Изучение Synaptic Бассейны пузырьков использованием фотопревращения стириловых красителей

Резюме

FM красители имели неоценимую помощь в понимании синаптических динамики. Главы МИД, как правило, следуют под флуоресцентного микроскопа при различных условиях стимуляции. Тем не менее, фотопревращения FM красителей в сочетании с электронной микроскопии позволяет визуализации различных синаптических пузырьков бассейнов, среди других компонентов ультраструктура, в синаптических boutons.

Аннотация

Слияние синаптических пузырьков с плазматической мембраной (экзоцитоз) является необходимым шагом в выпуске нейромедиатора и нейронные связи. Пузырьки затем выбираться из плазматической мембраны (эндоцитоз) и группируются вместе с общим бассейном пузырьков внутри нервного окончания, пока они не проходят новые экзо-и эндоцитоза цикла (пузырька утилизации). Эти процессы были изучены с использованием различных методов, таких как электронная микроскопия, электрофизиологии записей, amperometry и измерения емкости. Важно отметить, что в течение последних двух десятилетий число флуоресцентно меченых маркеров появились, позволяя оптические методы для отслеживания пузырьков в их динамике утилизации. Один из наиболее часто используемых маркеров стирил или FM красителя ^1; структурно, все FM красители содержат гидрофильные головы и липофильный хвост подключен через кольцо ароматических и одну или несколько двойных связей (рис. 1В). Классическая FM эксперимент красителя для маркировки пул везикул состоит в ванной подготовки (рис. 1Ai) с красителем при стимуляции нерва (электрически или с высоким K ^+). Это вызывает переработки пузырек и последующие загрузки красителя в недавно эндоцитарных пузырьки (рис. 1А _I-III). После загрузки пузырьки с красителем, второй раунд стимуляции в краситель без ванны вызовет FM-релиз через экзоцитоза (рис. 1А _IV-V), процесс, который может сопровождаться мониторинга флуоресценции снижение интенсивности (destaining).

Хотя FM красителей внесли большой вклад в области переработки пузырьков, это не представляется возможным определить точную локализацию и морфологии отдельных пузырьков с помощью обычной флуоресцентной микроскопии. По этой причине мы объясняем здесь, как FM-красители могут также быть использованы в качестве маркеров endocytic с помощью электронной микроскопии, через фотопреобразования. Фотопреобразования техника использует свойства флуоресцентных красителей для генерации активных форм кислорода при интенсивном освещении. Флуоресцентно меченных препаратов погружен в раствор, содержащий диаминобензидина (DAB) и освещены. Активные формы порожденные молекулы красителя окисляется DAB, который образует стабильный, нерастворимый осадок, который имеет темно внешнему виду и можно легко отличить в электронной микроскопии ^2,3. Как DAB только окисляется в непосредственной близости от флуоресцентных молекул (как активных форм кислорода недолговечны), техника гарантирует, что только флуоресцентно меченных структуры будет содержать электронно-плотного осадка. Технику таким образом, позволяет изучение точное местоположение и морфология активно переработки органелл.

протокол

1) Подготовка дрозофилы нейронов мышечного соединения (NMJ)

1. Подготовка стандартных дрозофилы физиологическим раствором (130 мМ NaCl, 36 мМ сахарозы, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl _2, 2 мМ MgCl _2, 5 мМ HEPES, рН 7,3 ^4.
2. Рассеките подготовки в физиологическом растворе (1.1). Личинки дрозофилы тосковал спинной стороной вверх на блюдо Sylgard; спинной стороны подразделяется продольных и внутренние органы удаляются. Препарат затем потянулся и тосковал. Несколько вентральной мышцы могут быть затем использованы.

2) Стимулирование и FM-окрашивание

1. Желательно, чтобы делать все следующие шаги в условиях низкой освещенности, в целях защиты FM красителей из отбеливания.
2. Для химической стимуляции нервов, высокая буфера калия используется. Подготовка дрозофилы физиологического раствора (см. п. 1.1), содержащего 90 мМ KCl и 10 мкМ FM1-43 красителя. Хранить раствор защищенном от света месте.
3. Ванна препарат с заранее подготовленного буфера в течение 1 минуты при комнатной температуре.
4. Вымойте со стандартным дрозофилы физиологического раствора (1,1) для удаления внеклеточных FM1-43 красителя. Выполнить быстро фиксации.

3) крепления

1. Ванна препарата с 2,5% глутарового альдегида в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 45 минут при комнатной температуре. Для хорошей сохранности морфологических особенностей, глутаральдегид предпочтительнее параформальдегида.
2. Вымойте раз с PBS, а затем оставить подготовки погружают на 15 минут в 100 мМ NH ₄ Cl. Этот шаг делается для того, чтобы утолить свободных групп альдегид из оставшихся глутаральдегида фиксатором.
3. Вымойте NH ₄ Cl решение с нормальными PBS.

4) фотопреобразования

1. Инкубируйте подготовки NMJ течение 30 минут при 4 ° С в PBS, содержащий 1,5 мг мл-1, диаминобензидина (DAB).
2. Позиция образца под флуоресцентным микроскопом. Найти и сосредоточиться флуоресцентный сигнал, используя сравнительно небольшом увеличении погружения в воду цель (20x 0,5 NA).
3. Illuminate образца с максимальной интенсивностью лампы до красителя FM полностью отбеленной (рис. 1в). Для контроля, если фотопреобразования произошло, рекомендуется проверить на образце под светопропускания до и после FM красителя отбеливания шаг. Если фотопреобразования имеет место, темный коричневый осадок, как ожидается, (рис. 1в). Времени освещения является переменной величиной, в зависимости от силы освещения, а также при проникновении DAB в подготовке. Для большинства препаратов, мы нашли освещение времена ~ 30-45 минут, которые будут оптимальными при использовании 20-кратного объектива. Более короткие периоды освещения используются для целей большем увеличении (60х).
4. Для освещения мы предпочитаем использовать ртутную лампу, с корпуса лампы содержащие назад зеркало, которое собирает обратно рассеянных световых пучков и, следовательно, увеличивается суммарная интенсивность.

5) Обработка пробы для EM

1. Osmication
   1. Приготовьте раствор с одним объемом осмия в дерево объемы воды (около 300 мкл на образце). Работа использования осмия должно быть сделано под капотом, используя перчатки и да защиту оборудования.
   2. Инкубируйте подготовки в решении осмия в течение 1 часа при комнатной температуре (под капотом).
   3. Вымойте экстенсивно с PBS (4-5 раз 5 минут) и передачи каждого образца на чистую стеклянную колбу.
2. Обезвоживание
   1. Подготовка отдельных растворов, содержащих 30, 50, 70 90, 95 и 100% этилового спирта.
   2. Добавьте 1 мл 30% этанола, каждый образец в течение 5 минут.
   3. Добавьте 1 мл 50% этанола, каждый образец в течение 5 минут.
   4. Добавьте 1 мл 70% этанола, каждый образец в течение 5 минут.
   5. Добавьте 1 мл 90% этанола, каждый образец в течение 5 минут.
   6. Добавьте 1 мл 95% этанола, каждый образец в течение 5 минут (повтор 3 раза).
   7. Добавьте 1 мл 100% этанола на каждого образца в течение 5 минут (повтор 3 раза).
3. Вложения и дальнейшей обработки
   1. Смешайте 1 объема Epon смолы с одного объема этанола. Добавьте его в подготовке под непрерывным вращением (2-4 часов).
   2. Место препарата в 100% Epon в открытых колбах, позволяют оставшиеся этанола испариться (4-6 часов).
   3. Место подготовки в формах при температуре 60 ° С в течение 36 часов.
   4. Электронная микроскопия обработки. Процесс подготовки в 50-80 нм тонких срезов, с использованием стандартных процедур ultramicrotomy.
4. Электронно-микроскопическое изображение
   1. Подготовка изображается с помощью обычных процедур EM.

6) Представитель Результаты

Ожидаемые результаты изложены в цифрах 1С и 2. Освещение процедура приводит к образованию братаншп DAB осадок, который будет виден в обоих флуоресценции и передачи изображений. Первое появление в освещении исчезновения флуоресценции связаны с FM окрашивания красителем. Фоновой флуоресценции индуцированного альдегид фиксатором, напротив, будет виден в течение всего эксперимента. Отбеливание происходит обычно в ~ 10-20 минут после начала освещения. Обычно не фотопреобразования продукт можно наблюдать в это время точка.

Освещение должно быть продолжено, и после ~ 10 минут подготовки превратится в коричневый оттенок из-за накопления DAB (рис. 1С _IV) Непонятно, почему DAB и FM осадков красителя отбеливание происходит не одновременно, не исключено, что относительно большие количество окисленных DAB необходимо накопить до агрегации и осадков, и поэтому эта реакция происходит медленнее, чем процесс отбеливания. На данном этапе, однако, препарат не готова к обработке электронного микроскопа, а осадков DAB, скорее всего, неполным. Мы предпочитаем подождать 5-10 минут дольше, в течение которых препарат (пресинаптических терминал нерва) предполагает, темно-коричневого (или черного) цвета, что свидетельствует о полной конверсии. Небольшое преобразование общая поверхность препарата (например, мышечных волокон в нервно-мышечном соединении) можно наблюдать на данном этапе. Скорее всего, связанные с преобразованием DAB индуцированной флуоресценции (и / или фиксатора флуоресценции), и это не влияет на процедуру.

Подготовка затем обрабатывается для электронной микроскопии, а также должны быть проверены на наличие темной (помечены) пузырьков. Как мы уже продемонстрировали, прежде чем ^5,6, эти пузырьки гораздо плотнее, чем не помечены те, и поэтому легко отличить (рис. 2В). Для увеличения шансов отличительной также различные типы пузырьков, ни контраст-усиленные окрашивания пост разделы должны быть выполнены (без уранилацетатом или окрашивание цитратом свинца); осмий окрашивания достаточно заметить, большинство клеточных элементов, и не так темно, как осадок DAB.

Рисунок 1: FM красителей и ее используют для фотопреобразования. () Представляет шаги классического эксперимента для погрузки и distaining пузырьки использовании FM красителя при стимуляции. (Я) Инкубируйте образца в FM красителя содержащие буфера. (II) Стимулировать (электрически или химически), чтобы вызвать пузырьки синтеза в наличии FM-краситель. (III) подпоследовательность после стимуляции эндоцитоза будет загружать некоторые пузырьки с FM красителя еще присутствуют во внеклеточном буфера. (IV) Замените внеклеточной FM красителя путем промывки буфером. (У) новая стимуляция вызовет загружены пузырьки, чтобы выпустить их на FM красителя экзоцитоза. (Б) Схематическое изображение головы, мост и хвост FM1-43 красителя. (C) Пример фотопреобразования эксперимент в дрозофилы NMJ. (Я) После загрузки NMJ с FM1-43, стиральная внешних молекул красителя и фиксации, флуоресценция нервного окончания можно наблюдать с помощью обычного микроскопа epifluorescence (63x). (II-III) при непрерывном освещении красителя полностью обесцвечиваются. (IV) при освещении продолжается, черный цвет появляется из-за осадков диаминобензидина. Шкала бар составляет 10 мкм.

Рисунок 2: Е. М. примеры photoconverted образцов () изображение показывает нервного окончания содержащие синаптические пузырьки, но не из них photoconverted, это может быть вызвано не имея достаточно освещения или плохого проникновения диаминобензидина в тканях.. (B) Synaptic Бутона с несколькими темными (заполненных) везикулы, которые прошли через FM фотопреобразования. (C) Избыток освещения приводит к общему темно терминал, где нет пузырьков или органеллы различимы. Шкала бары представляют 200 нм.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Несколько важных шагов должно быть принято во внимание:

• Инкубационный DAB следует проводить только после тщательного промывания и тушения препаратов. В противном случае, не реагировал глутаральдегида будут взаимодействовать с DAB и вызывают ее осадков (как правило, в виде плоских...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
FM 1-43	Invitrogen	F10317
Epon resin	Plano GmbH	R1030
di-aminobenzidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
50% Glutaraldehyde	AppliChem	A3166	EM grade
Sylgard	Dow Corning	104186298
Axioskop 2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.
Objective 20x 0.5 NA	Olympus Corporation		Dry objective
100W Hg Lamp	Carl Zeiss, Inc.
Lamp housing with back mirror	Carl Zeiss, Inc.	1007-980
MRm camera	Carl Zeiss, Inc.	0445-554	Image acquisition
Ex. Filter (HQ 470/40)	AHF	F49-671
Dichroic (495 DCLP)	AHF	F33-100
Em. Filter (HQ 500 LP)	AHF	F42-018
EM	Carl Zeiss, Inc.
Proscan CCD HSS	Proscan Electronic Sys.		1024 x 1024