Исследование глиальных Влияние неоднородности сотовый на рост Axon Использование нового метода Coculture

Резюме

В этом протоколе, мы описали новый метод изучения влияния гетерогенности глиальных ячейку аксон роста с В пробирке Со-системе культуры. Крыса корковых глиальные клетки культивировали до слияния и cocultured с высокоочищенного крыс нейроны ганглиев спинного корня. Различные глиальных влияние на нейроны ячейки адгезию и рост аксонов сравнивали непосредственно в той же культуре. Этот метод обеспечивает новый способ непосредственного изучения влияния гетерогенности глиальных ячейку нейрона адгезии и аксонов роста.

Аннотация

В центральной нервной системе всех млекопитающих, разорвала аксоны после травмы не в состоянии регенерировать их первоначальными целями и восстановления функций очень плохое ^1. Провал регенерации аксонов совместным результатом нескольких факторов, включая враждебные глиальных среде клетки, тормозящий миелина связанных молекул и снижения внутреннего нейрона регенеративной способностью ^2. Астроциты являются наиболее преобладающим типом клеток глии в центральной нервной системе и играют важную роль в аксон функций в соответствии с физиологии и патологии условиях ^3. Отличие от гомологичной олигодендроцитов, астроцитов являются гетерогенными популяции клеток состоит различными астроцитов субпопуляций с различными морфологии и экспрессии генов ^4. Функциональное значение этой неоднородности, такие, как их влияния на рост аксонов, в значительной степени неизвестно.

Для изучения глиальных клеток, особенно функции астроцитов неоднородности в поведении нейронов, мы установили новый метод совместного культивирования высоким спинным очищенный корень ганглиев нейронов с глиальных клеток, полученных от крыс коры головного мозга. По этой техники, мы имели возможность непосредственно сравнить адгезии нейронов и аксонов роста на различных субпопуляций астроцитов при том же условии.

В данном отчете мы приводим подробный протокол этого метода для астроцитов изоляции и культуры, задний корешок ганглиях нейронах выделения и очистки, а также со-культуры DRG нейроны с астроцитов. Этот метод также может быть распространена и на другие области мозга для изучения клеточной или региональной специфики взаимодействия нейронов и глиальных клеток.

протокол

1. Культура Глия сотовый

Глиальные клетки могут быть культурным из разных регионов центральной нервной системы. Весь процесс показан в процессе фигуры.

День 1 Покрытие пластины культуры и покровные

1. Сухой стерилизовать круглые покровные стекла микроскопа в автоклаве.
2. Пластина стерилизовать покровных в стерилизованные 24-луночных культуры пластины.
3. Пальто покровные с поли-лизина и инкубировать в течение 2 часов под корень температуры.
4. Пальто 6-и культуре пластины таким же образом, как шаг 3.
5. Вымойте покровные и 6-и культуре пластины в два раза дистиллированной водой и просушите в культуре капотом.
6. Добавить 200 мкл среды DMEM (с 10% FBS) в каждую лунку в 24-луночного планшета и 2 мл в каждую лунку в 6-луночный планшет и поместить их в инкубатор под 37 градусов с 5% CO ₂

День 2 Изоляция коры и глиальных клеточных культур

1. Стерилизовать положительные капот рассечение потока.
2. Включите УФ-светом в течение 20 мин.
3. Спрей все поверхности с 70% этанола и подождите 15 минут перед использованием.
4. Изменение времени: обезболить крысят (P2-P6) на переохлаждение, и обезглавить на базе framen магнум использовании операционных ножницами.
5. Открытое черепа вдоль стреловидного шва использованием ножниц радужной оболочки и шелушиться черепа.
6. Удаление переднего мозга и положить их в охлажденном L15 среде, под стереомикроскопа, тщательно очистите оболочки и мягкая оболочка с кровеносными сосудами, изолировать коры и промойте несколько раз L15 среды.
7. Вырезать коры на мелкие кусочки с ножницами микрохирургии.
8. Добавить 0,125% трипсина-EDTA подготовлен с L15 среду на куски коры и инкубировать в 37 градусов в течение 15 мин.
9. Передача ткани блоков в 20 мл среды DMEM с 20% FBS в 50 мл трубки, добавьте ДНКазы фондовом решение окончательное 10ug/mL концентрации, аспирация ткани решение вверх и вниз по 20 раз с огнем полированного стекла Pasteure пипетки, собирать суспензии отдельных клеток.
10. Вымойте клеточной суспензии один раз с DMEM среде, повторно приостанавливать клеток в DMEM с 10% FBS, граф клетки под микроскопом с гемоцитометра, клетки семян на 5000-10000/cm ^2. Поддерживать клетки в 37 градусов 5% инкубатор, изменение половине среды 2 раза в неделю.

2. Спинной корневой Ganglia Нейроны изоляции, культуры и очистки

День 1 Подготовка материальной культуры

1. Пальто стерилизовать покровные с поли-лизин, покровные мыть дважды перегонять воду и воздух сухой, положить их в 24-луночных планшетах.
2. Добавьте 100 мкл Neurobasal среде с 2% B27 и 2.5S NGF (50 нг / мл), положите пластину на 37 градусов на 5% СО _2.

День 2 изолят ДРГ из эмбрионов

1. Стерилизованное поток капот точно так же, как глиальные культуры клеток.
2. Эвтаназии беременных крыс (E15) от передозировки с СО _2, стерилизовать живота на 70% этанола, эмбрионы были изолированы от матки и введены в охлажденном L15 среды.
3. Изолировать спинной мозг связан с спинной ганглий корня под стереомикроскопа и трансфер в 35 блюд с охлажденной L15 среды.
4. Сбор суспензии отдельных клеток и мыть один раз с NBF среды (Neurobasal среде, содержащей 2% B27 и 2.5S NGF (50 нг / мл)).

День 3 Purify DRG нейроны

1. 18ч-24ч после посева нейрона, добавить 1 мМ концентрированный раствор фондовом ФУДР к культуре нейрона к конечной концентрации 20 мкМ и конечном объеме 200 мкл.
2. 72 часа спустя, заменить половину среды с Neurobasal среде, содержащей 2% B27 и 2.5S NGF (50ng/mL) без ФУДР. После этого, измените среду через день.

3. Coculture DRG нейронов глиальные клетки

1. Когда глиальных клеточных культур достигла слияния (около 20 дней после посева), они были готовы к coculture с нейронами.
2. 24 часов, прежде чем добавить очищенные нейроны, глиальные клетки среду были изменены на Neurobasal среде, содержащей 2% B27 и 2.5S NGF (50 нг / мл).
3. Очищенная нейроны были собраны из культуры скважин, одну подвеску клетки были получены путем механического, проходящих через огонь полированной пипетки Pasteure.
4. После подсчета количества, нейроны были посеяны на 500/cm ² на сливной глиальных клеток в Neurobasal среде, содержащей 2% B27 и 2.5S NGF (50ng/mL).
5. Нейроны адгезии и аксонов роста на глиальные клетки могут быть записаны и проанализированы в различные моменты времени на изображение программного обеспечения для анализа и иммуноцитохимии использованием типа клеток специфических антител.

4. Представитель Результаты

1. Глиальные культуре клеток: после посева, глиальные клетки станут сливной около 20 дней. В рамках этапа microsc отличиеОПЕ, было легко определить, что различные морфологические глиальных субпопуляций ячейки формируются различные подструктуры модели роста и GFAP положительные астроциты приходилось более 90%, как показали immuocytochemisty техники (рис. 1, рис 2).
2. DRG нейроны культуры: В нашем методе лечения после 72 ФУДР часов, чистота DRG нейроны будет достигать 99% в течение 6 дней, DRG нейроны показали свои уникальные морфологии и с высоким ростом аксонов плотности (рис. 3, рисунок 4).
3. Глиальных клеток и coculture нейронов: DRG адгезии нейронов и аксонов произошло с готовностью на глиальные клетки в течение 4 часов после посева, тщательные наблюдения показали, что адгезия нейронов и аксонов роста под влиянием глиальные клетки, которая субпопуляций формируется специальный подструктуры модели роста, то это может быть легко идентифицированы под фазового микроскопа отличие и иммуноцитохимии (рис. 5, рисунок 6).

Рисунок 1. Морфология сливной глиальных клеток. Корковая глиальных клеток высевали на полилизином покрытием покровное и культивировали в течение 20 дней, обратите внимание на различные модели роста глиальных клеток, клетки с левой стороны расположены в излучается способом.

Рисунок 2. Сливной глиальных клеток, помеченных Глиальные фибриллярный кислый белок (GFAP) антител. Обратите внимание, излучаемая расположение GFAP (красный) позитивные клетки с правой стороны.

Рисунок 3. Спинной нейроны ганглиев корень вырос в пробирке без лечения ФУДР. Загрязняющих ячейки, образованные DRG фоне нейронов.

Рисунок 4. Спинной нейроны ганглиев корень вырос в пробирке после лечения ФУДР. Фон загрязнения клетки были ликвидированы полностью.

Рисунок 5. Спинной корень ганглиев нейронов, выращенных на глиальных клеток. Нейроны адгезию и рост аксонов были заторможены по излучаемой расположены клетки и ограниченный с правой стороны глиальных клеток.

Рисунок 6. Спинной корень ганглиев нейронов, растущих на глиальные клетки помечены нейрофиламентов антител. Аксонов (зеленый) были заторможены по излучаемой расположены левой стороны глиальных клеток и ограниченный с правой стороны, все глиальные клетки были помечены GFAP антител (красный).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот эксперимент протокол был разработан, чтобы достичь две цели для изучения глиальных клеток, влияние особенно астроцитов неоднородности на нейрон адгезии и аксонов роста. Первая цель заключалась в поддержании астроцитов неоднородность как можно больше, в этом эксперименте, сливаю...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM(high glucose)	Invitrogen	10313-039
L15 medium	Invitrogen	11415-114
FBS	Invitrogen	10437-077
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103-049
poly-lysine	Sigma-Aldrich	P4832	culture grade
NGF(2.5S)	Invitrogen	13257-019
B27 supplyment	Invitrogen	17504-044
0.25% trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503
neurofilament antibody	Abcam	ab24575