BS foi apoiado pela Universidade de Milão-Bicocca Verão Student programa de investigação, a investigação contou com o apoio de fundos do Ministério italiano da Saúde e Ministério da Educação italiano, Universidade e Pesquisa e Fondazione Humanitas para GC; que graças Michael VG Latronico para ler criticamente a manuscrito.

1. Manutenção Feeder livre e Passaging de linhagens de células iPS humanas <ol><li> Preparar os pratos Matrigel revestidos. Descongelar um frasco de Matriz CES qualificado humano em gelo durante uma hora e dilua em 25 ml de meio DMEM-F12. Adicionar 1 ml de cada uma das placas 35 mm (ou quantidades equivalentes por unidade de área de superfície, se são utilizados outros pratos), mantendo-se tudo em gelo e assegurando que todas as placas e tubos são pré-arrefecida. Cubra as placas com papel alumínio. </li></ol> Nota: As concentrações variam de acordo com imagens de Matrigel do lote. Instruções de diluição são indicados na folha de dados. <ol start="2"><li> Manter as placas em gelo durante a noite e remover o gelo no dia seguinte. As placas podem ser mantidas no frigorífico até uma semana antes da utilização. </li><li> Preparar o meio completo mTESR1 (ou descongelar um frasco de meio de Nutristem) e o H-ESM (médio CES humana), de acordo com a tabela abaixo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> CONC FINAL </td><td> Por 500 ml </td></tr><tr><td> Knockout Serum Replacement (KSR) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 2mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Não essenciais MEM aminoácidos </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> 100 U / mL - 0,1 mg / mL </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> 0,1 mM </td><td> 900 mL </td></tr><tr><td> B27 Suplemento - sem Vitamina </td><td> 1% </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> N2 Supplement </td><td> 1% </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> - </td><td> 370 ml </td></tr></tbody></table> Banco de meio pode ser armazenado a 4 ° C durante não mais de 2 semanas. Para preparar o meio de crescimento completo, o FGF básico é adicionado imediatamente antes da suaalimentação e numa concentração final de 20 ng / ml. </li></ol> Nota: Complete H-ESM condicionado em fibroblastos de rato embrionárias podem ser usados ​​em vez de mTESR1 ou Nutristem para as células iPS. <ol start="4"><li> Colocar as placas revestidas em uma incubadora a 37 ° C durante 30 minutos a 2 horas antes da passaging. </li><li> As células devem ser passadas aproximadamente a cada 5 dias, ainda que não tenham atingido a confluência. Colônias não devem tocar. </li><li> Substituir o meio de crescimento com 1 ml de dispase (1 mg / ml, dissolver de um mg / ml de stock 10 em PBS). </li><li> Remover diferenciar áreas com puxados pipetas Pasteur de vidro. As áreas que devem ser removidos incluem estruturas em cratera cística ou no centro de colónias, e quaisquer áreas onde as células foram separadas a partir de colónias e achatada e parecem estar a migrar para fora. </li><li> Incubar a 37 ° C, sob uma capa de cultura até as fronteiras de colónias tornam-se mais brilhante e começar a separar (normalmente cerca de 5-7 minutos). Discard dispase. Lavar com 1 ml H-ESM e descartar. </li><li> Em 1 ml H-ESM, use um levantador de celular (espátula como raspador) para colônias de colheita e recolher em um tubo Eppendorf de 15 ml. Lavar com 1 ml de H-AGE e adicionar ao tubo. Girar a 1,000 rcf durante 4 min e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de crescimento pré-aquecido (ou mTESR1 ou Nutristem). Evite quebrar pedaços muito - pipeta cima e para baixo, com menos de 6-8x. Determine quantas células deve ser banhado e remover as células desnecessárias (geralmente 1:04 ou 1:05 diluição), por exemplo, para duas placas de 1:5, remover 600 mL, em seguida, adicionar 1,6 ml de meio fresco. </li><li> Remover Matrigel a partir de placas. Células lugar gota a gota, distribuindo uniformemente sobre a placa. Evite apertar o tubo em excesso, pois isso fará com que as células a se mover em direção ao centro. </li><li> Lave tubo com 1 ml de meio e dividir entre as placas. O volume final em cada uma das placas deve ser de 1,5 -2 mL. </li><li> Alterar meio todos os dias, exceto no dia seguinte passaging. Embora sejaideal para mudar o meio de todos os dias, isso pode ser mudado ocasionalmente com uma freqüência de uma vez a cada dois dias, se não mais de 2-3 dias se passaram desde a última passagem sem afetar o potencial de pluripotência e diferenciação. </li><li> Se a linha de célula deve ser congelado, voltar a suspender em vez em 1-2 ml de meio de congelação mFreSR usando uma pipeta de 2 ml e colocar 1 ml / cryovial. Colocar os frascos num cryobox a -80 ° C e a transferência de azoto líquido em 3-4 dias. </li></ol> Nota: microdissecção manual de células iPS deve ser realizada sob um microscópio estereoscópico. A fertilização in vitro (FIV) da estação de trabalho (por exemplo uma estação de trabalho de FIV KSystem) integrado com um estereomicroscópio permite a manipulação das células em condições estéreis, enquanto que eles são mantidos em uma área de superfície aquecida. Se este não está disponível, um estereomicroscópio pode ser transportada sob uma capa habitual de fluxo laminar. 2. Embryoid Corpos Agregação e Cardiac Induction <ol><li> Prepara EBM-20 meio de acordo com a tabela abaixo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> CONC FINAL </td><td> Por 500 ml </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino (origem América do Sul) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Aminoácidos não essenciais MEM </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Penicilina - estreptomicina </td><td> 100U/ml - 0,1 mg / mL </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> 50um </td><td> 450 mL </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 ml </td></tr></tbody></table> Utilização de FBS da América do Sul origem é crítico para a determinação da eficiência de diferenciação: o emprego de outros tipos de soros podem afectaro processo de diferenciação. Para preparar EBM-20, ácido ascórbico complemento completo (AA), a uma concentração final de 50 ug / ml. Meio de crescimento completo pode ser armazenado a 4 ° C durante não mais do que uma semana. </li><li> Colheita iPS colónias tal como descrito acima (etapas 1,6-1,9). </li><li> Ressuspender suavemente em 1 ml de EBM-20 com uma pipeta de 2 ml. Evite quebrar pedaços muito - pipeta cima e para baixo, não mais do que 2 a 3 vezes, verificar o tamanho das colônias sob o microscópio estereoscópico. Placa em placas ultra-baixas de fixação na proporção de 1:1 (por exemplo, por um prato de 35 mm, utilizar um poço de uma placa de 6 poços). Enxaguar tubo com 1 mL de EBM-20 e adicionar ao prato. </li></ol> Nota: O tamanho das colónias de afectar o processo de diferenciação, controlar a eficiência e tempo de indução cardíaca. Agregação de homogeneamente médias EB foram mostrados para reduzir a variabilidade observada durante a diferenciação. <ol start="4"><li> No dia 3, alterar EBM-20 uma vez usando um microscópio para evitar removal da EBS. Mantenha pipeta junto da borda do prato e retire médio. </li><li> Nos dias 7, interruptor EBS para placas revestidas com gelatina a 0,1% e previamente colocada a 37 ° C durante 30 min. Se necessário, a gelatina pode ser removido e as placas deixada sob um capuz de cultura de células S / N. Adicionar 35-40 EBs por 35 milímetros prato. </li><li> Verifique EBs para bater áreas e mudança EBM-20 duas vezes por semana. Marque áreas onde batendo estão localizados na parte superior da tampa do prato, para facilitar a localização em que o microscópio estereoscópico. Áreas contratantes deve aparecer após cerca de 10-20 dias. </li><li> Quando as áreas com contração espontânea aparecer, mude de médio a EBM-2 (como preparar EBM-20, com 2% de FBS vez) e isolá-los, conforme descrito abaixo na seção 3. </li><li> Continue a verificar outras áreas para bater e mudar média duas vezes por semana até áreas batendo são necessários para novas experiências. </li></ol> Nota: A eficiência do processo de diferenciação é altamente dependentevários factores, o mais importante dos quais são as linhas de células específicas e o lote de soro usado para induzir a diferenciação cardíaca. Para se obter a máxima eficiência, as linhas celulares de teste para potencial cardiomiogênica e vários lotes de soro. 3. Batendo áreas de isolamento e Cultura <ol><li> Casaco placas de 12 poços (4 cm 2 de área) ou as placas de interesse com 5 ug / cm 2, fibronectina diluída em PBS para perfazer o volume suficiente para cobrir toda a superfície completamente (total de 300 ul por poço em placas de 12 poços). Mantenha descoberto na capa de cultura de células e deixe secar. As placas podem ser embalados e armazenados a 4 ° CO / N. </li><li> Remover área utilizando um copo de bater puxado pipeta Pasteur e bisturi, conforme necessário. Transfira para placas revestidas com fibronectina com um pipeta de 1 ml. </li><li> Adicionar 1 mL de EBM-2. </li><li> Atravessar fora da placa para indicar as áreas onde as células foram removidas e mudar o meio. As placas podem ser mantidos por até 1 mês, como outras áreas podem começar bcomer mais tarde. </li></ol> Nota: Se forem necessários pedaços menores batendo, pipetar a área explantada cima e para baixo várias vezes sob a lupa, até que quebre em pedaços menores. Isto irá resultar em aglomerados de algumas células batimento (ver o filme 3). <ol start="5"><li> Mudar meio duas vezes por semana até que esteja pronto para as análises. </li></ol> Nota: Os cardiomiócitos obtidos com este protocolo, possuem características morfológicas e funcionais semelhantes fetal; maturação para um adulto fenótipo semelhante pode ser obtido através do aumento do tempo em cultura para diferenciar ainda mais essas células. 4. Único batendo celas de isolamento e Análise <ol><li> Casaco lâminas 2-câmara (4 cm 2 de área) ou outros suportes apropriados, com 5 ug / cm 2 fibronectina diluído em PBS suficiente para cobrir toda a superfície de cultura. Se for usado um suporte de vidro, revestimento com laminina e fibronectina (5 ug / cm &lt;sup&gt; 2 cada). </li><li> Remover área batendo com uma pipeta de Pasteur / bisturi a partir das placas da secção 3. </li><li> Utilizando uma pipeta de 1 ml, transferir as células para um tubo de 15 ml contendo 500 ul de colagenase II (480 U / ml em PBS com Ca e Mg) e incubar 15 min a 37 ° C, agitando o tubo, uma vez durante a incubação. </li><li> Pipeta cima e para baixo com uma pipeta de 200 mL. Se qualquer aglomerados permanecer, a transferência para novo colagenase II e repita o passo 4.3. </li><li> Repita o passo 4.4 até que não haja grandes aglomerações são deixados. </li><li> Inativar colagenase com 3 ml de EBM-2 (sem AA). O tubo pode ser deixado sob o capô em um rack aquecida até outros tubos estão prontos. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (diluído a partir de um estoque a 0,5% em PBS 1X) e incubar a 37 ° C durante 5 min. Combinar as fracções a partir de digestões com a mesma amostra inicial. </li><li> Inativar tripsina com 4 ml de EBM-2 (sem AA). Passe as células através de uma agulha de 18G em uma seringa de 2,5 ml não mais than 7x. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de EBM-2 por poço e a placa. As células podem ser usadas para análises funcionais e morfológicas de 2-3 dias após o plaqueamento. </li></ol>

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	<li>Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+and+cardiovascular+diseases:+a+genetic+tool+for+manipulating+cardiomyocyte+differentiation+and+function.">Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function.</a> Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).</li><li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circulation Research. 111, 344-358 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132, 537-543 (2008).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+iPS+cells.">A fresh look at iPS cells.</a> Cell. 137, 13-17 (2009).</li><li>Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+models+for+genetic+cardiovascular+disorders.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders.</a> Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li><li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465, 808-812 (2012).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).</li><li>Yazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+investigate+cardiac+phenotypes+in+Timothy+syndrome.">Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome.</a> Nature. 471, 230-234 (2011).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+with+patient-specific+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+the+cardiac+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+through+promoting+the+proliferation+of+cardiac+progenitor+cells.">Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells.</a> Cell Research. 22, 219-236 (2012).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes.">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).</li></ol>

Não há interesses financeiros para divulgar.

As células estaminais pluripotentes têm o potencial para se diferenciar espontaneamente em CMs, embora com eficiência baixa e alta variabilidade entre linhas. O desenvolvimento de novos métodos de indução tem, portanto, destinado a melhorar a eficiência do processo e movendo-se para mais protocolos definidos. No entanto, a maioria destes novos métodos de diferenciação são bastante complexas, exigindo condições de elaborar a cultura, um bom controle de tempo e concentração de reagentes e tratamento com cit...

Historicamente, a investigação dos mecanismos genéticos e moleculares de promoção do desenvolvimento humano e da doença tem sido baseados na geração de modelos animais geneticamente modificados. No entanto, vários fenótipos humanos não ser replicado com sucesso em ratos, principalmente por causa das diferenças biológicas existentes entre as duas espécies. Por outro lado, o acesso aos tecidos humanos podem ser limitados e muitas vezes não o suficiente para permitir que o material seja obtido em estudos experimentais em profundidade. O campo da biologia cardiovascular sofre de ambas as seguintes limitações: a fisiologia do coração humano é significativamente diferente da do rato, e uma quantidade significativa de tecido do coração é acessível apenas post-mortem ou durante a cirurgia cardíaca. Encontrar uma fonte ideal para a diferenciação funcional CMs humana tornou-se assim um tópico central na biologia cardiovascular, e tem sido feito muito esforço para resolver este problema. Têm sido propostos vários tipos de células, imioblastos esqueléticos ncluding, células cardíacas locais estaminais, células mononucleares de medula óssea, células progenitoras endoteliais, e de células estaminais mesenquimais. No entanto, os dados obtidos usando estas células não foram consistentes 4. A derivação de células estaminais embrionárias humanas (ESC) 5 primeiros ea descoberta inovadora de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) por Yamanaka e Thomson 6,7 tarde parecia fornecer soluções: estas células têm a capacidade de crescer indefinidamente e o potencial para dar subir a todos os derivados de células de as três camadas germinais, incluindo o MC. A utilização de células iPS oferece ainda outras vantagens: sendo derivadas de células adultas autólogas, que carregam o mesmo genoma que o indivíduo ou paciente a partir do qual eles são derivados. Por conseguinte, permitem o desenvolvimento de modelos in vitro que facilitam a investigação de doenças e dos mecanismos de desenvolvimento genéticas humanas. Em virtude dessa característica, as células iPS também pode overcome problemas relacionados à rejeição imunológica e questões éticas 8. Por estas razões, embora CES ainda representam o padrão ouro no campo da biologia de células-tronco, pesquisadores do mundo inteiro estão agora movendo-se mais para a tecnologia de células iPS. iPS estão agora a ser utilizados para modelar doenças humanas in vitro para várias condições, incluindo desordens cardiovasculares congénitos 9,10. Recentemente, a aplicação da modelagem de doença das células iPS foi realizado para doenças cardíacas monogênicas (ou seja, longos síndromes do QT, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgico) e patologias em que os defeitos cardíacos fazem parte de um fenótipo complexo (ie Leopard e síndromes Timóteo, cardiomiopatia dilatada). Estes relatórios confirmaram que as células iPS específicas do paciente, que são diferenciadas em CMs apresentam características fenotípicas e funcionais semelhantes como a doença in vivo. No entanto, existemainda muitos desafios para melhorar a eficácia de induzir as células iPS na linhagem cardíaca. Geração espontânea de CMs do CES humanos através de formação de agregados chamados corpos embrióides (EBS) provaram 17 bem-sucedida. Desde esta descoberta, têm sido propostos muitos outros métodos. Muitos grupos têm melhorado muito a eficiência do protocolo de diferenciação e deslocaram-se para os reagentes cultura quimicamente definidos e produtos de origem animal-free (veja Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) para uma revisão completa de todos os métodos existentes 3 ). No entanto, o método clássico baseado na EB agregação ainda representa o mais comumente empregado para a realização de estudos funcionais e investigar os mecanismos da doença. Nosso protocolo proposto é baseado na agregação de células iPS em EB e da cultura, na presença de soro e de ácido ascórbico, a qual foi mostrada para aumentar o processo de diferenciação cardíaca e positively impactar a maturação destas células 18,19. Neste artigo, vamos passar por essa metodologia em detalhe e vai mostrar como usar linhas de células iPS alimentador livres para gerar paciente específico CMs iPS derivadas.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Media and Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Human ESC-qualified Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Thaw the 5 ml bottle at 4 &amp;deg;C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 &amp;deg;C .</td></tr><tr><td>Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution</td><td>Sigma</td><td>F0896-2MG</td><td>Working concentration: 5 &amp;mu;g/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td>Working concentration: 5 &amp;mu;g/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>PBS (no Mg and Ca), 10X</td><td>Lonza</td><td>BE17-515F</td><td></td></tr><tr><td>PBS (with Mg and Ca), 10X</td><td>Bio Sera</td><td>XC-S2067/500</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, neutral protease, grade II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 &amp;deg;C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA, 0.5%</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type 2</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td>Dilute to 480 U/ml (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Thaw at 4 &amp;deg;C, aliquot and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>F&amp;#8211;tal Bovine Serum (origin South America)</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 &amp;deg;C, heat-inactivate at 56 &amp;deg;C for 30 min, aliquot and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA, 100X</td><td>Invitrogen</td><td>11140-135</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement, 50X</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin, from porcine skin</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Make stock at 1% in water, store at -20 &amp;deg;C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td>Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 &amp;deg;C. Do not keep complete medium at 4 &amp;deg;C for more than 1 week</td></tr><tr><td>Nutristem hESC XF</td><td>Stemgent from Biological Industries</td><td>05-100-1A</td><td>Thaw at 4 &amp;deg;C O/N, aliquot and store at -20 &amp;deg;C until use. Aliquots may be kept at 4 &amp;deg;C for no more than a week.</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5853</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>A4544-25G</td><td>Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 &amp;deg;C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Plasticware&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>35 mm culture dishes</td><td>Becton Dickinson</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning Incorporated</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Becton Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Permanox 2-well chamber slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Glass 2-well chamber slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates, ultra-low-attachment surface</td><td>Corning Incorporated</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>18G needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Glass pasteur pipettes, 230 mm</td><td>VWR International</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>300188</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>IVF Workstation</td><td>KSystem, by Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ1500 Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of human cardiomyocytes: a differentiation protocol from feeder-free human induced pluripotent stem cells

A fim de investigar os eventos de promoção do desenvolvimento do coração e para determinar os mecanismos moleculares que conduzem a doenças do miocárdio em seres humanos, é necessário, antes de gerar cardiomiócitos humanos funcionais (CMS). A utilização destas células na descoberta de medicamentos e estudos de toxicologia é também altamente benéfico, permitindo novas moléculas farmacológicas para o tratamento de desordens cardíacas a ser pré-clinicamente validado em células de origem humana. Dos possíveis fontes de CMS, células estaminais pluripotentes induzidas (iPS) estão entre os mais promissores, como elas podem ser derivadas directamente a partir de tecido do paciente facilmente acessíveis e possuir uma capacidade intrínseca para dar origem a todos os tipos de células do corpo 1. Foram propostos vários métodos para diferenciar as células iPS em CMs, desde os corpos embrióides clássicos (EBS) abordagem de agregação de protocolos de constituição química definida 2,3. Neste artigo, propomos um protocolo baseado em EBs e mostrar como este metodod podem ser empregues para gerar eficientemente células CM-funcionais, como a partir de células iPS alimentador livres.

Em nossos estudos geramos CMs de várias linhagens de células iPS. Estas linhas foram geradas inicialmente numa camada alimentadora MEF mas foram imediatamente colocadas em Matrigel utilizando um meio quimicamente definido (ou mTESR1 ou Nutristem). Vários ensaios foram usados ​​para verificar a manutenção das propriedades morfológicas, a expressão de marcadores típicos de células pluripotentes (OCT-4, e SSEA4 TRA1-60) e à sua estabilidade do genoma (figura 1). I...

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Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Células-tronco pluripotentes, tanto as células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas (iPS), constituem uma valiosa fonte de células diferenciadas humanos, incluindo os cardiomiócitos. Aqui, vamos nos concentrar na indução cardíaco de células iPS, mostrando como usá-los para obter os cardiomiócitos humanos funcionais através de um protocolo de corpos baseada embryoid.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

The overall goal of this procedure is to differentiate human cardiomyocytes from human IPS cells cultured in feeder free conditions. This is accomplished by first plating IPS cells into ultra low attachment plates to form embryo bodies. The second step of the procedure is to transfer the formed embryo bodies into gelatin coated dishes.When contracting areas appear, they are manually dissected under the stereo microscope and plated onto fibronectin coated dishes. For further differentiation, the final step is to obtain single cardiomyocytes by enzymatic digestion of contracting clusters. Ultimately, results can show differentiation of cardiomyocyte like cells that express typical structural markers, IE cardiac troponin through immunofluorescence microscopy.This method can help answer a key question in the cardiovascular biology field, such as, which are the mechanism driving cardio differentiation and dysfunction during cardio development and diseases at the level of the human cardiomyocyte. This is a very interesting technique because it allows the generation of cardiomyocytes in vitro from human patients and human individuals. And in the second instance, it allows the recapitulation of the disease in the test tube so that new drugs can be experimented in vitro before going in vivo.Experimentation Begin with confluent IPS cell cultures grown on 35 millimeter matrigel coated plates. Replace the growth medium with one milliliter of PBS containing a milligram of diss. Examine the cells using polled glass pipettes.Remove regions with differentiated cells such as crater like or cystic structures in the center of colonies. Also remove any areas where the cells have separated, flattened, and seem to be migrating outwards. Now incubate the remaining cells at 37 degrees Celsius under a culture hood until the colony borders become brighter and begin to detach.This usually takes between five and seven minutes. At this point, remove the dispa solution and wash the cells with one milliliter of HESM. Then discard the wash solution.In a fresh milliliter of HESM, use a cell lifter to harvest the colonies. Collect the colonies into a 15 milliliter tube. Next, rinse the cells with another milliliter of HESM and spin them down at 1000 times G for four minutes.Then proceed with plating the cells on matrigel and change the media daily during culturing. Begin by harvesting undifferentiated IPS colonies as described in the previous section. Once the undifferentiated populations have been isolated, gently resus suspend them in one milliliter of EBM 20.Using a two milliliter pipette, don't break up the cell clumps too much. Limit the pipetting to two or three strokes. Check the size of the colonies under the stereoscope between strokes.When the colonies are all about the same size, they need no further mixing. Now plate the cells on ultra low attachment plates filling one six well plate per plate of cells harvested. Don't forget to rinse the tube with one milliliter of EBM 20 and distribute the rinse to the plate.After the third day of incubation, change the media using a microscope to avoid removal of embryo bodies. Keep the pipette close to the edge of the plate. On the seventh day, move the embryo bodies to plates coated with 0.1%Gelatin warmed at 37 degrees Celsius for 30 minutes.Add 35 to 40 embryo bodies to each 35 millimeter dish in two milliliters of medium. During the culturing. Change the medium twice a week regularly.Check the embryo bodies for beating areas and mark out where beading areas are located. On the top of the dish cover beading contracting areas should appear after approximately 10 to 20 days. When areas with spontaneous contraction appear, switch their medium to EBM two After the contracting areas appear, keep culturing and monitoring other areas on the plate for up to a month.In total. In EBM two Deficiency of the differentiation process is highly dependent on several factors, the most critical of which are the specific cell lines and the batch of serum used to induce cardio differentiation. To obtain highest efficiency test several lines for the cardiogenic potential and various batches of serum Begin by coating 12.Well plates with five micrograms per square centimeter of fibronectin in PBS 300 microliters per well should completely cover each well's surface. Allow the plates to dry uncovered in a cell culture hood. To remove the beading area of the cell culture, use a pulled glass pipette and scalpel.Then using a one milliliter pipette transfer four to five clamps to each well of a fibronectin coated plate. Once all the collections have been made, add one milliliter of EBM two to the loaded wells on the collection plate mark areas where cells were removed. Then change the medium and return the plate to the culture hood.If smaller beating clumps are required under a stereo microscope, pass the explanted areas through a pipette. This produces small clusters containing a few beating cells. In culture.Change the medium twice weekly until thes are ready for analysis. First, prepare four centimeters square two chamber slides by coating them with 20 micrograms of fibronectin diluted in enough PBS to cover the surface. If a glass support is used, add an additional 20 micrograms of laminin.Isolate the bead culture area as previously described. Using a one milliliter pipette, transfer the cells to a 15 milliliter tube containing 500 microliters of collagenase tube. Incubate the cells for 15 minutes and shake the tube once during the incubation.After 15 minutes, move the cells through a 200 microliter pipette to remove clumps if any clumps remain. Transfer the cells to fresh collagenase two and repeat the incubation when no large clumps are left. End the digestion by adding three milliliters of EBM two without as soic acid as they are each prepared.Store the tubes in a heated rack under the hood, then centrifuge them at 1000 times G for four minutes at room temperature. Once centrifuged, make a suspension of the cell fractions from the same initial sample in a milliliter of 0.25%trypsin EDTA in PBS. Then incubate the suspension for five minutes in the heated block, inactivate the trypsin with four milliliters of E BM two without as soic acid.Next, pass the cells through an 18 gauge needle on a 2.5 milliliter syringe up to seven times until no big clumps are visible under the microscope. Then centrifuge the cells at 1000 times G for four minutes. Now resuspend the cell pellet in E BM two and plate them on two well chamber slides.The cells will be ready for analyses after two to three days of incubation. CMS were generated from several IPS cell lines. These lines were initially generated on a meth feeder layer and immediately placed on matrigel using a defined medium.The cells showed a human ESC like morphology with phase bright edges and prominent nuclei. Immunofluorescence analysis showed the IPS cells correctly expressed the transcription factor T four and expressed the TRA one 60 surface antigen. Cyto fluoro metric analysis confirmed the expression of typical surface pluripotency antigens, SS EEA four and TRA one 60.The gating strategy is shown in the left scatter. A karyotype analysis of the IP FS cells grown on matrix gel was also performed. Induction into the cardiac lineage was triggered by the aggregation of the IPS cells into ebs, along with culturing in the presence of a specific type of serum.And as sorbic acid contracting areas represented 20 to 35%of the total culture depending on the cell line used. Contracting CMS were isolated from these regions by enzymatic digestion and analyzed for protein expression. R-T-P-C-R found expression of cardiac specific ion channels expressed in the IPS derived beating cells, but not in non beating cells.These channels included an alpha one, a subunit of a voltage dependent calcium channel, an alpha subunit of a type five voltage gated sodium channel, a potassium voltage gated channel of the KQT, like subfamily, and both forms of myosin. Heavy chain immunofluorescence analysis revealed that single IPS derived cardiomyocytes expressed the structural proteins, alpha sarcomeric, actin, cardiac troponin I, and the cardiac specific junction, conexion 43. After all, this technique really paved the way for the modeling of myocardial diseases in vitro and allows the experimentation of drugs in the human setting without injecting the drug in the human bodies.After watching this video, you should have a good understanding of how to maintain IPS cells in free free conditions and to differentiate them into cardiomyocyte through a method based on embryo bodies aggregation.

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