250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Li-heparin tubes</td>
			<td>BD Life sciences</td>
			<td>367526-LH170 I.U.</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>fisher scinetific</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO2</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>10,65,80,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>S7653-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Object slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MENZAA00000112E04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000 U/mL + 10,000 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin (PHA-M)</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>52400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber adhesive sealent</td>
			<td>collall</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>11360039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile warm PBS (37 &#176;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>contains NaCl,&#160; Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the micronucleus assay on cryopreserved whole blood

O ensaio in vitro de citocinese-bloco de micronúcleos (CBMN) é uma técnica amplamente utilizada em pesquisas radiobiológicas, dosimetria biológica, estudos de genotoxicidade e testes de radiossensibilidade in vitro . Este método citogenético baseia-se na detecção de micronúcleos em células binucleadas resultantes de fragmentos cromossômicos retardados durante a divisão celular. Amostras de sangue total fresco são o tipo de amostra preferido para o ensaio CBMN. No entanto, as desvantagens de trabalhar com amostras de sangue fresco incluem o processamento imediato após a coleta de sangue e o número limitado de análises repetidas que podem ser realizadas sem amostragem extra de sangue. 
Como a necessidade de amostras de sangue fresco pode ser logisticamente desafiadora, o ensaio CBMN em amostras criopreservadas de sangue total seria de grande vantagem, especialmente em estudos em larga escala com pacientes. Este trabalho descreve um protocolo para congelar amostras de sangue total e realizar o ensaio CBMN nessas amostras de sangue congelado. Amostras de sangue de voluntários saudáveis foram congeladas e descongeladas em diferentes momentos e, em seguida, submetidas a um protocolo modificado de ensaio de micronúcleos. Os resultados demonstram que este procedimento otimizado permite a realização do ensaio CBMN em amostras de sangue congelado. O protocolo de criopreservação descrito também pode ser muito útil para outros ensaios citogenéticos e uma variedade de ensaios funcionais que requerem proliferação de linfócitos.

Ever since its discovery, the use of ionizing radiation (IR) has been a matter of debate among researchers because of its adverse effects on living beings. The detrimental effect is usually manifested by DNA damage such as double-stranded breaks (DSBs), and the failure to repair these DSBs leads to chromosomal aberrations and mutations, which are important hallmarks of cancer1,2. Such chromosomal aberrations can be examined by cytogenic assays such as the cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay. Micronuclei are lagging chromosomal fragments that cannot be incorporated into daughter nuclei and hence, are left behind during mitosis.
CBMN is a commonly used, reliable cytogenetic technique to assess chromosomal damage in individuals exposed to in vivo or in vitro ionizing radiation. Either fresh whole blood or isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) can be used in the CBMN assay. Fresh whole blood is mostly the biological material of choice since the isolation and processing of PBMCs can be time-consuming and is accompanied by a loss of serum plasma that acts as the supporting medium for cell survival and growth. To achieve a good binucleated cell yield, fresh whole blood should be processed immediately after collection. However, the need for immediate processing can be logistically challenging during time constraints. Moreover, when many samples are supposed to be acquired over an extended period or collected at points away from the processing centers, storage of fresh blood samples can be a limiting factor3,4.
Further, to allow repeated MN analysis in the same individual/patient, freezing of blood samples would be beneficial. One way to store lymphocytes for later application of the CBMN assay is by freezing isolated PBMCs5,6. This technique, however, requires several processing steps before the PBMCs can be frozen. Therefore, cryopreservation of whole blood would represent a simple and time-efficient alternative to the cryopreservation of isolated PBMCs. Little information is available concerning the use of frozen whole blood for cytogenetic assays or assays that require the proliferation of lymphocytes. Only one paper reports the use of cryopreserved whole blood for metaphase analysis7.
As cryopreservation of whole blood would offer many advantages in the field of biomonitoring, biodosimetry, and radiosensitivity assessment, our group optimized a cryopreservation protocol for whole blood that allows the application of the CBMN assay8. We demonstrated that lymphocytes present in cryopreserved whole blood cultures retain their genomic integrity and proliferation capacity for at least 1 year. In this methods paper, we describe in detail the cryopreservation procedure and CBMN assay protocol, which was optimized by Beyls et al.8, and report findings obtained for frozen blood samples of 30 healthy individuals. For the CBMN assay, the blood cultures were irradiated in vitro with doses of 0.5, 1, and 2 Gy to assess the MN response in lymphocytes of cryopreserved whole blood samples.

Autor em destaque: Criopreservação de amostras de sangue total para análise de alto rendimento 

O Ensaio do Micronúcleo em Sangue Total Criopreservado

Our research mainly focuses on examining the impact of ionizing radiation on healthy tissues. We are studying the chromosomal radio sensitivity of individuals with cancer and those with DNA repair disorders. Additionally, we are involved in biological dissymmetry, where we assess the DNA damage induced by exposure to ionizing radiation.To advance research in our field, we use automated microscopic systems for high throughput analysis. Fresh whole blood samples are the most preferred sample type for the micronucleus assay, as it is easy to obtain with minimal discomfort for the patient. However, the need for immediate processing can be logistically challenging during time constraints.Freezing of whole blood samples allows repeated analysis without the further need for extra sampling. This procedure is an easy and time-efficient way to store blood samples in large scale and multicenter studies. The protocol of the cryopreservation of whole blood will not only offer advantages for the micronucleus assay, but also for other cytogenetic assays or functional assays that require the proliferation of lymphocytes.

Para validar a reprodutibilidade do protocolo, realizamos o ensaio de MN em amostras de sangue criopreservado de 30 voluntários saudáveis com idades entre 17 e 65 anos. A média de idade do grupo é de 35 anos. O tempo de criopreservação variou de 1 semana a 154 semanas. Após a exposição da cultura de células sanguíneas totais a diferentes doses de radiação (0,5, 1 e 2 Gy), o rendimento de micronúcleos em 1.000 células BN foi examinado ao microscópio. Células binucleadas bem arredondadas (como pode ser visto na Figura 2) indicam uma recuperação bem-sucedida de células viáveis saudáveis de amostras criopreservadas de sangue total. Vale ressaltar que a resposta radiológica dos linfócitos permaneceu estável após armazenamento de longo prazo em temperaturas ultrabaixas (nitrogênio líquido). Esta observação está de acordo com a resposta esperada a partir de amostras de sangue fresco.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig02v2.jpg"> Figura 2: Micronúcleos observados em células binucleadas recuperadas de uma amostra de sangue total congelado que foi criopreservada há 1 ano. (A) Ampliação 200x, (B) Ampliação 400x; Setas apontando para os MNs. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Com o aumento das doses de radiação (0,5, 1 e 2 Gy), observou-se aumento linear-quadrático no rendimento dos micronúcleos (Tabela 1 e Figura 3). Os rendimentos de MN em amostras controle irradiadas simuladas (0 Gy) representam os rendimentos de MN de fundo que são principalmente o resultado de cromossomos atrasados.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Dose (Gy)</td>
			<td>0</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Média</td>
			<td>18</td>
			<td>107</td>
			<td>247</td>
			<td>601</td>
		</tr><tr><td>SD</td>
			<td>10.8</td>
			<td>23.9</td>
			<td>53.3</td>
			<td>101.1</td>
		</tr><tr><td>CV (%)</td>
			<td>59.9</td>
			<td>22.3</td>
			<td>21.6</td>
			<td>16.8</td>
		</tr><tr><td>Gama</td>
			<td>5-41</td>
			<td>62-140</td>
			<td>139-324</td>
			<td>395-755</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Amplitude e coeficiente de variação juntamente com o rendimento médio de NM, como observado em amostras de sangue total criopreservado de 30 doadores saudáveis, indicativo de variabilidade interindividual. Abreviaturas: CV = coeficiente de variação; DP = desvio padrão.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig03.jpg"> Figura 3: Rendimentos de micronúcleos observados em amostras de sangue total criopreservados controle e irradiado de 30 doadores. Os períodos de criopreservação variaram de 1 semana a 154 semanas. O gráfico de gráfico de dispersão mostra valores individuais. As linhas em clusters representam a média ± DP do grupo. Abreviações: MN = micronúcleos; BN = binucleado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para investigar a variação interindividual no rendimento de MN das pessoas, foi calculado o coeficiente de variação (CV) (ver Tabela 1). Para NM induzida por radiação, obteve-se CV < 25% para todas as doses (0,5, 1 e 2 Gy), o que indica boa reprodutibilidade do protocolo modificado.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Whole Blood Samples for High Throughput Analysis at JoVE.com

Apresentamos aqui um protocolo otimizado para o ensaio de micronúcleos em bloqueio de citocinese em amostras criopreservadas de sangue total. Este método otimizado de criopreservação de sangue total para análise de micronúcleos é uma técnica confiável para amostragem em larga escala e estudos multicêntricos e pode ser usado para outros ensaios relacionados ao sangue também.

The in vitro cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay is a widely used technique in radiobiology research, biological dosimetry, genotoxicity studies, ...

Nossa pesquisa concentra-se principalmente em examinar o impacto da radiação ionizante em tecidos saudáveis. Estamos estudando a radiossensibilidade cromossômica de indivíduos com câncer e aqueles com distúrbios de reparo de DNA. Além disso, estamos envolvidos em dissimetrias biológicas, onde avaliamos os danos ao DNA induzidos pela exposição à radiação ionizante.Para avançar a pesquisa em nosso campo, usamos sistemas microscópicos automatizados para análise de alto rendimento. Amostras de sangue total fresco são o tipo de amostra preferido para o ensaio de micronúcleos, pois é fácil de obter com o mínimo de desconforto para o paciente. No entanto, a necessidade de processamento imediato pode ser logisticamente desafiadora durante restrições de tempo.O congelamento de amostras de sangue total permite análises repetidas sem a necessidade adicional de amostragem extra. Esse procedimento é uma maneira fácil e eficiente de armazenar amostras de sangue em estudos multicêntricos e em larga escala. O protocolo de criopreservação de sangue total não só oferecerá vantagens para o ensaio do micronúcleo, mas também para outros ensaios citogenéticos ou ensaios funcionais que necessitem da proliferação de linfócitos.

the-micronucleus-assay-on-cryopreserved-whole-blood

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Micronucleus Assay on Cryopreserved Whole Blood

2.2K visualizações.  Ghent University. Nossa pesquisa concentra-se principalmente em examinar o impacto da radiação ionizante em tecidos saudáveis. Estamos estudando a radiossensibilidade cromossômica de indivíduos com câncer e aqueles com distúrbios de reparo de DNA. Além disso, estamos envolvidos em dissimetrias biológicas, onde avaliamos os danos ao DNA induzidos pela exposição à radiação ionizante.Para avançar a pesquisa em nosso campo, usamos sistemas microscópicos automatizados para análise de alto re...

Vídeo: Autor em destaque: Criopreservação de amostras de sangue total para análise de alto rendimento 

The in vitro cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay is a widely used technique in radiobiology research, biological dosimetry, genotoxicity studies, and in vitro radiosensitivity testing. This cytogenetic method is based on the detection of micronuclei in binucleated cells resulting from chromosomal fragments lagging during cell division. Fresh whole blood samples are the most preferred sample type for the CBMN assay. However, the disadvantages of working with fresh blood samples include immediate processing after blood collection and the limited number of repeated analyses that can be performed without extra blood sampling. 
As the need for fresh blood samples can be logistically challenging, CBMN assay on cryopreserved whole blood samples would be of great advantage, especially in large-scale patient studies. This paper describes a protocol to freeze whole blood samples and to perform the CBMN assay on these frozen blood samples. Blood samples from healthy volunteers have been frozen and thawed at different time points and then, subjected to a modified micronucleus assay protocol. The results demonstrate that this optimized procedure allows the performance of the CBMN assay on frozen blood samples. The described cryopreservation protocol may also be very useful for other cytogenetic assays and a variety of functional assays requiring proliferating lymphocytes.

Here we present an optimized protocol for the cytokinesis-block micronucleus assay on cryopreserved whole blood samples. This optimized method of cryopreservation of whole blood for micronucleus analysis is a reliable technique for large-scale sampling and multi-center studies and can be used for other blood-related assays as well.

Pesquisa do câncer

Thawing and Culturing Cryopreserved Blood for Cytokinesis Assay

Descongelamento e Cultura de Sangue Criopreservado para Ensaio de Citocinese

Cytokinesis-Block Micronucleus Assay on Irradiated Blood Cell Culture Prepared from Cryopreserved Whole Blood Samples

Ensaio de Micronúcleo em Bloco de Citocinese em Cultura de Células Sanguíneas Irradiadas Preparadas a partir de Amostras de Sangue Total Criopreservadas