Os autores gostaria de agradecer Gregory Haller (Mount Saint Vincent University), por seu trabalho preliminar no desenvolvimento do protocolo. Os autores também gostaria de agradecer a Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) por seus conhecimentos técnicos e assistência com a filmagem e produção da parte do áudio/visual do manuscrito. Daniel Andrews foi suportado pelo financiamento do MSVU e as ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC) através de um prêmio de pesquisa de estudante de graduação. Tamara A. Franz-Odendaal é suportada por um fundo de descoberta NSERC.

Nota: Para estágios do embrião, utilizam o Hamburger e Hamilton12 (HH) tabela de preparo.
1. o embrião incubação
<ol><li>Incube os ovos fertilizados de galinha numa incubadora estéril, controlo de temperatura em 37 ° C ± 1 ° C e ~ 40% de umidade.</li>
	<li>Vire os ovos 1 x por dia e permitir que incube ao HH34 (fertilização pós de 8 dias).</li>
</ol>2. preparação e esterilização dos materiais
<ol><li>Para 12 embriões, autoclave 2 L de água destilada, 1 L de solução salina de garota de 0,85%, 12 pipetas de vidro, 1 caixa de tecido de papel, 24 2,5 x 2,5 cm quadrados de papel de filtro semi porosa e praças 24 2,5 x 2,5 cm de fio de aço de malha com as bordas curvadas para baixo. Para esterilizar os materiais, autoclave-los a 121 ° C durante pelo menos 15 minutos. Nota: A esterilização dos materiais pode ser feita com antecedência.</li>
	<li>Esterilize a incubadora com etanol 70% limpando os lados, prateleiras e porta. Coloque 2 recipientes plásticos contendo autoclavado destilaram água dentro da incubadora para manter a umidade. Escaldar a incubadora de cultura a 37 ° C ± 1 ° C e ~ 40% de umidade. Certifique-se da que incubadora está completamente escura; se a porta for transparente, cubra com papel alumínio.</li>
	<li>Escaldar a 100 mL de meio nutritivo e 1 mL de penicilina, colocando-os na incubadora de cultura.</li>
	<li>Cobrir a área de trabalho com uma toalha de papel e esterilizar o banco por pulverização com etanol a 70%. Esterilize 2 pares de pinças, tesouras de dissecação, uma lâmina de barbear e uma colher de plástico com etanol a 70% de forma semelhante.</li>
	<li>Pratos de Petri estéril 100mm lugar 12 e 24 pratos de Petri estéril 35mm no banco para uso. Certifique-se de que pratos permanecem num saco estéril até o uso.</li>
</ol>3. embrião preparação
Nota: A partir deste momento, use uma máscara de protecção contra o pó para evitar a contaminação das culturas. Uma infecção bacteriana ou fúngica vai estragar a cultura... e há um risco de se espalhar rapidamente a todas as culturas na incubadora.
<ol><li>Crack abrir o ovo e transferir o embrião para um prato de Petri de 100mm contém solução salina 0,85% garota. Estágio o embrião de acordo com as características anatômicas descritas no Hamburger e Hamilton encenando orientações12 e confirmar o embrião está no HH34.</li>
	<li>Cortar o pescoço e depois dividem a cabeça do embrião na linha usando uma lâmina de barbear esterilizada. Usando a pinça estéril, remova o cérebro. Deixe o bico intacto.</li>
</ol>4. cultura Setup
<ol><li>2 lugar dos pratos de Petri 35mm dentro de um prato de Petri de 100 mm.</li>
	<li>Coloca uma malha de arame de aço no interior de cada prato de Petri de 35 mm.</li>
	<li>Usando fórceps, transferi 1 das cabeças bisseccionadas para um pedaço de papel de filtro semi porosas de 2,5 x 2,5 cm com o olho virado para cima. Certifique-se o tecido é seguro e não escorregar inclinando-o ligeiramente.</li>
	<li>Usando a pinça, coloque cuidadosamente o tecido do olho e o papel de filtro em cima da malha de arame de aço em 1 dos pratos Petri 35mm, criando um palco Erguido com o tecido do olho em cima.</li>
	<li>Repita as etapas de 4.3 e 4.4, com a outra metade de cabeça.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta de vidro estéril, cuidadosamente adicione meio nutritivo diretamente em cada placa de Petri 35mm até atingir o nível do filtro de papel. Não mergulhe a cabeça meia no meio de nutrientes.</li>
	<li>Adicione 50 µ l de 10.000 U/mL de penicilina-estreptomicina no meio de nutrientes em cada placa de Petri.</li>
	<li>Dobre um pedaço de papel de seda em um pequeno quadrado e coloque-a dentro do prato de Petri de 100mm. Umedecê-la com água destilada esterilizada.</li>
	<li>Coloque o prato de cultura dentro da incubadora estéril, escura em 37 ° C ± 1 ° C e ~ 40% de umidade por até 4 dias.</li>
	<li>Repita as etapas 3 e 4 para cada embrião. Nota: O número de embriões necessários dependerá da experiência específica; aqui, descrevemos o protocolo para 12 embriões.</li>
</ol>5. cultura manutenção
<ol><li>Uma vez por dia, encha os recipientes de plástico na incubadora com água destilada esterilizada.</li>
	<li>Verifique diariamente todas as culturas para infecções bacterianas ou fúngicas. Culturas que têm desintegrou-se ou em que o meio mudou de cor estão infectadas. Descarte todas as culturas que estão infectadas.</li>
</ol>6. fixação
<ol><li>Após o cultivo, remover todos os pratos da incubadora.</li>
	<li>Usando um par de pinças, remova suavemente o olho do papel de filtro, tomando cuidado para não rasgar o tecido.</li>
	<li>Reparar o tecido do olho em paraformaldeído 4% em 1x tampão fosfato salino durante a noite a 4 ° C ou em formol a 10% neutro de buffer durante a noite em temperatura ambiente.</li>
	<li>Armazene o tecido a 4 ° C em 1 x fosfato salino.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+the+development+of+scleral+ossicles+in+the+chicken,+Gallus+gallus.">Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus.</a> Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).</li><li>Scholey, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+biology+of+feather+follicles.">The developmental biology of feather follicles.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48, 181-191 (2004).</li><li>Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+understanding+of+the+epithelial+requirement+for+osteogenesis+in+scleral+mesenchyme+of+the+embryonic+chick.">Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick.</a> Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).</li><li>Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+cultures+of+embryonic+rat+tongue+support+tongue+and+gustatory+papilla+morphogenesis+in+vitro+without+intact+sensory+ganglia.">Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).</li><li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development.">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo faz uso de tecido estabelecido técnicas de cultivo para o crescimento de um olho galinha embrionário dia 8 (HH34) em vitro por 4 dias. Este método de cultivo a grade foi originalmente descrito por Trowell15. Nós aperfeiçoamos um protocolo de Pinto e do Hall 1991 estudo16 utilizando uma membrana semi porosa com a grade para estudar sinais indutivos entre camadas de tecido separada da galinha embrionários olho15. Usando es...

A galinha embrionária (Gallus gallus) é um organismo de excelente modelo comumente usado no campo da biologia. Seu período de incubação é de aproximadamente 21 dias e muitos ovos podem ser incubados simultaneamente, tornando a experimentação rápida e eficiente. Talvez mais importante, o embrião é também facilmente manipulado, permitindo o estudo extensivo de processos-chave do desenvolvimento e dos genes e proteínas que impulsionam estes processos.
O olho embrionárias de galinha é um órgão complexo que se desenvolve através da interação de um número de diferentes tecidos semelhantes a muitos outros sistemas do corpo. Esse método permite que o estudo do desenvolvimento desses tecidos, particularmente em estágios avançados de desenvolvimento. Por exemplo, a retina multi-camadas pode ser de particular interesse para os que estudam o desenvolvimento do sistema nervoso. Métodos alternativos que permitem o estudo de outros tecidos oculares, tais como a córnea, o corpo de vitreal, a lente, a esclera e as pálpebras são de benefício para os investigadores. O olho embrionárias de galinha também contém uma série de ossos chatos, os ossículos scleral, que podem ser usados como um modelo para o estudo da indução óssea intramembranosa e ossificação em vertebrados1.
Atualmente, existem vários métodos utilizados para estudar o desenvolvimento embrionário. Microinjeções de inibitórios anticorpos ou outras moléculas inibidoras2,3, cirurgicamente microbeads embebido em inibidor4e eletroporação5 são todos os métodos que podem ser usados para downregulate genes ou proteínas de interesse em um embrião. Métodos similares são usados para upregulate proteínas. Esses métodos não são sem suas limitações. Por exemplo, ao usar produtos químicos para alterar o desenvolvimento embrionário, os efeitos letais sobre o embrião devem ser avaliados, e isso limita o uso dos métodos acima mencionados para sites localizados de aplicação em doses baixas o suficiente para garantir a sobrevivência da embrião.
In vitro , tecido cultivo tem sido utilizado em uma ampla gama de organismos, para estudar o desenvolvimento e pode ser usado para contornar algumas das limitações acima mencionadas. Por exemplo, os fêmures6, pena botões7,8e membros9 do frango todos foram estudadas usando tecido cultivo métodos, como têm os testículos de rato10 e as raízes e caules de plantas11. Esses métodos concedem cientistas um alto grau de controle sobre o desenvolvimento de tecidos, tais como a capacidade de variar a temperatura e alterar a disponibilidade de nutrientes. O isolamento do tecido do embrião inteiro também torna muito menos suscetíveis aos efeitos letais de produtos químicos, permitindo estudos de manipulação em escala global em altas concentrações. Outra vantagem notável em vitro cultivo é a preservação do ambiente celular do tecido; o arranjo dos tecidos permanece relativamente inalterado, tornando possível estudar as interações entre diferentes tecidos tipos9. Assim, em vitro abre portas adicionais experimental de cultivo se aproxima não disponível nos modelos no vivo ou no ovo .
Atualmente, estudar o desenvolvimento do olho embrionárias de galinha usando produtos químicos é particularmente desafiadora. Um número de membranas extraembryonic cobre o embrião, tornando difícil aplicar microbeads ou produtos químicos; o embrião também é muito ativo dentro do ovo, como ele fica mais velho, complicando ainda mais um método já difícil. Este protocolo permite acesso fácil para os olhos e seus tecidos circundantes, eliminando as barreiras, proporcionando também novas oportunidades para examinar os processos de desenvolvimento dentro do olho. Este protocolo foi criado para estudar a indução de scleral ossículos dentro do olho embrionário.

<table><tbody><tr><td>35 mm cell culture petri dishes</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic</td></tr><tr><td>100 mm cell culture petri dishes</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic</td></tr><tr><td>paper tissue</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton</td></tr><tr><td>wire mesh</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm)</td></tr><tr><td>disposable glass pipettes</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>Borosilicate glass disposable 5 3/4&quot;</td></tr><tr><td>nutrient medium</td><td>Gibco</td><td>12591-038</td><td>Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB)</td></tr><tr><td>penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised</td></tr><tr><td>filter paper</td><td>Whatman</td><td>1454 090</td><td>semi-porous filter paper 90mm</td></tr><tr><td>fertilized chicken eggs</td><td>Dalhousie University Agricultural College</td><td>n/a</td><td>can be obtained from local farms</td></tr><tr><td>sodium chloride (NaCl)</td><td>EMD</td><td>SX0420-3</td><td>sodium chloride crystals, reagent grade</td></tr><tr><td>1 L glass bottle</td><td>VWR</td><td>89000-240</td><td>1 L pyrex autoclavable glass bottle</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP82011</td><td>70% molecular biology grade</td></tr><tr><td>tupperware containers</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought and sterilized with EtOH</td></tr><tr><td>disposable razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>single edge industrial razor blades (surgical carbon steel)</td></tr><tr><td>plastic spoons</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought and sterilized with EtOH</td></tr><tr><td>dust mask</td><td>3M</td><td>n/a</td><td>3M 8500 Comfort Mask</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>paraformaldehyde, reagent grade, crystalline</td></tr><tr><td>neutral-buffered formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>72210</td><td>10% neutral buffered formalin</td></tr><tr><td>phosphate buffered saline (PBS)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.4mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>15 ml falcon tubes</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td>presterilized centrifuge tubes</td></tr><tr><td>forceps</td><td>FST</td><td>n/a</td><td>fine forceps</td></tr><tr><td>chick saline&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td>n/a&amp;nbsp;</td><td>0.85% NaCl</td></tr><tr><td>tinfoil</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought</td></tr><tr><td>paper towel</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought</td></tr></tbody></table>

organotypic culture method to study the development of embryonic chicken tissues

A galinha embrionária é comumente usada como um organismo modelo confiável para o desenvolvimento de vertebrados. Sua acessibilidade e incubação curta período é ideal para a experimentação. Atualmente, o estudo destas vias do desenvolvimento do embrião de galinha é realizado através da aplicação de inibidores e drogas em locais localizados e em baixas concentrações, usando uma variedade de métodos. Em vitro tecido cultivo é uma técnica que permite o estudo dos tecidos separados do organismo hospedeiro, enquanto ao mesmo tempo ignorando muitas das limitações físicas presentes ao trabalhar com embriões inteiro, tais como a susceptibilidade de embriões para altas doses de substâncias químicas potencialmente letais. Aqui, apresentamos um organotypic cultivo protocolo para cultivo a galinha embrionários meia cabeça em vitro, que apresenta novas oportunidades para o exame de processos de desenvolvimento, além dos métodos actualmente estabelecidos.

Usando esse método, olho embrionárias de galinha pode ser cultivado desde o dia 8 do seu desenvolvimento (HH34) em vitro por 4 dias. Quatro dias de desenvolvimento no ovo corresponde ao HH38.
Este método de cultivo apoia o desenvolvimento de brotos de pena em torno do olho e nas pálpebras (figura 1B). Estes botões de penas não estão presentes no ovo em HH34 antes do...

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Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

Aqui, apresentamos um organotypic cultivo protocolo para crescer órgãos embrionárias de galinha in vitro. Usando esse método, o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha pode ser estudado, mantendo um alto grau de controle sobre o ambiente de cultura.

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

organotypic-culture-method-to-study-development-embryonic-chicken

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