Мозг фрагмент Стимуляция Использование микрожидкостных сети и стандартные палаты перфузии

Резюме

Мы показываем, изготовление простой микрожидкостных устройство, которое может быть интегрировано со стандартными установками электрофизиологии подвергать микромасштабной поверхности мозга срез в хорошо контролируемым образом, чтобы различные нейромедиаторы.

Аннотация

Мы показали, изготовление двухуровневой микрожидкостных устройство, которое может быть легко интегрирована с существующими установками электрофизиологии. Двухуровневая микрожидкостных устройства изготовлены с использованием двухступенчатой ​​стандартные отрицательные сопротивляться процесса литографии ^1. Первый уровень содержит микроканалов с впускные и выпускные отверстия на каждом конце. Второй уровень содержит микромасштабной круглые отверстия расположен на полпути от длины канала и по центру, а также ширины канала. Пассивный насосных метод используется для перекачки жидкостей из входного отверстия к выходному порту ^2. Микрожидкостных устройство интегрирован с вне готовых камер перфузии и позволяет полную интеграцию с установки электрофизиологии. Жидкости представлен на входе потока через порты микроканалов к розетке порты, а также выходить через круглые отверстия расположены на верхней части микроканалов в ванну перфузии. Таким образом, нижней поверхности мозга срез помещают в ванну камеры перфузии и выше микрожидкостных устройство может подвергаться воздействию различных нейромедиаторов. Микромасштабной толщина микрожидкостных устройств и прозрачным характером материалов [покровное стекло и PDMS (полидиметилсилоксан)] используется, чтобы сделать микрожидкостных устройств позволяют микроскопии мозга срез. Микрожидкостных устройство позволяет модуляции (как пространственные, так и временных) на химические раздражители представлен микросреды мозга срез.

протокол

SU-8 плесень изготовления

Мастер подготовки

1. SU-8 мастер на подложке пластины кремния подготовлен с использованием двухступенчатой ​​стандартные отрицательные сопротивляться процесса литографии.
2. Знаков совмещения на пластине кремния удаляют с помощью лезвия бритвы, как высота этих структур (расположены вдоль внешней периферии пластины) больше, чем фактическая приборных структур.
3. Кремниевой пластины, затем очистить с помощью изопропилового спирта и сушат в потоке N _2. Поддержка столбы, изготовленные из ленты толщиной менее высоким структуру устройства заменить знаков совмещения с четырех сторон пластины.
   
   Примечание: Если высота столпа поддержки более высоких зданий устройство, через отверстия не образуются в форме PDMS.
   
   
4. Пластины кремния мастера помещается на горячей плите при комнатной температуре.

PDMS приготовления раствора

1. Четыре грамма полидиметилсилоксан (PDMS) раствор готовят тщательного перемешивания 10 частей силиконового эластомера с 1 частью отвердителя.
   
   Примечание: Убедитесь, что два решения смешанных равномерно, чтобы получить аналогичные физические свойства на протяжении плесень PDMS.
   
   
2. Пузырьками генерируется в решение PDMS в процессе смешивания происходит с помощью вакуум-эксикаторе.

PDMS покрытия и отверждения

1. Без пузырей решение PDMS медленно обойтись на СУ-8 мастер убедившись, что пузыри не генерируются во время процесса дозирования.
2. Один конец записи на прозрачной пленке помещают на горячую тарелку и медленно сделан на решение PDMS, чтобы равномерно распределить PDMS на СУ-8 хозяина. Любые пузыри во время этого процесса должны быть удалены с помощью зонда.
   
   [Примечание: Не поднимайте прозрачности для предотвращения образования пузырей больше.]
   
   
3. BOROFLOAT плита находится в верхней части листа прозрачности применять равномерное давление. Нежный давлении на верхней поверхности из самых высоких круговых структур (расположен на полпути от длины канала и по центру по ширине каналов) такое, что существует минимальный или нет PDMS зажатой между прозрачностью и SU-8 поверхности кругового структур.
4. Еще три плиты BOROFLOAT помещаются поверх кремниевой пластины-BOROFLOAT плиты сэндвич применять постоянное давление на верхней поверхности кольцевых структур открытия до и во время процесса вулканизации.
5. Температура горячей пластиной, затем увеличилась до 75 ° С и PDMS лечится при этой температуре в течение 1 часа. Плитке доводят до температуры 50 ° C.
6. Плиты удаляют и прозрачность аккуратно удалена оставляя за хозяином и тонкий лист PDMS покрытие поверх нее.

Строительство микрожидкостных устройств

Удаление листов PDMS от мастера

1. Внешняя граница перфузии камере вырезал на листе PDMS использованием лезвия бритвы после согласования портов перфузии камера с портами на СУ-8 хозяина.
2. Лист PDMS затем аккуратно удалить из мастера, потянув вдоль каналов, чтобы предотвратить разрыв PDMS. Лист PDMS делается на прозрачности лист с микрожидкостных наземной сети вверх.
3. Впускные и выпускные отверстия, затем с использованием пробки буром.

Склеивание листов PDMS на стекло покровное

1. Связь поверхности листа PDMS (поверхность, содержащую микрожидкостных сети) и стекло покровное, затем аккуратно очистить с помощью ленты 3М скотч, размещенных на лист прозрачной пленки, и, наконец, размещены в O ₂ плазменной камеры.
2. Склеиваемые поверхности обрабатываются с 165 Вт плазмы в течение 10 с Плазмы обрабатываемой поверхности стекла покровного сразу связан с плазменной обрабатываемой поверхности листа PDMS.
   
   Применение: мягкое давление на стеклянную поверхность, чтобы удалить пузырьки воздуха в ловушке между склеиваемые поверхности.
   
   
3. Разрешить 5 минут, чтобы получить хорошие связи между PDMS и стекла. Через 5 минут аккуратно удалить прозрачности, на котором лист PDMS был помещен для склеивания процесса.
4. Микрожидкостных устройство помещается в системе кислородной плазмы, чтобы каналы гидрофильными. Плазменной обработки происходит при 165 Вт в течение 1 минуты.

Интеграция микрожидкостных устройств и перфузии камеры

Подготовка перфузии камеры

1. Вне готовых перфузии камере было приказано, и впускные и выпускные отверстия были пробурены так что, когда микрожидкостных устройства и камеры связаны, портов камеры и устройства приведены в соответствие. Нижняя поверхность перфузии камеры покрыта PDMS получить герметичное уплотнение между камерой и микрожидкостных устройств.
2. Записи о прозрачности лист помещается на горячей плите при комнатной температуре.
3. Один грамм PDMS раствор готовят в процесс, аналогичный описанному ранее. Без пузырей решение PDMS затем медленно обойтись на прозрачность листов избегая поколения пузырьков.
4. Перфузии камеру помещают на решение PDMS.
5. BOROFLOAT плиты затем помещается в верхней части камеры применять равномерное давление и получить тонкое покрытие PDMS на нижней поверхности камеры.
6. Температура горячей пластиной, затем увеличилась до 75 ° С и PDMS лечится при этой температуре в течение 1 часа.

Склеивание микрожидкостных устройств и перфузии камеры

1. Плита удаляется, а прозрачность осторожно удалить оставив позади камеры перфузии и тонкий лист PDMS покрытием на нижней поверхности. Нежелательные PDMS удаляется с помощью лезвия бритвы и резкое зонда для удаления из PDMS доступа к портам.
2. Поверхность PDMS из микрожидкостных устройства и поверхности PDMS нижней части камеры затем аккуратно очистить с помощью ленты 3М, размещенных на лист прозрачной пленки, и, наконец, помещен в камеру плазме кислорода.
3. Поверхности обрабатывают 165 Вт плазмы в течение 10 с PDMS покрытием поверхности камеры непосредственно связаны с поверхностью из PDMS микрожидкостных устройств.
   
   Применение: мягкое давление на стеклянную поверхность, чтобы удалить пузырьки воздуха в ловушке между склеиваемые поверхности.
   
   
4. Непосредственно перед использованием, устройство помещается в системе кислородной плазмы, чтобы каналы гидрофильными. Плазменной обработки происходит при 165 Вт в течение 1 минуты.

Разоблачение мозга ломтики в нейрохимические микроокружения использованием микрожидкостных устройств

1. Гидрофильные микроканалах (микрожидкостных устройств) - (перфузии камеры) сочетание заполнены стандартными ACSF (искусственный спинномозговой жидкости) решение.
2. Внесите небольшие капли раствора ACSF на входе в порт и позволяют решение, которое будет злой вверх в каналах. Удалите пузырьки влево с помощью шприца с выходной порт. Внесите большой каплю раствора ACSF на выходе из порта в пассивном перекачки жидкости от входа до выхода порты микрожидкостных устройств.
   
   Примечание: Следует проявлять осторожность, чтобы удалить все пузырьки из каналов, чтобы поток жидкости с использованием пассивных метода накачки.
   
   
3. Fix (микрожидкостных устройств) - (перфузии камеры) комбо в простой платформы и исправить простой платформы в микроскоп адаптера.
4. Подключите стандартный вход и выход (всасывания) трубку к перфузионной камере для непрерывной перфузии мозга срез раствором стандартного ACSF. Решение ACSF постоянно атмосферный с 95% О2-5% СО _2.
   
   Примечание: Отрегулируйте положение всасывающий трубопровод для поддержания постоянного уровня ACSF в ванну перфузии камеры.
   
   
5. После перфузии камера заполняется раствором ACSF, место среза мозга в перфузионной камере помощью капельницы. Использование зонда, должность мозга срез выше круглых отверстий в микрожидкостных устройств. Как только срез мозга в нужном месте в течение круглых отверстий, используйте кусочек якорь для иммобилизации мозга срез.
6. Микрожидкостных устройств теперь может быть использован, чтобы разоблачить мозга срезов (помещен в камеру перфузии и на вершине микрожидкостных сеть) для различных нейромедиаторов с использованием пассивных перекачки жидкостей.

Обсуждение

Существующие макромасштабе или микромасштабной мозга камер ломтик перфузии ограничены с точки зрения пространственного разрешения, которые они предоставляют подвергать мозг ломтики нейромедиаторов. Микрожидкостных технологии устройства продемонстрировали здесь преодолевает это ограничени...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RC-26GPL	Tool	Warner Instruments	W2-64-0236	Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber
SHD-26GH/10	Tool	Warner Instruments	W2-64-0253	Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing
PDMS (polydimethylsiloxane)	Reagent	Dow Corning	Sylgard 184	Silicone Elastomer Kit
Plasma Preen-II 862	Tool	Plasmatic Systems, Inc.		Microwave plasma system
Model P-1	Tool	Warner Instruments	W2-64-0277	Series 20 Plain Platform, Model P-1
SA-NIK	Tool	Warner Instruments	W2-64-0291	Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK
Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid)	Reagent			Exact composition will vary with application