Стратегии для определения де Ново Мутации в общих расстройств, таких как аутизм и шизофрения

Резюме

Молекулярно-генетическая стратегия для поиска заново мутации, вызывающие общие расстройства, такие как аутизм и шизофрения.

Аннотация

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness¹ and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them². This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia³. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4–6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males⁴. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

протокол

1. Выбор заболевание, которое может быть вызвано заново мутации

Болезнь, которая соответствует следующим критериям может поместиться с мутацией гипотеза заново:

1. Репродуктивной снижается.
2. Частота заболевания является относительно высоким и постоянным, несмотря на самых разных средах.
3. Заболевание связано с более высоким отцовской возраста.
4. Классический связи и ассоциации исследования не смогли объяснить, значительная часть болезней наследуемости.
5. Близнец данных согласованию поддержку модель заново.

Анализ вероятности того, что распространенное заболевание, где заново мутации могут частично объяснить генетической основе является важным первым шагом.

2. Выбор случаях и образцы ДНК

Выбор соответствующих образцов имеет решающее значение для успеха идентификации заново мутаций. Чтобы максимизировать шансы найти заново мутации, мы рекомендуем следующее:

1. Выберите случаях с ранним возрастом начала, тяжелая фенотип, с родителей не влияет, пожилые отцы и без каких-либо расширенной семейной историей этого заболевания.
2. Выбор пациентов, у которых доступны ДНК достаточно для проведения исследования. Особенно важным является наличие ДНК из первоисточника ячейки, не подвергался культивирования (например, ДНК крови или слюны ДНК),
3. Наличие как ДНК родителей имеет решающее значение для того, чтобы определить статус мутации передачи (наследуется против заново). Наличие дополнительных пострадавших контингентов и нормального управления необходима для генетических исследований проверку один раз генов-кандидатов определены.
4. Оценка размера выборки на основе мутаций скорость, количество генов, чтобы пройти обследование и оценка часть дел, которые могут быть результатом мутации заново.

3. Гена resequencing, два основных подхода

1. Высокое качество низкое секвенирования пропускную
   Этот подход основан на генов-кандидатов подходов.
   1. Выбор кандидата гена (ов)
      Выбор лучших генов-кандидатов на основе балльной системы, которая построена на 6 основных критериев. Затем рассчитать общее, что соответствует сумме всех точках объяснить, используя шесть критериев, перечисленных в таблице 1. См. пример из нашего проекта в рисунке 1 выбрана и не выбран распределения генов.
      
      Таблица 1. Критерии, используемые для отбора генов кандидата
      
      
      Рисунок 1. График распределения отобранных и не выбран для секвенирования генов в нашем проекте. Мы получили распределение генов ранжированных по кандидату свойств путем сортировки генов в зависимости от их оценка стоимости. Например, SHANK3 и NRXN1 генов, два гена, которые мы обнаружили мутации заново, если бы оценка 7 и 6 соответственно (максимум 12).
   2. Дизайн праймеров использованием Primers3 программное обеспечение через Exonprimer. Только кодирующей области и замкнуть соединения должны быть покрыты в том числе дополнительные 50 пар оснований с каждой стороны экзона.
   3. Оптимизация ПЦР условия для выбора Taq, реакционного объема и т.д.
   4. Оптимизация всех ПЦР фрагментов
   5. Amplify 5 нг геномной ДНК, извлеченной из образцов крови, в соответствии со стандартными процедурами
   6. Перед отправкой для секвенирования, сделать контроль качества Ваших продуктов ПЦР путем загрузки 2% агарозном геле. Выбранные случайным образцов.
   7. Последовательность продуктов ПЦР на ДНК-анализатор на одной пряди. Фрагмент считается успешной, если последовательный анализ более чем 90% от следов возможно. Это применимо для скрининга большого масштаба.
   8. Варианты определения
      1. Используйте средства для диагностики и генотипирования геномных вариаций, таких как PolyPhred, Polyscan и Мутация Surveyor. Сочетание более чем на 2 средства обнаружения является идеальным. Например, PolyPhred v.5 и v.6 PolyPhred с настройками по умолчанию не обнаруживают же вариации. Polyscan v.3 имеет более высокий процент ложных срабатываний мутации ОНП (96%) и меньше для INDELs (93%). PolyPhred v.6 не обнаружено большинство истинных INDELs но процент ложных срабатываний мутации (для INDELs) ниже, чем Polyscan v.3 в целом (90%). Мы должны устранить возможность SNPs обнаружения Polyscan v.3 и держать обе PolyPhred v.5 и v.6 PolyPhred для варианта обнаружения. Surveyor Мутация и Polyscan лучше для обнаружения indels. Примечание: опция обнаружения SNP не следует применять при использовании Polyscan. Только "INDEL" опция должна быть включена. Polyscan генерируется много ложных срабатываний для выявления SNP.
      2. Для каждого уникального варианта exonic роман обнаружено, подтвердите его вручную reamplifying фрагмент и resequencing пробанда и оба родителя использовании обратного и прямого праймера, чтобы устранить любые технические артефакты.
2. Всего ExoME секвенирования
   Такой подход является высокая пропускная способность секвенирования ориентации большинства кодирования областей человеческого генома. Сейчас мы находимся в настоящее время используют этот новый подход в нашей лаборатории, ускорения выявления потенциальных генов-кандидатов.
   1. Заказать "SureSelect правам Все Экзон" ориентации кодирующей области более 16000 генов (50 Мб генома) разработан Agilent или любой другой аналогичный продукт от других подобных Рош. До целью захвата комплект, секвенирование платформы должны быть определить (Illumina против твердого тела).
   2. Как захватить в соответствии с протоколом Agilent
   3. Последовательность продукта на соответствующие доступные платформы нового поколения
   4. Вариант обнаружения со всей последовательности ExoME: несколько инструментов биоинформатики для обнаружения и генотипирования геномных вариаций из следующего поколения секвенирования платформы имеются такие, как BWA, Bfast, Bioscope который позволит выполнить выравнивание. После того, какие дополнительные свободно доступных инструментов вниз по течению (например SAM инструменты, Varscan, Annovar) был бы нужен был вызов и комментировать варианты. Коммерческие программы, которая включает выравнивания, и призывая вариант и аннотации также доступны такие как, NextGEN (Softgenetics), КГО Био и др.

4. Геномная приоритетов вариантов

Выявленные варианты, то в качестве приоритетных для последующей деятельности в соответствии с их вероятность в том, чтобы заново и вредными для белок или РНК функции и / или структуры. Вариант последующих приоритетов для определения варианта заново должны быть следующие:

1. Уникальные вариаций (наблюдается один раз в одном случае)
2. Вариации нет в родителей
3. Белково-усечения вариациях: глупости, ведущие к indels сдвигом рамки и сращивания мутаций.
4. Миссенс и тихо изменения согласно прогнозам, будет функционально разрушительным (например, влияют на мРНК, сплайсинг). Используйте Polyphen, SIFT и PANTHER для функционального эффекта прогноз на белок.

Если вы используете целые последовательности ExoME, подбор генов-кандидатов, могут быть использованы в качестве стратегии для определения приоритетности вариантов для дальнейшего изучения.

5. Генетические проверки

1. Resequence весь ген в дополнительных случаев пациента (для выявления других причинных мутаций) и в контрольной группе. Контрольные образцы будут использованы для оценки частот аллелей приоритетных вариантов. Любой ген, содержащий по крайней мере два различных заново вредных мутаций (нонсенс, сплайсинг, frameshifts, и предсказал, повреждения миссенс) обнаружили у разных пациентов (но не в контрольных образцах или общественных баз данных) должна быть высокой приоритетности для дальнейших исследований проверки. Это включает в себя: 1) тестирование на потенциальных дефектов сплайсинга в лимфобластоидных клеточные линии происходит от больного. По нашему опыту, большинство генов выход ПЦР-продуктов из лимфобластоидных клеточных линий, 2) исследовать измененными уровнями экспрессии белка количественными Вестерн-блот анализе белковых экстрактов из лимфобластоидных клеточных линиях и 3) дальнейшее испытание мутации / ген на функциональном уровне в животных (с Элеганс, данио рерио) и клеточная линия моделей, ранее выполнявшиеся нашей группы (например: 5,6).

6. Представитель Результаты:

После этого протокола, мы были в состоянии идентифицировать новые гены шизофрении и аутизма. Одним из примеров является нашей недавно SHANK3 гена открытие (рис. 2). Два разных заново мутации в гене SHANK3, один нонсенс-мутации обнаружены в трех пострадавших брата и одна миссенс мутация в одном пострадавших женщин.

Рисунок 2. () Разделение мутации R1117X нонсенсом в трех пострадавших братьев семьи PED 419. Пробанда, указанном стрелкой. (B) Разделение мутации R536W миссенс в пробанда, но не ее, не пострадавших брата в PED 56.

Обсуждение

Процедуру, описанную здесь направлен на выявление конкретных общих заболеваний, скорее всего, приведет, в частности, от De Novo мутации, и, чтобы доказать эту гипотезу. De Novo мутации хорошо отлаженный механизм для развития ряда заболеваний, например, синдромы наследственного рака, но была плохо изучены в распространенных заболеваний. Это частично является результатом технических проблем, связанных с идентификации заново мутации, которая требует секвенирования больших количеств ДНК, которая совсем недавно стала экономически эффективной с появлением Следующая Секвенирование поколения. Кроме того, мутации заново скорости у людей было, до самого последнего времени, только оценка. Только совсем недавно были ли там подчиняется непосредственно определяющие частоту мутаций у человека. До этих измерений, было трудно предсказать размер выборки необходимых для такого рода исследование и определить, если наблюдается заново мутаций больше базовой ставки. Секвенирование генов-кандидатов против целого генома? Так как большинство зарегистрированных мутации болезни миссенс / нонсенс-мутации и сайтов сплайсинга мутации (в соответствии с HGMD веб-сайт) наши скрининга стратегии будут определены более 68% известных мутаций. Существует также четкая связь между тяжестью аминокислот замена кислоты и вероятность клинического фенотипа. По сравнению с консервативной аминокислотная замена, ерунда изменение 9,0 раза чаще настоящее клинически 7. Таким образом, в это время секвенирования генов-кандидатов является наиболее экономически эффективной стратегии.

Успех изложил процедуры зависит от нескольких важных шагов, которые изложены подробно и иллюстрируются с помощью двух примеров, аутизм и шизофрения. Есть много подводных камней, которые нужно избегать, например, какие болезни, чтобы выбрать, какие пациенты на экран, источник ДНК, а также подробности о том, как эффективно идентифицировать заново мутаций. Мы предлагаем метод наиболее эффективно определения доли случаев какого-либо заболевания в результате чего от таких спонтанных мутаций.