В естественных изображений из глубоких слоях коры использованием микропирамид

Резюме

Под прямым углом микропризм вставляется в коре головного мозга мыши позволяет производить глубокое изображение нескольких коркового слоя с точки зрения обычно можно найти в срез. Один-миллиметровых микропризм предлагаем широкое поле сектор обзора (~ 900 мкм) и пространственным разрешением достаточно для разрешения дендритных шипиков. Мы показываем слой V нейронов изображений и неокортекса сосудистой визуализации с использованием микропризм.

Аннотация

Мы представляем протокол для прижизненного изображения корковой ткани с помощью глубокой сканирование мозга зонд в форме микропирамид. Микропризм являются 1-мм и отражающим покрытием на гипотенузе, чтобы внутреннее отражение возбуждения и испускания света. Микропирамид датчик изображения одновременно несколько слоев коры с перспективой как правило, рассматривается только в часть препаратов. Изображения, собранные с большого поля-обзора (~ 900 мкм). Кроме того, мы предоставляем информацию о не-выживания хирургической процедуры и микроскопа установки. Представитель результаты включают в себя изображения слоя V нейронов пирамидальной от Thy-1-H YFP мышей с указанием их дендритов, проходящий через поверхностный слой коры и расширения в пучки. Резолюция была достаточной для изображения дендритных шипиков возле сомы слоя нейронов V. Хвостовой вены инъекции флуоресцентного красителя показывает сложную сеть кровеносных сосудов в коре головного мозга. Линия сканирования красных кровяных телец (эритроцитов), протекающей через капилляры показывает РБК скорости потока и ставки могут быть получены. Этот роман зонд микропирамид является элегантным, но мощный новый метод визуализации глубоких клеточных структур и корковых функций в естественных условиях.

протокол

Часть 1: микропирамид Оптика и микроскоп установки

1. Микропризм которые мы используем, 1-мм, прямоугольные призмы изготовлены из стекла BK7 приобрести у Optosigma корпорации (рис. 1). Микропризм обрабатываются с помощью щипцов когда это возможно.
2. Гипотенузы микропирамид покрыта серебряным с повышенной обеспечить отражательная способность больше, чем 97% от 400 - 2000 нм. Это обеспечивает внутреннее отражение света и лазерного возбуждения и излучается флуоресценции.
3. Микропризм всегда обрабатываются с помощью щипцов, когда это возможно. Перчатки носить все время держать призму чисто.
4. Мы используем заказ двухфотонного микроскопа способна малого животного изображений. Животных, прикрепленных к стереотаксической устройства, находится на 3-х осевой моторизованный стадии.
5. Микроскоп подключается к ПК с Windows работает ScanImage программного обеспечения. ScanImage является получение изображений программное обеспечение, написанное в Matlab по Pologruto и др. ^1.
6. Для микропирамид изображений, которую мы получаем изображение с разрешением 1024 x 1024 или 512 х 512 пикселей. Кроме того, мы обычно сканирование с разрешением 2 мс / строка или 4 мс / линия.
7. Два вида целей используются в экспериментах:
   • Ниже числовой апертурой (NA) воздуха цель широкого поля-обзора изображения (см. таблицу реагентов и оборудования).
   • Н. А. воздуха выше цели с воротником стекла коррекция способна минимизации сферических аберраций, индуцированных 0 - 2 мм из стекла (см. таблицу реагентов и оборудования).
8. Когда животное готово для работы с изображениями при низких цель увеличения, выровнять площадь растрового сканирования образец лазера с верхней части микропирамид. Это поможет ориентироваться изображения и эффективного использования мощности лазера.
9. Использование более высокого Н. А. объективом с воротником коррекции стекла, установить исправление воротник для коррекции примерно 1 мм из стекла. После флуоресцентное изображение появляется во время эксперимента, можно тщательно достичь внутри микроскопа для оптимизации коррекции воротник, чтобы максимально изображений разрешением.

Часть 2: Номера для выживания животных и хирургии микропирамид вставки

1. Всей длине процедуру, начиная с первоначального разреза до завершения обработки изображений, зависит от целей эксперимента. Тем не менее, без хирургического вмешательства выживания и микропирамид размещения можно ожидать, что занимает примерно 30 - 40 минут.
2. Мыши (P30-P60) взвешивают и анестезии надлежащим использованием IP-инъекции кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) до плоскости подходят для хирургических процедур.
3. На протяжении всего эксперимента, животных следует проверять каждые 15-20 минут, чтобы оценить его уровень анестезии. Если животное реагирует на фирме схождения крайнем случае, дополнительный дозу кетамина / ксилазина не требуется. Обычно дополнительное доза одна треть начальной дозы и могут быть подготовлены заранее в шприце для немедленного IP-инъекции в случае необходимости.
4. Как только мышь должным образом под наркозом, большинство волос на голове животного сбрил использовании триммера с № 40 лезвие.
5. Наир ® наносится на оставшиеся волосы на голове, чтобы помочь создать поверхности свободны от волос, которые могут стать на пути из микропирамид во время съемки. Через 5 минут Наир ® убирается с помощью ватного тампона наконечником.
6. Наркозом животного правильно помещается в устройство стереотаксической мыши. Во время хирургических операций и обработки изображений сессий животное удерживается на заполненном водой грелку установлена ​​на уровне 36 градусов по Цельсию.
7. С головы животного исправлена ​​на месте, один чистый разрез делается с помощью скальпеля до средней линии черепа отделить кожу.
8. Небольшое количество 3% перекись водорода находится на хлопок наконечником тампоном и наносят на черепе, чтобы убрать перепонки между черепом и кожей.
9. Перекиси водорода и помогает выявить брегмы, важной вехой в зная, где для выполнения трепанации черепа и вставьте микропирамид.
10. Перед краниотомии запуска ухо баров и укусить бар должным образом скорректирована с наклоном подвергается черепа, что это в основном на одном уровне с таблицей. Это обеспечивает лучшую платформу для трепанации черепа. Кроме того, это делает верхнюю поверхность призмы перпендикулярно входящего света возбуждения. Это поможет свести к минимуму оптические аберрации в то время как изображения.
11. Небольшой стоматологической заусенцев (~ 0,8 мм, размер головы) связан с инструментом Dremel ®, используя гибкую руку расширение. Для craniotomies, мы устанавливаем скорость примерно до 7000 до 10000 оборотов.
12. Стоматологических заусенцы является обезжиренное по черепу, пока квадратный паз устанавливается в кость. Сторон квадрата примерно 2-3 мм в длину и 1,5 в центре хвостовой мм и 1 мм, боковые брегмы.
13. Продолжая истончение костей, пока небольшое отверстие производится через череп. Пара щипцов окн лифта костный лоскут от черепа.
14. Длительность должна быть удалена перед микропирамид могут быть вставлены в коре головного мозга. Кровотечение лучше контролируется позволяя крови свертываться на поверхности в течение нескольких минут. Впоследствии, свернувшейся крови удаляется с помощью хирургического губкой, прежде чем вставлять микропирамид.
15. Чтобы помочь выравнивание призма с корой, вертикальное лицом микропирамид выстраивается параллельно ручки щипцов.
16. С призмой правильно проведены все микропирамид вставляется до вершины призмы на одном уровне с поверхностью коры головного мозга.
17. Когда вставлена ​​неправильно, микропирамид должны оставаться в правильном положении. Любое кровотечение, что результаты минимальны и могут быть покрыты с небольшой хирургической губки. После призмы на месте животное готово для работы с изображениями.
18. После микропирамид была использована в животное, оно может быть повторно использована несколько раз. Тем не менее, она должна быть надлежащим образом очищены, чтобы удалить все оставшиеся биологического материала. Это может быть достигнуто путем погружения в призме небольшого объема соляной кислоты, а затем окунуться в метанол. Очищается микропирамид может быть завернуты в бумагу, пока объектив использования в будущем.

Часть 3: Представитель Результаты

Рисунок 1: Изображения прямоугольной микропирамид. Призмы, используемые в этом эксперименте одна миллиметра, BK7 призмы стекла с повышенной покрытие серебра на гипотенузу, чтобы внутреннее отражение возбуждения и испускания света.

Рисунок 2: Изображение слоя V YFP нейронов пирамидальные. Широкое поле сектор обзора изображения с микропирамид показывает большой популяции пирамидальных тел ячейки ~ 800 - 900 мкм из глубины поверхности коры. Кроме того, дендритов, простирающейся на слое я также может быть решена. Шкала бар = 200 мкм.

Рисунок 3: высшее числовой апертурой цели используется в сочетании с микропирамид обеспечивает пространственное разрешение достаточно для разрешения дендритных шипов на дендритов на слое V нейронов пирамидальные. Шкала бар = 10 мкм.

Рисунок 4: изображения, полученные с использованием микропирамид и хвостовой вены инъекции флуоресцентного красителя. Изображение показывает вертикальные, крупных сосудов калибра простирается от глубоких областей мозга и меньше капилляров отходящие через корковые объема. Шкала бар = 200 мкм.

Рисунок 5: Использование численных выше цели отверстие, сеть капилляров в коре головного мозга может быть, полученную с использованием более подробно. Шкала бар = 50 мкм.

Рисунок 6: микропризм также позволяет для работы с изображениями красных кровяных клеток (эритроцитов), протекающего через сосуды. Эритроциты не впитывают флуоресцентного красителя, и поэтому они видны как темные полосы поперек судна. По линейного сканирования через сосуд, можно получить измерения РБК потока и скорости. Шкала бар = 10 мкм (горизонтальная панель в верхней и нижней изображение) и 250 мс (вертикальная черта в нижнее изображение).

Обсуждение

Использование микропирамид в визуализации эксперимент относительно проста и имеет много преимуществ для прижизненного исследования коры головного мозга. Типичными примерами использования этого метода включают изображения, полученные из трансгенных мышей, экспрессирующих желтый ф...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
With enhanced silver reflective coating-(R77)	OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)	055-0010	With enhanced silver reflective coating-(R77)
Fluorescein-dextran	Sigma-Aldrich	FD70	70 kDa
0.28 NA, 4x air objective	Olympus Corporation	XLFLUOR 4x/340
0.60 NA, 40x air objective	Olympus Corporation	LUCPLFLN	With 0-2 mm coverglass correction