Esta pesquisa foi financiada em parte pelo Instituto Nacional de Saúde sob os números de prêmio R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 e concessão da NSF CBET 2150798. Os autores agradecem à Oficina de Máquinas RIT pela fabricação de moldes de alumínio. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health.

Este projeto pode ser usado em vários modos com base em requisitos experimentais e nas preferências do usuário final. Antes de cada experimento, consulte o fluxograma de decisão apresentado na Figura 2 para determinar as etapas e módulos necessários para o protocolo. Por exemplo, se o usuário pretende manter o formato de poço aberto durante um experimento para compará-lo diretamente com o sistema do tipo Transwell, o estêncil de padronização não é necessário para a semeadura de células. O módulo central está disponível comercialmente (consulte Tabela de Materiais), e a nanomembrana ultrafina pode ser selecionada de uma biblioteca de materiais com diferentes porosidades e tamanhos de poros para atender às necessidades experimentais.
1. Fabricação do estêncil de padronização
NOTA: O estêncil de padronização serve para posicionar as células exclusivamente na região porosa do chip de membrana, impedindo que as células se instalem na camada de silício circundante, onde poderiam sofrer danos após a adição do módulo de fluxo16 (consulte a Figura 3). Danos à monocamada podem afetar adversamente a integridade da barreira e comprometer os resultados experimentais. O estêncil é desnecessário em uma cultura aberta e estática, pois não há risco de danos.
<ol><li>Compre, usine ou imprima um molde em 3D usando o design fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 1 (Figura 4A). NOTA: As paredes do estêncil são cônicas para aumentar a capacidade da mídia e minimizar o aprisionamento de bolhas em comparação com os recursos de parede reta de alta taxa de aspecto.</li>
	<li>Anexe um filme adesivo sensível à pressão (PSA) de 130 μm a uma folha de acrílico de 3,2 mm usando um rolo frio (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>O corte a laser da folha de acrílico de acordo com o projeto fornecido no Supplementary Coding File 2 para criar uma matriz de cavidades (Figura 4B).</li>
	<li>Retire a camada protetora da película de PSA e prenda a folha de acrílico ao molde. NOTA: Certifique-se de que a folha cortada a laser esteja alinhada com o molde de modo que as características do molde estejam centralizadas dentro da cavidade (Figura 4C). A precisão do posicionamento celular na membrana depende dessa etapa.</li>
	<li>Misture completamente o pré-polímero PDMS (usando uma proporção de base para catalisador de 10:1) (consulte a Tabela de Materiais) e desgaseifique-o em uma câmara de vácuo até que não restem bolhas visíveis (5-15 min).</li>
	<li>Despeje lentamente o PDMS nas cavidades do molde, nivelando-o com uma borda plana. NOTA: Para evitar o aprisionamento de bolhas, despeje o PDMS em cada cavidade lentamente. Se houver bolhas após o derramamento, coloque o molde na câmara de vácuo e desgaseifique-o novamente.</li>
	<li>Curar o PDMS numa placa de aquecimento a 70 °C durante 1 h e, em seguida, deixá-lo arrefecer até à temperatura ambiente.</li>
	<li>Extrair os estênceis das cavidades do molde usando pinças de ponta plana.</li>
</ol>2. Fabricação do módulo de fluxo
NOTA: O módulo de fluxo compartilha uma pegada semelhante com o poço em forma de trevo do módulo central e inclui um microcanal moldado (largura = 1,5 mm, altura = 0,2 mm, comprimento = 5 mm). A forma do trevo auxilia no alinhamento do canal sobre a região de cultura porosa (Figura 5).
<ol><li>Use técnicas padrão de litografia suave18 para criar um molde de silício com características definidas pelo projeto fornecido no Supplementary Coding File 3 (Figura 4D).</li>
	<li>Anexe um filme PSA de 130 μm a uma folha de acrílico de 3,2 mm de espessura.</li>
	<li>O corte a laser da folha de acrílico com base no desenho dado no Arquivo de Codificação Suplementar 4 para criar uma matriz de cavidades em forma de trevo (Figura 4E). NOTA: A altura da cavidade determina a altura do módulo de fluxo, que deve ser ligeiramente mais alto (por 0-0,1 mm) do que a altura do poço do módulo central para garantir a vedação adequada.</li>
	<li>Remova a camada protetora da película PSA e, em seguida, conecte a folha cortada a laser ao molde de silicone alinhando as marcas de alinhamento triangular no molde de silicone com as da folha cortada a laser. NOTA: Semelhante ao passo 1.4, certifique-se de que a folha de acrílico cortada a laser esteja alinhada com o molde de silicone de modo que as características do molde estejam centralizadas dentro de cada cavidade (Figura 4F). Esta etapa determina a posição do microcanal em relação à pegada.</li>
	<li>Despeje lentamente o PDMS desgaseificado nas cavidades do molde e nivele-o com uma borda plana. NOTA: Se houver bolhas após o derramamento, desgaseifique o molde até que as bolhas sejam removidas.</li>
	<li>Coloque o molde em uma placa de aquecimento e asse o PDMS a 70 °C por 1 h, em seguida, deixe o molde esfriar até a temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova cuidadosamente os módulos de fluxo das cavidades do molde usando pinças de ponta plana.</li>
	<li>Orientar o módulo de fluxo com as características do microcanal voltadas para cima e posicionar as portas de entrada e saída do núcleo no final do canal usando um punção de biópsia (consulte a Tabela de Materiais).</li>
</ol>3. Fabricação de carcaças de acrílico inferior e superior
NOTA: O módulo principal se encaixa na carcaça inferior. A atração entre ímãs embutidos nas carcaças comprime e sela o módulo de fluxo para o módulo central (Figura 6).
<ol><li>Corte a laser uma folha de acrílico de 2 mm usando o design fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 5 para criar a carcaça superior com furos para inserção de ímã.</li>
	<li>Fixe um filme PSA de 130 μm a uma folha de acrílico de 3,5 mm.</li>
	<li>Corte a laser a folha de acrílico com base no design dado no Arquivo de Codificação Suplementar 6 para criar a carcaça inferior com furos para inserção de ímã. NOTA: A espessura da carcaça inferior é um parâmetro crítico e deve corresponder à espessura total do módulo central para evitar fugas durante o fluxo.</li>
	<li>Remova a camada protetora PSA e fixe a carcaça inferior a uma tampa de vidro.</li>
	<li>Encaixe ímãs de neodímio niquelados de 4,75 mm (ver Tabela de Materiais) nos orifícios cortados a laser das carcaças. NOTA: Certifique-se de que os ímãs nas caixas inferior e superior sejam colocados com polaridade oposta para garantir a atração magnética (Figura 6).</li>
</ol>4. Fabricação do circuito de fluxo
NOTA: O circuito de fluxo em circuito fechado contém dois frascos de coleta de amostras como reservatórios (Figura 7). O reservatório de entrada possui um filtro de difluoreto de polivinilideno (PVDF) para permitir que o meio celular se equilibre com a concentração de CO2 na incubadora.
<ol><li>Use um punch de biópsia de 1 mm para criar dois orifícios na tampa de um frasco de coleta de amostra.</li>
	<li>Use punções de biópsia para criar dois orifícios (1 mm e 4 mm) na tampa de um frasco de coleta de amostra separado e crie um orifício de 1 mm na parte inferior deste frasco.</li>
	<li>Insira pontas dosadoras de 20 G em cada um dos orifícios de 1 mm e seque-os com cola quente.</li>
	<li>Coloque um filtro PVDF de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais) no orifício de 4 mm e sele com cola quente.</li>
	<li>Corte a laser uma folha de acrílico de 1,5 mm usando o design fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 7 para criar um estágio de retenção de amostra.</li>
	<li>Posicione os reservatórios sobre o palco de acrílico.</li>
	<li>Conecte as pontas de dosagem usando tubos de microfluxo (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Conecte os tubos à entrada e saída do módulo de fluxo usando ponteiras dosadoras de 21 G.</li>
	<li>Utilize uma bomba peristáltica (consulte a Tabela de Materiais) para a circulação do fluxo. NOTA: Bombas de seringa ou pneumáticas também podem ser usadas para introduzir fluxo, se desejado. O caudal deve ser determinado com base nas necessidades experimentais. Uma tabela abrangente, derivada de um modelo COMSOL validado experimentalmente, é fornecida na Tabela Suplementar 1 para ajudar os usuários a selecionar a vazão necessária para atingir a tensão de cisalhamento desejada na monocamada celular16.</li>
</ol>5. Semeadura celular
NOTA: Semelhante às inserções de membrana convencionais, diferentes tipos de células podem ser cultivados na nanomembrana. Um tipo celular secundário também pode ser co-cultivado do outro lado da membrana no canal inferior15.
<ol><li>Revestir a membrana com 5 μg/cm2 de fibronectina (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente durante 1 h para melhorar a fixação celular. NOTA: O tipo de célula escolhido pode influenciar o revestimento necessário e a densidade celular. O procedimento descrito aqui é para células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs, ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Aspirar a solução de revestimento usando uma pipeta P200 e colocar um estêncil de padronização no poço do módulo central.</li>
	<li>Adicione mídia celular ao canal de poço e inferior do dispositivo.</li>
	<li>Seme HUVECs a uma densidade de 40.000 células/cm2 no poço. NOTA: HUVECs nesta densidade tipicamente formam uma monocamada confluente após 24 h de incubação16,19.</li>
	<li>Coloque o dispositivo em uma placa de Petri. Adicione uma tampa de tubo cônico de 15 mL com água DI à placa de Petri para manter a umidade local.</li>
	<li>Transfira a placa de Petri para a incubadora. NOTA: A mídia celular no poço superior e no canal inferior do dispositivo deve ser trocada a cada 24 h. Para alterar a mídia no canal inferior, injete suavemente a mídia nova em uma das portas para deslocar a mídia antiga da outra porta.</li>
</ol>6. Reconfiguração para modo microfluídico
<ol><li>Esterilize a carcaça superior, a carcaça inferior, o módulo de fluxo, reservatórios, tubos e pontas de dosagem, colocando-os em uma câmara de esterilização UV por 30 minutos antes da montagem. Circular etanol 70% e, em seguida, PBS estéril no circuito de fluxo.</li>
	<li>Encher os reservatórios e tubos com meios de crescimento de células endoteliais (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Coloque a carcaça inferior no estágio de amostragem. Insira o módulo principal de poço aberto na caixa inferior.</li>
	<li>Aspirar o meio celular do poço do módulo. Coloque o módulo de fluxo no poço.</li>
	<li>Coloque a carcaça superior para selar bem o módulo de fluxo no módulo principal. Conecte as pontas dosadoras de entrada e saída às portas do módulo de fluxo.</li>
	<li>Ligue a bomba peristáltica para introduzir o fluxo de fluido no sistema.</li>
</ol>7. Realização de análise a jusante em formato de poço aberto após a introdução do fluxo
NOTA: O tempo de cultura aqui depende dos objetivos experimentais. Os usuários podem realizar análises a jusante (por exemplo, imunocitoquímica, extração de RNA) nos formatos de poço aberto ou microfluídico com base em sua preferência. Por exemplo, se preferir um formato de poço aberto, o sistema deve ser reconfigurado para conduzir ensaios baseados em protocolos padrão16,19.
<ol><li>Pare a bomba quando o tempo desejado para exposição ao fluxo de cisalhamento for atingido. Remova as pontas dosadoras de entrada e saída.</li>
	<li>Remova a carcaça superior. Remova suavemente o módulo de fluxo do poço usando uma pinça.</li>
	<li>Adicione 100 μL de meio celular ao poço. Realizar ensaios desejados com base em protocolos padronizados.</li>
</ol>

Uma plataforma de tecido de barreira reconfigurável com modos de poço aberto e microfluídico

<ol>
	<li>Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+the+Endothelial+Barrier:+Identifying+and+Reconciling+Controversies.">Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies.</a> Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).</li><li>Vera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+tissue+barrier+models+on+hydrogel+microfluidic+platforms.">Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).</li><li>Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+blood-brain+barrier+model+provides+in+vivo-like+barrier+properties+for+drug+permeability+screening.">Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).</li><li>Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+barrier+tissues+in+vitro:+methods,+achievements,+and+challenges.">Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges.</a> eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).</li><li>Kaisar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+experimental+models+of+the+blood-brain+barrier+for+CNS+drug+discovery.">New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+microphysiological+system+(PREDICT-96)+to+recapitulate+hepatocyte+function+in+dynamic,+re-circulating+flow+conditions.">A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions.</a> Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).</li><li>Ayuso, J. M., Virumbrales-Mu&#241;oz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+microfluidic+systems+in+precision+medicine.">A role for microfluidic systems in precision medicine.</a> Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).</li><li>Katt, M. E., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+building+in+physiological+complexity.">In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organs-on-chips+for+disease+modelling,+drug+development+and+personalized+medicine.">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).</li><li>Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+reframing+biological+enquiry.">Microfluidics: reframing biological enquiry.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (9), 554-567 (2015).</li><li>Williams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost,+rapidly+integrated+debubbler+(rid)+module+for+microfluidic+cell+culture+applications.">A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications.</a> Micromachines. 10 (6), 360 (2019).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+fiber+anisotropy+within+natural+collagen+hydrogels.">Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+3D+collagen+gels+with+independently+tunable+fiber+anisotropy+and+directionality.">Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality.</a> Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).</li><li>&#321;ach, A., Wnuk, A., W&#243;jtowicz, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+to+study+the+functions+of+the+blood-brain+barrier.">Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier.</a> Bioengineering. 10 (5), 519 (2023).</li><li>McCloskey, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Modular+&#181;SiM:+A+mass+produced,+rapidly+assembled,+and+reconfigurable+platform+for+the+study+of+barrier+tissue+models+in+vitro.">The Modular &#181;SiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).</li><li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modular+&#181;sim+reconfigured:+integration+of+microfluidic+capabilities+to+study+in+vitro+barrier+tissue+models+under+flow.">The modular &#181;sim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).</li><li>Hudecz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+using+an+ultrathin+silicon+nitride+membrane-based+microfluidic+device.">Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).</li><li>Joshi, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineering+3D+Collagen+Matrices+with+Tumor-Mimetic+Gradients+in+Fiber+Alignment.">Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Hsu, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniaturized+3D+printed+pressure+regulator+(&#181;PR)+for+microfluidic+cell+culture+applications.">A miniaturized 3D printed pressure regulator (&#181;PR) for microfluidic cell culture applications.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).</li><li>Rogers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+bilayer+co-culture+platform+to+study+endothelial-pericyte+interactions.">A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions.</a> Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).</li><li>Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passing+the+vascular+barrier:+endothelial+signaling+processes+controlling+extravasation.">Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).</li><li>Wang, Y. I., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UniChip+enables+long-term+recirculating+unidirectional+perfusion+with+gravity-driven+flow+for+microphysiological+systems.">UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems.</a> Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).</li><li>Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Go+with+the+flow&amp;#34;:+how+Kr&#252;ppel-like+factor+2+regulates+the+vasoprotective+effects+of+shear+stress.">34;Go with the flow&amp;#34;: how Kr&#252;ppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).</li><li>Satoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumatic+pressure-driven+multi-throughput+microfluidic+circulation+culture+system.">A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system.</a> Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).</li><li>Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reversibly+sealed,+easy+access,+modular+(seam)+microfluidic+architecture+to+establish+in+vitro+tissue+interfaces.">A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces.</a> PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+extensional+flows+promote+long-range+fiber+alignment+in+3D+collagen+hydrogels.">Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels.</a> Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).</li><li>Hasan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fabrication+of+flexible+nanotextured+PDMS+as+a+substrate+for+selective+cell+capture.">One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture.</a> Biomedical Physics &amp; Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineering+3D+collagen+hydrogels+with+long-range+fiber+alignment.">Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment.</a> Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).</li></ol>

J.L.M. é co-fundador da SiMPore, Inc., e detém uma participação acionária na empresa. A SiMPore está comercializando as tecnologias à base de silício ultrafino, incluindo as membranas utilizadas neste estudo.

O objetivo deste protocolo é desenvolver um método prático para incorporar capacidades de fluxo em uma plataforma de poço aberto com uma nanomembrana ultrafina. Neste projeto, uma abordagem de travamento magnético é utilizada, permitindo alternar entre os modos de poço aberto e fluídico durante os experimentos e combinando as vantagens de ambas as abordagens. Ao contrário das plataformas convencionais com ligação permanente, o travamento magnético permite que a plataforma seja desmontada em pontos conveniente...

As barreiras vasculares servem como uma interface crítica que separa o compartimento sanguíneo do tecido circundante. Desempenham papel fundamental na preservação da homeostase, atraindo células imunes, controlando a permeabilidade molecular e blindando contra a intrusão de patógenos no tecido 1,2. Modelos de cultivo in vitro têm sido desenvolvidos para mimetizar o microambiente in vivo, permitindo investigações sistemáticas sobre os fatores e condições que afetam as propriedades de barreira tanto em estados saudáveis quanto doentes 3,4.
A abordagem mais utilizada para tais modelos de cultura é a configuração Transwell-like "open-well"5, onde uma membrana de cultura porosa e condicionada por trilhos separa compartimentos preenchidos por meios (Figura 1A). Neste formato, as células podem ser semeadas em ambos os lados da membrana, e uma ampla gama de protocolos experimentais foi desenvolvida. No entanto, esses sistemas são limitados em sua capacidade de fornecer os fluxos de fluidos essenciais para suportar a maturação da barreira e mimetizar a circulação de células imunes observadas in vivo 5,6. Consequentemente, não podem ser utilizados para estudos que necessitem de fluxos dinâmicos que introduzam doses de fármacos, estimulação mecânica ou tensões de cisalhamento induzidas por fluidos 6,7,8.
Para superar as limitações dos sistemas de poço aberto, plataformas microfluídicas que combinam membranas de cultura porosas com canais fluídicos endereçáveis individualmente foram desenvolvidas9. Essas plataformas oferecem controle preciso sobre o roteamento de fluidos, perfusão e introdução de compostos químicos, estimulação de cisalhamento controlada e capacidade de adição dinâmica de células 7,10,11,12,13. Apesar das capacidades avançadas proporcionadas pelas plataformas microfluídicas, elas não têm sido amplamente adotadas nos laboratórios de biociências devido aos complexos protocolos microfluídicos e sua incompatibilidade com fluxos de trabalho experimentais estabelecidos4,10,14.
Para preencher a lacuna entre essas tecnologias, apresentamos um protocolo que emprega um sistema baseado em módulos reconfigurável magneticamente. Este sistema pode ser facilmente alternado entre os modos de poço aberto e microfluídico com base nas necessidades específicas do experimento. A plataforma possui um dispositivo de poço aberto, conhecido como m-μSiM (sistema microfisiológico modular habilitado por uma membrana de silício), com uma membrana de cultura de 100 nm de espessura (nanomembrana). Esta nanomembrana possui alta porosidade (15%) e transparência semelhante a vidro, como ilustrado na Figura 1B. Ele separa fisicamente o compartimento superior de um canal inferior, permitindo o transporte molecular através de escalas de comprimento fisiológico15. Ao contrário das membranas convencionais gravadas por trilhos, que têm desafios conhecidos na obtenção de imagens de células vivas com imagens de campo claro, as propriedades ópticas e físicas favoráveis da nanomembrana permitem a visualização clara das células em ambos os lados da superfície da membrana 15,16,17.
O presente protocolo descreve a fabricação de módulos especializados de semeadura e fluxo e explica a reconfiguração magnética da plataforma. Isso demonstra como a plataforma pode ser empregada para estabelecer barreiras endoteliais em condições estáticas e dinâmicas. Esta demonstração revela que as células endoteliais alinham-se ao longo da direção do fluxo, com uma upregulation de alvos gênicos sensíveis ao cisalhamento sob estimulação de cisalhamento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 x 0.86 Micro Flow tubes</td>
			<td>Langer Instruments</td>
			<td>WX10-14 &#38; DG Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS 7.4 pH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG20-1.5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG21-1.0HPX-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>3M9726-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>3M9720-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488 conjugated phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems&#160;TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ64100-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K171</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 1/16&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8589K31</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 3/32&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K191</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 7.64&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Fibronectin, Human, 1 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47743-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixture A1&#38;A2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixture B1&#38;B2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4374966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C0035C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>D31</td>
			<td>3/16&#34; dia.&#160;x 1/16&#34; thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>aa47392-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Langer Instruments</td>
			<td>BQ50-1J-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 developer solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF syringe filters</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2542913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University wafer,USA</td>
			<td>1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0702369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Pierce 20x PBS Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100500-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI-reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrathin Nanoporous Membrane Chip</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NPSN100-1L</td>
			<td>The design is&#160; compatible with all of SiMPore membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uSiM component 1</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uSiM component 2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transforming static barrier tissue models into dynamic microphysiological systems

Sistemas microfisiológicos são plataformas de cultura celular miniaturizadas usadas para mimetizar a estrutura e função de tecidos humanos em laboratório. No entanto, essas plataformas não ganharam ampla adoção em laboratórios de biociências, onde abordagens baseadas em membranas de poço aberto servem como padrão-ouro para mimetizar barreiras teciduais, apesar de não terem capacidade de fluxo de fluidos. Esse problema pode ser atribuído principalmente à incompatibilidade dos sistemas microfisiológicos existentes com protocolos e ferramentas padronizadas desenvolvidas para sistemas de poço aberto.
Aqui, apresentamos um protocolo para a criação de uma plataforma reconfigurável baseada em membrana com uma estrutura de poço aberto, capacidade de aumento de fluxo e compatibilidade com protocolos convencionais. Este sistema utiliza uma abordagem de montagem magnética que permite a comutação reversível entre os modos de poço aberto e microfluídico. Com essa abordagem, os usuários têm a flexibilidade de iniciar um experimento no formato de poço aberto usando protocolos padrão e adicionar ou remover recursos de fluxo conforme necessário. Para demonstrar o uso prático desse sistema e sua compatibilidade com técnicas padrão, uma monocamada de células endoteliais foi estabelecida em um formato de poço aberto. O sistema foi reconfigurado para introduzir fluxo de fluido e, em seguida, mudou para o formato de poço aberto para conduzir a imunomarcação e extração de RNA. Devido à sua compatibilidade com protocolos convencionais de poço aberto e capacidade de aumento de fluxo, espera-se que este projeto reconfigurável seja adotado por laboratórios de engenharia e biociências.

Vascular barriers serve as a critical interface that separates the blood compartment from the surrounding tissue. They play a critical role in preserving homeostasis by attracting immune cells, controlling molecular permeability, and shielding against the intrusion of pathogens into the tissue1,2. In vitro culture models have been developed to mimic the in vivo microenvironment, enabling systematic investigations into the factors and conditions that impact barrier properties in both healthy and diseased states3,4.
The most widely used approach for such culture models is the Transwell-like &#34;open-well&#34; configuration5, where a porous, track-etched culture membrane separates media-filled compartments (Figure 1A). In this format, cells can be seeded on either side of the membrane, and a wide range of experimental protocols has been developed. However, these systems are limited in their ability to provide the fluid flows essential for supporting barrier maturation and mimicking immune cell circulation seen in vivo5,6. Consequently, they cannot be used for studies requiring dynamic flows that introduce drug doses, mechanical stimulation, or fluid-induced shear stresses6,7,8.
To overcome the limitations of open-well systems, microfluidic platforms that combine porous culture membranes with individually addressable fluidic channels have been developed9. These platforms offer precise control over fluid routing, perfusion, and the introduction of chemical compounds, controlled shear stimulation, and dynamic cell addition capabilities7,10,11,12,13. Despite the advanced capabilities provided by microfluidic platforms, they have not seen widespread adoption in bioscience laboratories due to complex microfluidic protocols and their incompatibility with established experimental workflows4,10,14.
To bridge the gap between these technologies, we present a protocol that employs a magnetically reconfigurable, module-based system. This system can be easily switched between open-well and microfluidic modes based on the specific needs of the experiment. The platform features an open-well device, known as m-&#181;SiM (modular microphysiological system enabled by a silicon membrane), with a 100 nm thick culture membrane (nanomembrane). This nanomembrane possesses high porosity (15%) and glass-like transparency, as illustrated in Figure 1B. It physically separates the top compartment from a bottom channel, allowing for molecular transport across physiological length scales15. Unlike conventional track-etched membranes, which have known challenges in imaging live cells with bright-field imaging, the nanomembrane&#39;s favorable optical and physical properties enable clear visualization of cells on either side of the membrane surface15,16,17.
The present protocol outlines the fabrication of specialized seeding and flow modules and explains the magnetic reconfiguration of the platform. It demonstrates how the platform can be employed to establish endothelial barriers under both static and dynamic conditions. This demonstration reveals that endothelial cells align along the flow direction, with an upregulation of shear-sensitive gene targets under shear stimulation.

Autor em destaque: Desenvolvendo um sistema microfisiológico modular exclusivo para imitar o tecido de barreira humana

Transformando Modelos de Tecidos de Barreira Estática em Sistemas Microfisiológicos Dinâmicos

O módulo central de poço aberto é inicialmente posicionado dentro de uma cavidade específica criada por uma carcaça inferior e uma lamínula, como ilustrado na Figura 6A. Posteriormente, o módulo de fluxo, que inclui um microcanal e portas de acesso, é inserido no poço do módulo principal. O módulo de fluxo é selado firmemente contra a camada de suporte de silício da membrana devido à força de atração magnética entre os ímãs embutidos nas carcaças inferior e superior, con...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing a Unique Modular Microphysiological System to Mimic Human Barrier Tissue at JoVE.com

Este protocolo descreve uma plataforma de cultura celular baseada em membrana reconfigurável que integra o formato de poço aberto com recursos de fluxo de fluido. Esta plataforma é compatível com protocolos padrão e permite transições reversíveis entre os modos de cultura de poço aberto e microfluídica, acomodando as necessidades dos laboratórios de engenharia e biociências.

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. ...

Estamos desenvolvendo sistemas microfisiológicos modulares que imitam tecidos de barreira humana. Nosso sistema é único porque pode ser reconfigurado de uma cultura estática de poço aberto para um sistema aprimorado de fluxo. Essa flexibilidade permite que a plataforma seja usada tanto em laboratórios focados em biociências quanto em engenharia.Apresentamos um protocolo para a criação de uma plataforma de poço aberto reconfigurável com cultura aprimorada por fluxo e imagens de estilo de vida. É compatível com protocolos convencionais de biociência. Nosso design reconfigurável permite que os usuários alternem entre os modos de poço aberto e microfluídico durante um experimento, e permite que o usuário conduza cada etapa usando um formato com o qual se sinta confortável.

transforming-static-barrier-tissue-models-into-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transforming Static Barrier Tissue Models into Dynamic Microphysiological Systems

723 visualizações.  Rochester Institute of Technology. Estamos desenvolvendo sistemas microfisiológicos modulares que imitam tecidos de barreira humana. Nosso sistema é único porque pode ser reconfigurado de uma cultura estática de poço aberto para um sistema aprimorado de fluxo. Essa flexibilidade permite que a plataforma seja usada tanto em laboratórios focados em biociências quanto em engenharia.Apresentamos um protocolo para a criação de uma plataforma de poço aberto reconfigurável com cultura aprimorada por fluxo e imagens ...

Vídeo: Autor em destaque: Desenvolvendo um sistema microfisiológico modular exclusivo para imitar o tecido de barreira humana

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. However, these platforms have not gained widespread adoption in bioscience laboratories where open-well, membrane-based approaches serve as the gold standard for mimicking tissue barriers, despite lacking fluid flow capabilities. This issue can be primarily attributed to the incompatibility of existing microphysiological systems with standard protocols and tools developed for open-well systems.
Here, we present a protocol for creating a reconfigurable membrane-based platform with an open-well structure, flow enhancement capability, and compatibility with conventional protocols. This system utilizes a magnetic assembly approach that enables reversible switching between open-well and microfluidic modes. With this approach, users have the flexibility to begin an experiment in the open-well format using standard protocols and add or remove flow capabilities as needed. To demonstrate the practical usage of this system and its compatibility with standard techniques, an endothelial cell monolayer was established in an open-well format. The system was reconfigured to introduce fluid flow and then switched to the open-well format to conduct immunostaining and RNA extraction. Due to its compatibility with conventional open-well protocols and flow enhancement capability, this reconfigurable design is expected to be adopted by both engineering and bioscience laboratories.

This protocol describes a reconfigurable membrane-based cell culture platform that integrates the open-well format with fluid flow capabilities. This platform is compatible with standard protocols and allows for reversible transitions between open-well and microfluidic culture modes, accommodating the needs of both engineering and bioscience laboratories.