Подготовка фрагментов, органотипической культивирования тканей и люциферазы Запись часы активность генов в супрахиазматическое ядро

Резюме

Порядок подготовки ломтиками содержащие взрослой мыши супрахиазматическое ядро ​​гипоталамуса (SCN), и быстрый путь к культуре SCN ткани в органотипической состояние культуры, как сообщается. Кроме того, измерения колебательных часы ген экспрессии белка с использованием динамических люциферазы технология описана репортером.

Аннотация

Центральных циркадных (~ 24 ч) часы координации суточные ритмы в физиологии и поведения находится в супрахиазматического ядра (SCN), расположенные в переднем гипоталамусе. Часы напрямую синхронизируется свет через сетчатку и зрительный нерв. Суточный колебания генерируются при взаимодействии отрицательных обратных связей из числа так называемых "часовых генов", и их белковых продуктов, включая период (Per) генов. Частота ядра зависит также от деполяризацию мембраны, кальция и цАМФ ^1. SCN шоу ежедневно колебаний в часы экспрессии генов, метаболической активности и спонтанной электрической активности. Примечательно, что это эндогенной активности циклических сохраняется во взрослом ломтиками ткани SCN ^2-4. Таким образом, биологические часы могут быть легко изучены в лабораторных условиях, позволяющих молекулярном, электрофизиологические и метаболические исследования кардиостимулятора функции.

SCN является небольшой, четко определенных двусторонних сооружения, расположенного прямо над зрительных нервов ^5. В крысы он содержит ~ 8,000 нейронов в каждом ядре и имеет размеры приблизительно 947 мкм (длина, rostrocaudal оси) х 424 мкм (ширина) х 390 мкм (высота) ^6. Чтобы вскрыть из SCN необходимо вырезать мозг срез определенного уровня мозга, где SCN могут быть идентифицированы. Здесь мы описываем рассекает и нарезая процедуры сюжетные программы, которая одинакова для мышей и крыс мозги. Кроме того, мы покажем, как культура расчлененный ткани organotypically на мембрану ^7, методика, разработанная для SCN культуре ткани Yamazaki и соавт. ^8. Наконец, мы показали, как трансгенной ткани могут быть использованы для измерения выражение часовых генов / белков с использованием динамических люциферазы технологии репортер, метод, который первоначально был использован для измерения циркадных Geusz и соавт. ^9. Мы здесь, используют SCN ткани от трансгенных нокаут в период2:: люциферазы мышей производства Ю и др. ^10.. Мышей содержат белок слияния периода (PER) 2 и люциферазы светлячка фермента. Когда PER2 переводится в присутствии субстрата для люциферазы, т.е. люциферин, PER2 выражение можно наблюдать, как при биолюминесценции люциферазы катализирует окисление люциферин. Число излученных фотонов положительно коррелирует с количеством производится PER2 белка и биолюминесценции ритмы матча PER2 ритм белка в естественных условиях ^10. Таким образом, циклическое изменение PER2 выражение может находиться под постоянным контролем в режиме реального времени в течение многих дней. Протокол мы следуем для культивирования тканей и в режиме реального времени биолюминесценции запись была тщательно описывается Ямазаки и Такахаси ^11.

протокол

1. Решение Подготовка

1. Культура среды с воздухом буферной емкости
   1. Заполните 1 л бутылка с примерно 800 мл стерильного H ₂ O (автоклавного MilliQ H ₂ O).
   2. При перемешивании, добавить и перемешать следующих веществ: 1 контейнер низкий уровень глюкозы, бессывороточной DMEM 2902 порошок без бикарбоната натрия и фенола красного (фенол красный мешает биолюминесценции сигнала), 20 мл B27 дополнения 50x, 4,7 мл 7,5% NaHCO ₃ решения (или 0,35 г NaHCO _3), 10 мл HEPES 1М, 2,5 мл PenStrep 10000 ед / мл и 3,5 г D-глюкозы. Пусть среда, движение пока ингредиенты полностью не растворится.
      Окончательный среды (1 литр) будет содержать:
      1x DMEM, 1x B27 добавки, 4,2 мМ NaHCO _3, 10 мМ HEPES, 25 ед / мл пенициллина, 25 ед / мл стрептомицина и 19 мм D-глюкозы.
   3. Отрегулируйте рН до 7,2 с использованием NaOH, чтобы уменьшить или увеличить HCl рН, и довести объем до 1 л стерильной H ₂ O.
   4. Отрегулируйте осмоляльности с H ₂ O (уменьшение осмоляльности) или D-глюкозы (увеличение осмолярности). Осмоляльность должна быть в пределах 285-315 мОсм / кг, но оптимального диапазона 300-310 мОсм / кг. Не разбавить среду более чем на 5%.
   5. Фильтры питательной среды использования Corning стерильной вакуумной фильтрации множеств (например, 2 х 500 мл с размером пор 0,22 мкм) в стерильных капотом. Держите среды в 4 ° C и защитить его от света с помощью алюминиевой фольги. Мы рекомендуем, чтобы среда используется в течение 3 месяцев.
2. Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) буфера с добавками (для резки ломтиками)
   1. Заполните 1 л стеклянную бутылку с ~ 600 мл стерильного (автоклавного MilliQ) H ₂ O и добавить следующие вещества: 100 мл HBSS 10x акций, 10 мл пенициллина стрептомицин-10000 ед / мл, 5 мл 7,5% NaHCO ₃ раствора и 10 мл HEPES 1М.
      Окончательное решение резки будет содержать:
      1x HBSS, 10 мМ HEPES, 4,5 мМ NaHCO _3, 100 ед / мл пенициллина и 100 ЕД / мл стрептомицина.
   2. Проверьте рН и, при необходимости, отрегулировать рН до 7,2 и довести объем до 1 л стерильной H ₂ O.
   3. Проверьте осмоляльности, которая должна быть в пределах от 285-315 мОсм / кг.
   4. Прохладный HBSS до 4 ° C. HBSS буфер должен быть очень холодно (4 ° С) в процессе резки / разделки процедуры для того, чтобы сбить обмен веществ и сохранения жизнеспособности тканей.

2. Подготовка Прежде чем стричь и Культивирование Ломтики

1. Ткани культивируют в теплом сухом камеру без CO _2. Для того чтобы избежать высыхания культур должны быть запечатаны с крышкой стекла придает блюдам от смазки. Для этого, заполните 5 мл шприцы с силиконовой основе вакуумной смазкой. Обложка шприц подсказки с маленькими кусочками алюминиевой фольги и автоклава них. Кроме того, автоклав фильтровальную бумагу (используется в процессе нарезки процедуры).
2. Непосредственно перед процедурой нарезки, применять смазку автоклавного вакууме на верхней поверхности кольца 35 мм чашки Петри. Подготовка отдельной чашке Петри для каждого сектора культуры.
3. Перед началом процедуры нарезки всех нестерильных инструментов, бритвенные лезвия, vibratome лезвия, покровные стекла и других материалов, используемых для процедуры ломтик и культуры должны быть стерилизованы. Спрей все нестерильный инструментарий с 70% этанола. Expose инструментов и смазанную чашки Петри с УФ в стерильных капот, по крайней мере 30 минут ультрафиолетового облучения до культивирования.
4. В то же время, заполнить трубку Сокол с воздухом буферизации культуральной среде (кол 1,2 мл для каждой культуры; на 8 культур подготовиться к примеру 10 мл среды) и добавить свежей талой люциферин (0,1 М маточного раствора; Promega, Madison, WI) (10 мкл люциферин до 10 мл среды; конечной концентрации 0,1 мМ).
5. Люциферин является светочувствительным, и оба фондовых решений и люциферин среде, содержащей должны быть защищены от воздействия света. Поместите пробирку Сокол с люциферин-среды в темной камере 36-37 ° С отоплением. Если это уместно, люциферин также могут быть добавлены непосредственно в культуре блюда во время резки. Если люциферин не добавляется, не будет никакой реакции между светом и люциферазы люциферин и, следовательно, никакого сигнала от ткани.
6. После УФ-облучения, приложите стерильную лезвие vibratome.

3. SCN нарезки Процедура

Следующая процедура описывает, нарезки из взрослых, как правило, 2-4 месяцев, C57/BL6 мышей. Пожалуйста, обратите внимание: Процедура снятия, а также освещенности животное в ночное время, может дифференциально сброса фазы SCN. Чтобы избежать этого, резки и культивирования следует проводить в течение светлой части суток, предпочтительно между ZT 6-12, при отсутствии существенных фазовых сдвигов из-за процедуры происходит ^12. Если SCN должен производиться отбор проб в темноте, 3.1 и 3.2 должны быть выполнены в красном свете или ночью очки, чтобы избежать светоиндуцированного фазовые сдвиги.

1. Анестезию мыши предпочтительно isofluorane (Baxter) в гласс камере. Когда животное потеряло свою боль рефлексами (проверьте, зажимая с гвоздями в лапы), но еще не перестал дышать (для поддержания снабжения кислородом как можно дольше), быстро обезглавить голову ножницами или аналогичный.
   Пожалуйста, обратите внимание: в некоторых странах CO ₂ экспозиции (гиперкапния) по-прежнему разрешено как метод анестезии, хотя он, как сообщается, содействия животным беспокойство. Кроме того, рак шейки дислокации может потребоваться до обезглавливания. Пожалуйста, следуйте местным законодательством, когда эвтаназии животных.
2. Удаление глаза от головы ножницами во избежание деформации и дальнейшее возбуждение зрительных нервов, которая может повредить SCN.
3. Если еще привязаны, удалить последнего шейного позвоночного ножницами, снять кожу (рис. 1а) и сделать два надреза с тонкой ножницы (например, радужная оболочка глаза ножницами), одного разреза с каждой стороны черепа по бокам, что делает съемный "крышка".
4. Откройте череп с микро инструмент костные кусачки (штрафа рассекает ножницы также могут быть использованы на мышь) и удалить все кости до обонятельной луковицы могут быть видны. Работа вверх, никогда не давит мозг с инструментом, для того, чтобы предотвратить повреждение брюшной SCN (рис. 1b).
5. Аккуратно вырежьте зрительного нерва между обонятельной луковицы и полусфер с использованием тонких микро рассекает весенний ножницами. Убедитесь, что нерв полностью вырезать с растяжением зрительного нерва может привести к повреждениям в SCN и разорванные кусочки.
6. Включите голову вверх дном и пусть интактном мозге выпадают (если еще привязаны к мозгу, других черепных нервов, возможно, придется сократить каудально по отношению к зрительному нерву) в контейнере (например стеклянном блюде Петри ≈ 10 см), заполненной 50-100 мл холодной HBSS позволяет быстрое охлаждение мозга. В идеале, два зрительных нервов должны оставаться нетронутыми (рис. 1в). Держите мозга в HBSS 30-60 секунд, чтобы убедиться мозг охлаждается.
7. Используйте ложку или аналогичных и месте охлажденными мозг, спинной поверхностью вверх, на стерильной поверхности резания (например стеклянном блюде Петри крышку вверх дном). Для того чтобы подготовить корональные вырезать, сделать перпендикулярно резать стерильными лезвия бритвы или скальпеля между полушарий и мозжечка, удалив таким образом мозжечка.
8. Применить суперклей на сухой платформы принадлежащих vibroslicer / vibratome.
9. Возьмите мозга (полушарий без мозжечка и без обонятельных луковиц), вставляя острый, изогнутый пинцет в ростральной части и тщательно высушить HBSS на стерильную фильтровальную бумагу, все еще держа мозга с щипцами. (Вместо вставки щипцы, небольшой кусочек стерильной фильтровальной бумаги могут быть использованы для подключения и передачи головного мозга).
10. Fix полушарий на клееного платформу с ростральной вверх наконечником и брюшной поверхности ближайшей к режущее лезвие. Прикрепите платформу в держатель принадлежащих vibratome (например, из Campden Instruments, Великобритания) и сразу же заполнить его с холодным HBSS. Если перпендикулярно отруб делается правильно, полушарий должны стоять прямо вверх таким образом обеспечивая хороший угол, необходимой для принятия корональные вырезать содержащие двусторонних SCN.
11. Для того чтобы достичь целевой области сюжетные программы, начать отрезать толще разделах (500-800 мкм) полушарий в условиях высоких или максимальной скорости vibratome. Перемещение лезвие может быть довольно быстро в начале, не достигнув гипоталамуса, но должны быть замедлены, если зрительных нервов становится видимым (высокие частоты вибрирующей лезвие и медленное движение горизонтально уменьшает повреждение клеток в процессе нарезки, тем самым увеличивая жизнеспособность срез). Уменьшить разделы до 100 мкм при зрительных нервов становится больше (шире) и передняя спайка становится меньше. Для того, чтобы приобрести середине SCN раздела работу самостоятельно "вниз" (каудальном направлении), пока две SCN ядер начинают появляться. Увеличительное стекло может быть необходимо для визуализации ядер. Пожалуйста, обратите внимание: SCN в мозг мыши находится более хвостовых из зрительных нервов по сравнению с мозга крыс.
12. Когда желаемый уровень SCN был достигнут (SCN будет в этот момент появляются как более определенным, круглые или миндалевидные структур; рис 1d; примерно брегмы-0,46 -0,70 мм для центра области SCN в мышиных ^13, брегмы - 0.92--1,40 мм для крысы ^14), вырезать SCN разделе (рис. 1д). Подходит толщина среза для мыши 250 ± 50 мкм, для крыс 350 ± 50 мкм.
13. Используя мягкую кисть, лифт и передачи SCN срез на крышке от средних Петри заполненный холодным HBSS, помещенных под микроскопом диссекции или стереоскоп. Проверьте, если при увеличении двустороннего SCN четко виден. Если в середине области SCN будет выбран (которая не обязательно может быть только "оптимальный" срез уровне, но мы считаем, что это самый простой способ стандартизировать процедуру нарезки и уменьшить вариации), он должен быть отчетливо видны по крайней мере на с одной стороныломтик разделе. Если разрез был слишком ростральной, сделать еще один раздел и проверить его на SCN при увеличении.

4. Органотипической культуре SCN

1. В крышке чашки Петри заполнены HBSS, рассекать из двусторонних SCN в виде квадрата ткани (~ 1,5 мм с каждой стороны) с парой стерильных скальпелей при вскрытии микроскопом. Небольшой кусок зрительных нервов будет оставаться прикрепленной к эксплантов, но никаких других ядер должны быть включены. Вырезать как можно ближе, не снимая SCN ткани.
2. При необходимости для планируемого эксперимента, двусторонние SCN могут быть сокращены в два раза для получения двух односторонних SCN. Один односторонний SCN затем могут быть использованы в качестве контрольных (рис. 2а).
3. Заполните 1200 мкл люциферин-среды в ≈ 35 мм чашки Петри и место культуры мембраны (Милли-CM 0,4 мкм, Millipore, Bedford, MA) в верхней части поверхности жидкости (2b). Объем питательной среды имеет решающее значение, как культура мембраны должны сидеть в безопасности на базе культуры блюдо, а не плавать или скалы в среду ^11. Убедитесь Есть нет пузырьков воздуха под мембрану. Избегайте ненужных освещенности при работе с люциферин.
4. Эксплантов малы и трудно подобрать. Поэтому используйте 1000 мкл пипетку + чаевые сосать SCN эксплантов в кончик и нажмите ее на мембрану. В случае эксплантов слишком велик, чтобы легко вписаться в 1000 мкл кончиком пипетки (например, крысы SCN; и мышь двусторонних SCN) наконечник может быть сокращено с стерильный инструмент для создания более широкого открытия. Отменить чрезмерного HBSS на мембране с пипеткой. Для люциферазы записи, поместить только один SCN / блюдо (рис. 2б), а запись труб обнаружения всех фотонов, испускаемых от блюдо и не различают сигналы из различных тканей.
5. Печать блюдо с защитным стеклом (≈ 40 мм, Menzel-Glaser, Германия) и вакуумной смазки (Dow Corning Corp, США) ^11. Убедитесь, что печать является жесткой (рис. 2в). Если нет, то печать с более жира.
6. Передача блюд 36-37 ° C светонепроницаемой камеры и начать ПМТ-записей сразу.

5. Измерение активности люциферазы от Запись Биолюминесценция

Люциферазы вызванных биолюминесценции сигналы от небольших ткани SCN определяются и усиливаются с photonmultiplier-(ФЭУ) детектор сборки установки внутри свет герметичной камере. ФЭУ, как правило, расположены ~ 1-2 см выше культура блюда ^8. Установках PMT запись можно на заказ, или имеются в продаже ^11.

1. Место блюдо под PMT (тепло от ГУП удаления конденсата на покровного стекла) и закрыть камеру. Убедитесь, что камера на 100% светонепроницаемой как темные количество ФЭУ используются для SCN тканях является очень низким (менее 20 фотонов / мин). ФЭУ обнаружить даже самый слабый свет утечки.
2. Начало сбора данных, которая выполняется с помощью программного обеспечения (например LumiCycle; Actimetrics Inc, Wilmette, Иллинойс, США). Фотоотсчетов интегрируются по 1-10 минутные интервалы, чтобы получить высокое разрешение ген / экспрессии белка.
3. После завершения записи, полученные циркадных экспрессии гена / белка могут быть проанализированы с соответствующим программным обеспечением (происхождение, OriginLab, Нортхемптон, Массачусетс, США; ClockLab, Actimetrics; LumiCycle, Actimetrics Inc; Chrono, До Roenneberg, Мюнхенского университета, Мюнхен, Германия), чтобы определить фазу, период (время для одного цикла) и амплитуды ритма. Пик экспрессия гена или белка в основном используется как точка отсчета и определяется как высокий фотона счет в течение одного цикла. Данные могут быть сглажены до анализа фазы, периода и амплитуды, особенно если соотношение сигнал / шум низкий. Базовые иногда изменения и должны быть вычтены до анализы выполняются.

6. Представитель Результаты:

Мы здесь присутствует колебательные PER2:: LUC выражения зачитал на жизнеспособность и состояние культурной ткани. При оптимальных условиях, и если ткань живая, PER2:: LUC выражение колебания с суточным ритмом, как показано на рисунке 3. PER2 в SCN максимально выражены обычно около Zeitgeber Время 12-13 (где ZT 12 представляет выключенным светом в 12:12 час свет: темно-цикла). Больше по размеру, живая ткань, тем больше фотонов счет становится. Тем не менее, размер и толщина organotypically культурной ткани должны быть небольшими, чтобы сохранить жизнеспособной ткани, предпочтительно не более 15 мм ^{2 11} и толщиной не более 500 мкм ^7. SCN, если расчлененный, как описано здесь, как правило, показывает, фотоотсчетов между 10.000-40.000/min если ткань выборку из гомозиготных PER2:: LUC животного. Амплитуда колебаний в органотипической культур SCN, как правило, очень высокой в ​​течение первого цикла по сравнению со следующими циклами. Это не совсем понятно, почему первый цикл имеет очень высокую amplitУдэ. Одно из возможных объяснений является то, что значительная часть клеток в ткани могут умереть вскоре после начальной резки и культивирования, при этом не используя люциферин после первого цикла. Процедура снятия, также могут вызывать чрезмерное возбуждение, которое может усилить люциферазы сигнал во время первого цикла.

На рисунке 3 показана люминесценции следы от SCN ломтиками и содержит один след (красный), полученных из среза, что изначально не здоровы. Мертвые или нездоровые ткани имеют низкую фотона базовых счет. (Кроме того, мертвые ткани часто диссоциируют в блюдо и не могут быть удалены из мембраны в одной части.)

Методике, описанной в настоящем докладе, могут благотворно быть использованы в фармакологических экспериментов. Рисунок 4 показывает след от культуры, которые мы рассматривали между днем ​​1 и 2 с блокатор HCN канал (ZD7288, 10 мкм). Как видно на рисунке, и, как опубликованные ранее ^15, блокаторов значительно снижается амплитуда суточного колебания PER2, однако после вымывания с нормальной культурной среде колебаний вернулась, демонстрируя, что блокатор пострадавших молекулярные часы, но ткань была жизнеспособным и здоровым.

Рисунок 1. Процедура нарезки
) Глава эвтаназии обезглавленное мышь с глазами и кожей удалены. B) черепа удаляется с микро инструмент костные кусачки. При использовании инструмент, нужно работать вверх и никогда не давите мозга с инструментом. C) мозга показали вверх дном (вентральной стороной вверх) без обонятельных луковиц. Белый зрительных нервов с двумя нетронутыми зрительных нервов могут быть видны. Супрахиазматического ядра (SCN, границы, отмеченные красным цветом) находится недалеко от зрительных нервов. D) коронки вырезать мозг прилагается к платформе в vibroslicer, на уровне SCN. E) Корональные раздел мозга (250 мкм) содержащие зрительных нервов (OC), третий желудочек (3В) и двусторонние супрахиазматического ядра (SCN).

Рисунок 2. Органотипической культивирования тканей.
А) два односторонних ядер SCN (вставка) расчлененный от среза показано на рисунке. B) Культура блюдо (35 мм чашки Петри) с культурой мембраны, средний и эксплантов, но без жира вакуумом и покровного стекла. Средний (1,2 мл) можно рассматривать как жидкость между тарелкой и мембраны. Один односторонний ядра SCN делается на культуру мембраны. Белое части тонкой ткани кусок зрительных нервов (вставка). C) культуры блюдо с ее мембраны и ее SCN ткани, запечатанных смазкой вакуума и круглой стеклянной крышкой.

Рисунок 3. Биолюминесценция записи от здоровых и не здоровых культур SCN ткани.
Примеры биолюминесценции записи период2:: люциферазы (PER2:: LUC) выражение в ядре супрахиазматическое (SCN) ломтиками, полученных от мышей состоялось в 12 часов: 12 часов света: темные цикла. PER2:: LUC белка колеблется с циркадных (~ 24 часов) изменения, в которых максимальное выражение белка происходит на Zeitgeber время 12-13. Таким образом, фаза ритма гена зависит от света темными график, в котором животное находилось до принесен в жертву. Как правило, биолюминесценции от односторонних тканей SCN расчлененные, как описано в протоколе показывает фотоотсчетов между ~ 10.000-40.000/minute. Рисунке показаны следы от одного здорового (черный) SCN культуры, один не здоровые SCN культуры (красный) и один SCN культуры, которые высохли (синий) после вскрытия запечатанных блюдо культуры на 4-й день, а не повторного уплотнения блюдо правильно ( указано стрелкой).

Рисунок 4. Биолюминесценция записи во время и после наркотиков экспозиции.
PER2:: LUC выражение в культуре до, во время и после действия блокатора HCN канал (ZD7288, 10 мкм). Первая стрелка указывает время, когда блокатор был добавлен. Вторая стрелка указывает вымывания, которая была сделана заменяя препарат, содержащий среду с кондиционированной среды управления. Обратите внимание, снижение амплитуды после 2 дней препарат воздействия, отсутствие колебаний в день 4 и быстрое восстановление белков ритма после вымывания.

Обсуждение

Преимущества и недостатки технологии репортер люциферазы

В отличие от бывшего методы естественных условиях, например, RT-PCR, на месте гибридизации и иммуноблоттинга, которые требуют отбор проб ткани в разных точках времени (предоставление низком разрешении время обычно 2-4 часа в зависимости от частоты дискретизации) с целью изучения суточной вариации гена и белка выражения, люциферазы технологии репортер позволяет с высоким разрешением (1-10 мин) изучение циркадных колебаний в течение многих дней в том же препарате. Таким образом, число используемых животных сведена к минимуму и детальные исследования влияния на фазу и период ритма возможности, которые обычно не представляется возможным с использованием обычных методов отбора проб с низким временным разрешением. Однако, несмотря на относительные измерения амплитуды ритма возможно, следует подчеркнуть, что репортер технологии не количественные и поэтому не могут быть использованы для измерения количества транскрипции генов или переведены белков.

Ткани записи может быть запущен и проанализированы сразу после культивирования, большое преимущество для непосредственного изучения молекулярных эффектов в естественных условиях стресса, в естественных условиях светоиндуцированного фазовые сдвиги и т.д. органотипической культуры SCN позволяет длительно (недели) фармакологических манипуляций взрослого мозга ткани, содержащей нетронутыми зрелый синаптической сети и технологии репортер люциферазы позволяет стабильной записи в течение многих недель. Таким образом, ткань не должна быть новорожденных или раннем послеродовом для получения здорового культур, и в отличие от острого хронического часть фармакологического лечения может быть выполнена. В отличие от плазмид-репортер трансфекции в клеточных культурах, которые не приводят к включению ДНК в геноме трансгенных люциферазы-моделях на животных (а также Lenti-вирус трансфекции) благоприятны, если эпигенетические изменения должны быть изучены. Следует в этом контексте также отметить, что свечение изображения в наше время можно с высокочувствительной ПЗС-камер ^11, что позволяет даже в записи отдельных нейронов SCN (~ 6-10 мкм) и другие типы клеток, используемых крупными лабораториями изучение циркадных ритмов. Наконец, несколько циркадных следователи обычно используют мониторинг молекулярного выражение с помощью других журналистов, например, зеленого флуоресцентного белка, с целью изучения генов часы / белка колебаний ^16-19.

Аспекты толщина среза

Здесь рекомендуется толщина среза SCN (200-300 мкм) может быть уменьшен или увеличен по желанию. Однако, несмотря на ткани выравнивается на мембране через несколько дней в культуре, это не рекомендуется превышать 500 мкм, толщина сначала вырезать часть, чтобы сохранить жизнеспособность тканей ^7. Ломтик тоньше, чем 100 мкм механической и практическим причинам трудно справиться. Потому что SCN ткани неоднородна толщина среза может повлиять на фазе люциферазы выходной сигнал, так как различные регионы внутри SCN (например, "ядро" против "оболочки", и спинной сравнению с вентральной области) колеблются с различными фазами ²⁰ и дифференциально повторную синхронизацию после фазы ^21. Толщина среза также влияет на базовые фотонов подсчет, так как больше ткани излучает большее количество фотонов. Амплитуда молекулярных колебаний может, таким образом, косвенно влиять размер эксплантов. По этим причинам, контроля и обработанных культурах всегда должен быть того же размера, толщины и содержащую же области SCN для того, чтобы колебаться в одинаковой фазе и с одинаковой амплитудой. Две односторонние ядер, с другой стороны, колеблются в фазе друг с другом и с аналогичными амплитуд тех пор, пока vibratome разрез горизонтальной, а не угловой (который, в свою очередь зависит от этого разделения разрез между мозжечком и двух полушарий перпендикулярно к поверхности стола). Следователь, который выполняет SCN культивирования могут возникнуть, что SCN культуры не колеблются в фазе друг с другом. Практика и стандартизация нарезки техники, то есть ломтики всегда срезают в то же rostro-каудальном уровне SCN, улучшит результат.

Критические шаги

1. Кислорода имеет решающее значение.
   Потому что мозг требует много кислорода ^22, нарезка процедура должна быть быстрой (ближе 3.1-3.10 это ~ 5-6 минут лучше это для того, чтобы сохранить здоровую ткань).
2. SCN чувствителен к изменениям температуры и среднего обмена.
   SCN чувствительна к температуре и большие перепады температуры могут сдвиг фазы кардиостимулятора и вызвать экспериментальные артефакты ^23. Если средний или решения обменять или добавлены в течение текущего эксперимента, например при применении препарата после нескольких дней в культуре, средний или Solutioя должна быть предварительно нагревают до 36-37 ° С (той же температуры, как в камере) до того. В фармакологических экспериментов, которые связаны среда обмена, важно всегда работать с предварительно кондиционированной среде клеточной культуры. Сложение / вымывания со свежим, безусловного среды может потенциально фазовый сдвиг молекулярной ритм SCN ^24, а также других типов клеток культур ^25.
3. Средний состав.
   Важно культуры ткани в правильном рН и осмоляльности. Воздуха буферизации среда содержит большое количество HEPES, которая имеет оптимальную емкость буфера в диапазоне рН 6.8-8.2, а также подходит для буферизации рН изменения, которые могут возникнуть в результате клеточного дыхания. HEPES, с другой стороны, более чувствителен к изменениям температуры по сравнению с бикарбонат натрия, который входит в небольших количествах в культуральной среде. Бикарбонат натрия имеет большую буферную емкость в нижней рН (5.1-7.1) диапазоне ^26, при этом уместно в CO _{2 в} атмосферу. Однако увеличение количества бикарбоната натрия в воздухе буферизации средой (DMEM 2902) увеличивается осмолярность значительно и не могут быть добавлены без одновременного разбавления среды, которая в свою очередь, приводит к неправильным составом аминокислот, витаминов и ионов.
   Советы для подготовки среды:
   1. Будьте точны и осторожны при перемешивании среды.
   2. Используйте только свежие или свежей талой растворы.
   3. В случае очень высокой осмолярности не стоит разбавления. Более 5-6%-разбавленной среде будет, скорее всего, не работает. Использование D-глюкозы увеличение осмоляльности, если оно слишком низкое.
4. Фазовые сдвиги в связи с подготовкой времени
   Время подготовки срез имеет решающее значение. Ноль или минимальное влияние на фазы получается, если срез процедура выполняется между ZT 6-12 ^12. Все ломтик вскрытия должны быть выполнены в той же фазе суточного или циркадный цикл для того, чтобы свести к минимуму ошибки из-за изменения фазы между препаратами.

Возможные изменения

1. При острых электрофизиологии SCN, нарезка должна быть выполнена с Ringer (искусственный Cerebro спинномозговой жидкости; ACSF) буфера, насыщенной кислородом (95% O _2, 5% СО ₂₎ до нарезки начинается. Кроме того, кислород необходимо постоянно добавляют буфер во время всей процедуры нарезки, как электрические и синаптической активности напрямую зависит от подачи кислорода ^22.
2. Горизонтальные и сагиттальной ломтиками также может быть успешно подготовлена ​​и культурная о ПДЧ. Авторы имеют опыт работы с люциферазы записей в горизонтальных срезов, которые, согласно нашему опыту дать циркадные колебания с меньшей амплитудой по сравнению с корональной разреза.
3. SCN составляет около 1 мм длиной rostro-каудально и нарезки методике, описанной здесь ориентирована в направлении получения ПДЧ раздел в центральном регионе. Тем не менее, более одной SCN разделе могут быть получены из мышей и крыс мозг, позволяя исследование циркадных генов / экспрессии белка на более ростральной по сравнению с хвостовой уровней SCN ядра.
4. Фрагмент культур от молодых животных, послеродовой щенков или даже эмбрионов, также могут быть получены. Пожалуйста, обратите внимание, что мозг и череп у очень маленьких щенков очень мягкие и чувствительные. Кроме того, зрительного нерва тонкая и не полностью развита. Будьте осторожны при вскрытии мозга детенышей, так что SCN регионе не была повреждена. Например, микро костные кусачки средства не могут быть использованы для открытия черепа мыши щенков, потому что они слишком большие. Изобразительное ножницы достаточно, чтобы сократить мягких тканей у маленьких щенков.
5. Покровного стекла техника выполнения культуры описанные здесь, могут быть также использованы для изображения свечения использованием CCD / EM-CCD камерой, а также в отдельных нейронов SCN.
6. Другие регионы центральной нервной системе и периферических тканях органов у трансгенных PER2:: LUC животные могут быть легко получены, культурный и проанализированы в терминах молекулярных колебаний, как PER2:: LUC выражении продолжает колебаться в течение многих дней и в ряде других тканей и типы клеток ^10. Большинство из этих периферических тканях, например печени, не требуют мембраны для выживания, но вместо этого культурного непосредственно купались в среду ^11. Обратите внимание, что сдвиг фаз за счет секционирования, культивирования и среднего биржи не могут следовать тем же принципам, по ПДЧ.

Значение

В трансгенных мышей и крыс штаммов (mPER2:: LUC; mPer1-Люк ^{8, 10, 27),} активность люциферазы фермента отражает белка или ритмы экспрессию генов и могут быть оценены по биолюминесценции записи. Люциферазы генерируемых биолюминесценции дает слабый сигнал, но фон свечения близка к нулю, что делает этот метод выгодно. Более того, поскольку люциферазы молекула неустойчива и быстро деградирует нет телототоксичность, которые могут появиться при длительном освещении возбуждающим ^28. Взятые вместе, эти свойства позволяют длительное экспериментов делает люциферазы технологии репортер весьма выгодным в циркадных исследований.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
B27 supplement 50x	Invitrogen	17504-044
Cover glasses	Menzel-Glaser	40#1	≈ 40 mm
Culture membranes	EMD Millipore	PICMORG50	0.4 μm
DMEM low glucose w/o phenol red	Sigma-Aldrich	D2902	Powder for 1L
Filter paper	Whatman, GE Healthcare	1003 055	≈ 55 mm
Filtration set	Corning	431097	Pore size 0.22 μmPolyethersulfone
Forceps	Allgaier Instrumente	0203-7-PS	Dumant #7
HEPES	Invitrogen	15630-056	100 ml
HBSS 10x	Invitrogen	14065-049	500 ml
NaOCH3 7.5%	Invitrogen	25080-060	50 ml
Luciferin	Promega Corp.	E1602	Beetle luciferin, potassium salt
Micro rongeur tool	Allgaier Instrumente	332-097-140
PenStrep 10,000 U/ml	Invitrogen	15140-122	100 ml
Petri dishes	Corning	430165	≈ 35 mm
PMT	Hamamatsu Corp.	H9319-11MOD
Disposable scalpels	Paragon	P503	Size 11
Vacuum filter	Fisher Scientific	09-761-5
Vacuum grease	Dow Corning		50 g
Vibratome	Campden Instruments