Одноклеточный Всасывающая Recordings от фоторецепторов Мышь Конус

Резюме

Мы покажем, как для записи вспышка ответов от одного конуса мыши, используя всасывания электрода.

Аннотация

Палочек и колбочек фоторецепторов в сетчатке отвечают за свет обнаружения. В темноте, циклических нуклеотидов закрытого (СПГ) каналы во внешнем сегменте являются открытыми и позволяют катионов течь постоянно внутрь через мембрану, деполяризующего клетки. Освещенность вызывает закрытие каналов СПГ, блоки внутрь катионного тока, и таким образом приводит к ячейке гиперполяризации. На основе полярности фоторецепторов, методом всасывания запись была разработана в 1970-х годов, что, в отличие от классического патч-зажим технику, не требует проникновения в мембране

протокол

Создание электродов

1. Сделать запись электродов использованием съемника микропипетки и польский электродов с отоплением нити под микроскопом. Для мыши конус одноклеточных всасывания записи, внутренний диаметр на конце электрода составляет около 6-7 мкм.
2. Подготовка электродов сравнения. Взвесьте 1% агара в дистиллированной воде. Растопить агар решение в ванну с горячей водой. Заполните стеклянные пипетки (L = 100 мм, OD / ID = 1/0.75 мм) с 1% агара использованием шприца. Укрепить агар при комнатной температуре в течение 10 минут.
3. Разрежьте пополам пипетки помощью алмазной ножом.
4. Замочите электродов в раствор сравнения, по крайней мере 24 часов при температуре 4 ° С.

Настройка эксперимента

5. Темные адаптировать мышь в черном клетку на ночь.
6. Подготовка 100 мл раствора ведения и 1 л перфузии раствором (см. ниже) и фильтр решение.
7. Растворяют 0,1% BSA и 10 мМ глюкозы в 20 мл раствор ссылки.
8. Калибровка интенсивности света в оптических стимулятор использованием фотометра.
9. Горы записи камеры на сцене инвертированного микроскопа.
10. Bubble перфузии раствора с 95% O ₂ / 5% CO _2, инкубировать ее в 40 ° С водяной бане для увеличения растворимости СО _2. Решение вытекает из бутылки записи камеры, проходящей через керамический резистор нагревая это до 36-38 ° С. Нагреватель должен быть расположен как можно ближе к записи камеры позиции, желательно на стадии микроскоп.
11. Настройте регулятор расхода для потока скоростью около 1-1,5 мл / мин.
12. Заполните записи электрода со ссылкой решение. Вставьте электрод в держатель электрода. Убедитесь Есть нет пузырьков в электроде. Горы держатель на headstage усилителя. Подключите держатель для всасывающего устройства, который построен путем соединения трубки, частично заполненной минеральным маслом в сторону порта из держателя электрода. Другой конец трубки соединен с небольшим резервуаром нефтепродуктов, к которым давление может быть применен в рот.
13. Подключение электрода к другому полюсу headstage. Привязка тепловые пара (ТС) для электрода сравнения. Убедитесь, что электрод и ТК советы близко друг к другу так, чтобы температура чтении принимается близко к клетке как это возможно.
14. Включите ИК-подсветки для визуализации электрода. Электрод рассматривается инфракрасная камера подключена к монитору. Центр электрода изображение на поля зрения и монитора с помощью микро-манипулятором.
15. Отрегулируйте положение кончика электрода близко (2-4 мм), чтобы кончик электрода записи.
16. Отрегулируйте напряжение постоянного тока на нагреватель так, чтобы температура раствора составляет около 36-38 ° C.
17. Выполнить печать, чтобы проверить сопротивление электрода записи, как правило, около 900 кОм.

Изоляция мыши сетчатки

18. Под тусклый красный свет, эвтаназии темно-адаптированной мышь с CO ₂ и цервикальной дислокации. Марк глазные яблоки с помощью иглы горячей факел металла прижигание наиболее спинной точки склеры чуть-чуть. Выявлять глазные яблоки с помощью ножниц. Все последующие процедуры проводятся под инфракрасным излучением.
19. Hemisect глазных яблок под микроскопом с ИК подсветкой и преобразователей.
20. Удалить роговицы и хрусталика. Удалить столько стекловидного насколько это возможно.
21. Для записи M-конус ответов, удалить вентральной части наглазник ⁴ с лезвием судя по прижигания марки.
22. Пил сетчатку от слоя пигментного эпителия.
23. Свести сетчатки и положите его на дно чашки Петри, заполненные 1-2 решение ссылкой мл.
24. Нарежьте сетчатки на мелкие тонкие части, используя лезвие бритвы и инкубировать подготовку в светонепроницаемый ящик насыщенной чистым кислородом.

Записи

25. Выключите обогреватель временно. Коммутатор перфузии поток обойти трубы, чтобы предотвратить камеры от высыхания.
26. Слейте большую часть раствора в камере используя часть Kimwipe ткани. Передача сетчатки подвески записи камеры с помощью стеклянной пипетки.
27. Подождите около 2 минут, пока сетчатка ломтиками успокоиться. Коммутатор перфузии обратно. Включите нагреватель.
28. Включите инфракрасную подсветку для визуализации подготовки. Поиск часть сетчатки лежал на камеру с наружных сегментов фоторецепторов торчащие (см. пример рисунок). Нарисуйте внутренние сегменты мягко в электроде всасывания. В этой конфигурации, несколько ядер и внутренний сегменты должны быть вовлечены в электроде. Запись фотоотклика на яркую вспышку для проверки конуса внутренний сегмент находится в электроде и является ли ячейка исцелитьтвой, судя по реакции кинетики и амплитуды.
29. Нижняя минеральных водохранилище применить небольшое отрицательное давление до кончика электрода, чтобы помочь провести внутренний сегмент в электроде.
30. Запись тест-вспышкой ответы от тусклом до ярко интенсивности раз хороший ячейка найдена. Испытание вспышки осуществляется от калиброванного оптического стимулятор ^5. Интенсивность вспышки и длины волны контролируются набором фильтры нейтральной плотности и узкие фильтры интерференционной полосы, соответственно. Испытание длительность вспышки (20 мс) управляется компьютером управляемых жалюзи.

Решения

1. Мышь перфузии решение: 112,5 мМ NaCl, 3,6 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl _2, 1,2 мМ CaCl _2, 10 мМ HEPES (рН 7,4), 20 мМ NaHCO _3, 3 мМ Na сукцинат, 0,5 мМ Na глутамата, 0,02 мМ ЭДТА и 10 мМ глюкозы.
2. Мышь записи электрода решение: 140 мМ NaCl, 3,6 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl _2, 1,2 мМ CaCl _2, 3 мМ HEPES (рН 7,4), 0,02 мМ ЭДТА.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Одноклеточный всасывания записи с фоторецепторных клеток был разработан три десятилетия назад. Это дает нам возможность записи трансмембранный ток изменение, вызванное световой стимуляции, не проникая клеточной мембраны. Из-за высокой межклеточной адгезии, трудно выделить одну здор...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.