Подготовка Олигомерные β-амилоида 1-42 И индукция Synaptic Обесценение Пластичность на срезах гиппокампа

Резюме

Одной из особенностей болезни Альцгеймера является повышение Ар _1-42 Пептида. Здесь мы предлагаем протокол для подготовки синтетических Ар _1-42 Олигомеров, что снижает гиппокампа долговременной потенциации, сотовые коррелят памяти. Эта процедура полезна для исследования механизмов Ар-индуцированной скрининга патологии и наркотиков.

Аннотация

Обесценение синаптических связей, скорее всего, лежат в основе тонких амнезии изменения, происходящие на ранних стадиях болезни Альцгеймера с (AD). β-амилоида (Ар), пептид, производимых в больших количествах в AD, как известно, уменьшает долговременной потенциации (LTP), сотовые коррелят обучения и памяти. В самом деле, LTP нарушения вызваны Ар является полезным экспериментальную парадигму для изучения синаптической дисфункции в нашей эры моделей и для скрининга препаратов способны смягчения или возврат таких синаптических нарушений. Исследования показали, что Ар производит LTP нарушения преимущественно через его олигомерные формы. Здесь мы предлагаем подробный протокол по нарушению LTP по перфузии олигомеризации синтетических Aβ1-42 пептида на острые срезах гиппокампа. В этом видео мы опишем шаг за шагом, порядок подготовки олигомерных Ар

протокол

Ресуспендирования β-амилоида пептида

Прежде, чем начать есть готовые:

• Ар _1-42 (лиофилизированный порошок)
• 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол (HFIP)
• Низкий-связывающий полипропилена микроцентрифужных труб (1,5 мл)
• Газонепроницаемыми Гамильтон шприц с тефлоновым окунуться остановить (250 мкл)
• Диметилсульфоксид (ДМСО)

1. Разрешить лиофилизированный Ар _1-42 до уравновешивания при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы избежать конденсации при открытии пептид флаконе.
2. Под вытяжным шкафом, вновь приостановить Ар _1-42 пептида в ледяной HFIP получить 1 мМ раствора и вихревые решения в течение нескольких секунд.
3. Использование стекла газонепроницаемыми Гамильтон шприц с пробкой тефлон, быстро разделить Ар _1-42 / HFIP решение в равной степени на три флаконах полипропиленовых и печатью ампул.
4. Флаконы затем инкубировали в течение 2 часов, чтобы обеспечить Ар monomerization. Затем откройте флаконов и сосредоточиться Ар _1-42 / HFIP раствора под вакуумом с помощью центрифуги SpeedVac (800 г, комнатной температуры), пока прозрачная пленка пептида наблюдается на дне флакона. Тщательно проверьте температуру внутри SpeedVac центрифуге, чтобы избежать деградации пептида (не более 25 ° С).
5. Печать флаконов и хранить аликвоты при -80 ° C. Ар пленку можно хранить в течение 6 месяцев.
6. Повторное приостановить один фильм, добавив ДМСО, чтобы получить концентрацию до 5 мм Ар _1-42. Разрушать ультразвуком в водяной бане в течение 10 минут, чтобы полностью изменить подвеску.
7. Алиготе этом 5 мМ Ар _1-42 решения в полипропиленовые флаконы. Закройте все флаконы и хранить их при температуре -20 ° C. Порции должны быть разморозить только один раз. Остерегайтесь конденсации воды внутри морозильной камеры. Пептидов в растворе подвержен очень легко.

Олигомеризации

Прежде, чем начать есть готовые:

• Ар _1-42 / ДМСО (5мм)
• Стерильные фосфатного буфера
• Низкий-связывающий полипропилена микроцентрифужных труб (1,5 мл)
• Низкий-связывающий полипропиленовые центрифужные пробирки (50 мл)

1. Развести полученный 5 мМ Ар _1-42 / ДМСО аликвоту стерильной фосфатного буфера (до 100 мкл).
2. Vortex в течение 30 секунд, а затем инкубируют в течение 12 часов при температуре 4 ° C

Гиппокампа лечение ломтик

При лечении срезах гиппокампа, важно, чтобы избежать неспецифической адгезии пептида на стаканах, поверхностей перфузии труб, и записи камеры. Использование преимущественно низкой обязательным трубы полипропиленовые и контейнеры. Избегайте использования изделий из стекла или общие пластиковой посуды. Перфузии СМИ должны быть сыворотки или альбумин-бесплатно.

Ар перфузии

Прежде, чем начать есть готовые:

• Олигомеризации Ар _1-42
• Запись буфера (в мм: 124 NaCl, 4,4 KCl, 1 Na ₂ HPO _4, 25 ₃ NaHCO, CaCl ₂ 2, 2 MgCl ₂ и 10 глюкоза)
• Электрофизиологические записи настройки камеры с интерфейсом
• Поперечные срезах гиппокампа инкубировали в кислородом буфера записи, по крайней мере 90 минут после вскрытия (Т = 29 ° С; постоянной скоростью перфузии = 2 мл / мин)

1. Непосредственно перед экспериментом, развести Ар олигомеризации _1-42 аликвоту до соответствующей концентрации рабочих (200 нм и выше) в полипропиленовые трубы с предварительной кислородом записи буфера.
2. Заливать Ар _1-42 решение в течение 20 минут, чтобы ломтики до индукции синаптической пластичности.

Индукция пластичность и последующей

1. Как правило, наиболее широко используемой модели синаптической пластичности LTP. Он может быть вызван через тетаническое стимуляции данной синапс в гиппокампе. Мы поля записи ответов от синапсов между залога прогнозы Шаффер и СА1 пирамидальных нейронов в radiatum слоя. Наши тетаническое стимуляции состоит из стимуляции тета взрыв, который включает 3 поезда, разделенных 15-секундным интервалом. Каждый поезд состоит из 10 очередей на 5 Гц, где каждый взрыв влечет за собой 5 импульсов в 100 Гц. Применить тетаническое стимуляцию сразу после перфузии олигомеризации Ар была завершена.
2. Сразу же после тетаническое стимуляции вернуться к нормальной перфузии с буфером записи. Поддержание постоянной скорости перфузии, записи температуры камеры и надлежащего оксигенации на протяжении всего эксперимента.

Представитель результаты и возможные проблемы

Ар олигомеризации по классическому протоколу Стайн и др. Сб. ^1, генерирует Ар мономеров и олигомеров разнообразие различных размеровс (димеров, тримеров и т. д.) перфузии олигомеризации Ар _1-42 ведет к снижению LTP в Ар обработанных ломтиками по сравнению с контрольными срезами. В наших экспериментальных условиях, где 3-5 месяца C57BL/6J самцов мышей используются, LTP в 200 нМ Ар обработанных срезов в среднем 150% от базовой стоимости на два часа после тетаническое стимуляцию, в то время как в контрольной ломтиками LTP значения в среднем 200-250% от baseline2. В некоторых случаях лечение с Ар может не уменьшить гиппокампа LTP. Несколько критических ошибок, которые могут возникнуть включают чрезмерное фильма во время сушки Ар концентрации и неполной олигомеризации. Ар перфузии в срезах гиппокампа может быть другой источник беспокойства из-за физико-химическими свойствами Ар пептида в растворе, который ведет к неспецифической адгезии к пластмассам. Устранение этих вопросов обсуждается ниже.

Обсуждение

Как описано выше, ряд проблем в подготовке олигомерных Ар может привести к незатронутым LTP. Один из способов оценить, насколько Ар деградации или отсутствие Ар олигомеризации, возможно, произошли является оценка Ар подготовки использованием ТРИС-Tricine СТРАНИЦА / Западная блоттинг анали?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aβ 1-42 (lyophilized)	American Peptide	62-0-80
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)	Fluka	52517
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Biotium, Inc.	90082
50mL Polypropylene Centrifuge Tubes	Corning	05-538-67
1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery	Axygen Scientific	MCT-150-L-C
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4	Invitrogen	10010-023
GASTIGHT Syringes 250 μL	Hamilton Co	1725
Bath sonicator	Branson	3510
Savant SpeedVac Concentrator System	Various	SC 110A