Изображений нейронов Ответы на фрагмент Препараты вомероназального орган выражения генетически закодированные Кальций датчика

Резюме

Вомероназального орган (ВНО) обнаруживает внутривидовой химические сигналы, которые передают социального и репродуктивного информации. Мы провели Ca2 + изображений экспериментов с использованием трансгенных мышей, экспрессирующих G-CaMP2 в ткани ВНО. Такой подход позволяет нам анализировать сложные узоры реакция вомероназального нейроны большим количеством феромона раздражители.

Аннотация

Орган вомероназального (ВНО) обнаруживает хемосенсорных сигналы, которые несут информацию о социальной, сексуальной и репродуктивного статуса лиц в пределах одного вида ^1,2. Эти внутривидовых сигналов, феромоны, а также сигналы от некоторых хищников ^3, активировать вомероназального сенсорных нейронов (VSNs) с высоким уровнем специфичности и чувствительности ^4. По меньшей мере три различных семейства G-белком рецепторы, V1R, V2R и FPR ^5-14, выражаются в нейронах ВНО посредничать обнаружения хемосенсорных сигналы. Чтобы понять, как феромон информация кодируется ВНО, очень важно проанализировать ответ профилей отдельных VSNs на различные раздражители и идентифицировать специфические рецепторы, которые опосредуют эти ответы.

Neuroepithelia о ВНО в нем заключаются в пару костей уотег. Полу-слепой трубчатые структуры ВНО имеет один открытый конец (вомероназального протока) подключение кполости носа. VSNs расширить свои дендриты в просвете части ВНО, где феромона сигналы находятся в контакте с рецепторами, высказанные на дендритных ручки. Клеточных тел VSNs форме псевдо-стратифицированных слоев с V1R и V2R выражается в апикальных и базальных слоев соответственно ^6-8. Несколько методов были использованы для контроля ответов VSNs на сенсорные стимулы ^4,12,15-19. Среди этих методов, острый срез подготовка имеет ряд преимуществ. Во-первых, по сравнению с диссоциированных VSNs ^3,17, ломтик подготовку поддерживать нейроны в их родном морфологии и дендриты клетки остаются относительно нетронутыми. Во-вторых, клеточных тел VSNs были легко доступны в корональной кусочек ВНО, чтобы электрофизиологии исследований и экспериментов изображения по сравнению с целого эпителия и весь монтаж подготовки ^12,20. В-третьих, этот метод может быть объединена с молекулярных методов клонирования, чтобы рецептор идентификации.

Сенсорная стимуляция вызывает сильную Са ^{2 +} приток в VSNs, что свидетельствует об активации рецептора ^4,21. Таким образом, разработка трансгенных мышей, которые выражают G-CaMP2 в обонятельной сенсорных нейронов, в том числе VSNs ^15,22. Чувствительность и генетической природы зонда значительно облегчит Са ^{2 +} изображений экспериментов. Этот метод устранил красителя процесса загрузки, используемых в предыдущих исследованиях ^4,21. Мы также используют системы лиганд доставки, которая дает возможность применения различных стимулов к ВНО ломтиками. Сочетание двух методов позволяет следить за несколькими одновременно нейронов в ответ на большое количество раздражителей. Наконец, мы установили полуавтоматические анализа трубопровода, чтобы помочь обработки изображений.

протокол

1. Решение подготовки

1. Подготовка 10X R1, R2 и 10X 10X R3 решения в соответствии с таблицей.
   R1
   

   Химические вещества	МВт (г / моль)	мМ (1X)	10X акций (г / л)
   NaCl	58,44	125	73,05
   KCl	74,55	2,5	1,86
   MgCl 2	1 М акции	1	10 мл
   CaCl 2 · 2H 2 O	147,02	2	2,94
   NaH 2 PO 4 · H 2 O	137,99	1,25	1,72

   
   R2
   

   Химический	МВт (г / моль)	мМ (1X)	10X акций (г / л)
   NaHCO 3	84,01	25	21

   
   R3
   

   Химические вещества	МВт (г / моль)	мМ (1X)	10X акций (г / л)
   NaCl	58,44	125	73,05
   KCl	74,55	2,5	1,86
   MgCl 2	1 М акции	2	20 мл
   CaCl 2 · 2H 2 O	147,02	2	2,94
   HEPES	1 М акции	5	50 мл

2. Сделать 1 литр мыши искусственной спинномозговой жидкости (mACSF) на день эксперимента путем смешивания 100 мл 10X R1 и 100 мл 10X R2 в бидистиллированной воды (DDW) и объявленияг 1,8 г декстрозы (конечная 10 мм). Этот препарат предотвращает методом осаждения карбоната кальция при высоких рН. Осмолярность mACSF составляет около 310-315 мОсм / л Отрегулируйте осмолярности декстрозы или с водой, если это необходимо. Проветрить решение с Carboxygen газа (95% кислорода и 5% углекислого газа), по крайней мере 30 минут перед регулировкой рН раствора до 7,2-7,4.
3. Сделать 1 л раствора Рингера в день эксперимента путем смешивания 100 мл 10X R2 и 100 мл 10X R3 в DDW и добавить 1,8 г декстрозы (10 мм). Осмолярность и рН раствора Рингера должны быть аналогичны mACSF. Проветрить решение с газом Carboxygen.
4. Подготовка 4% низкой температурой плавления агарозы (LMA) в любом mACSF или раствора Рингера. Алиготе расплавленной агарозы в Эппендорф труб и хранить при температуре 4 ° С до использования. LMA, которая состоит из очищенного полисахарида, остается жидкостью при температуре 37 ° С и затвердевает быстро при температуре ниже 25 ° C. Эти свойства делают его идеальным для встраивания В.Н.O и жить физиологии ткани. Другие материалы нечистым, такие как агар, не должно быть выбором для живой ткани, как эксперимент неохарактеризованных компоненты могут вмешиваться в нейронной ответ.
5. Подготовка феромона стимулы в растворе Рингера. Для мыши мочи, 1:100 разбавления приводит к надежной ответы.

2. Подготовка ломтик ВНО

1. Прежде чем пожертвовать животным, положил два тюбика LMA на тепло блока и установить температуру до> 60 ° C, чтобы расплавить агарозы. Как только гель разжижается, передачу трубы для 37 ° C тепла блока.
2. Обезглавьте G-CaMP2 мыши следующие CO ₂ эвтаназии. Вырезать кости нижней челюсти с помощью ножниц для удаления нижней челюсти. Снимите верхнюю ребристых ткани неба, чтобы разоблачить носовой полости (рис. 1А). Отдельные челюсти, вставив хирургические лезвия между двумя передними резцами. Осторожно снимите челюсти подвергать ВНО. На данный момент, все ВНО может вознесен буду от пАСАЛ полости, держа на копчик (рис. 1б). Передача ВНО к холоду кислородом решение mACSF немедленно.
3. Под вскрытие масштабов, разделения двух ВНО с помощью кончика # 5 пинцетом аккуратно сдвиньте вдоль стены перегородки кости (рис. 1в). Очистите от костей, сошника encases ткани ВНО. Аккуратно поднимите весь ткани ВНО из костной полости. Экстремальные следует позаботиться на этом этапе, чтобы не повредить нейроэпителия. Малые фрагменты костей остается на поверхности ткани должны быть удалены полностью перед вложением. Фрагменты слева на ткани может быть пойман лезвия тянуть ткань из блока агарозы.
4. Используйте пинцет, чтобы удерживать заднем конце ткани ВНО и мягко погрузите его в расплавленный агарозы (рис. 1D). Быстро охладить пробирку на льду укрепить агарозы. Вложения и охлаждения процесс должен занимать не более 2 минут.
5. VF300 ткани слайсер (Precisionary Instruments, Гринвилл, Северная Каролина) используется для создания разделов. Вырезать блок агарозном содержащие ВНО по форме и приклеить ее к ткани держателя (рис. 1E и F). Вставьте держатель ткани в металлический цилиндр и заполнить оставшиеся камеры с дополнительными LMA. После LMA застывает на льду, переходите к секционирования немедленно. Поставка холодной кислородом mACSF в секционирования камеру и начать сокращать на 180-200 мкм толщины на срез. Отрегулируйте продвижения скорость и частоту колебаний так, чтобы ткань не сжимается во время секционирования и ВНО не отваливается от агарозы. Сбор и передача секционного ломтиками, чтобы mACSF инкубации камеры (рис. 2A). Ломтики жизнеспособность в течение 6-8 часов в mACSF кислородом при комнатной температуре. Рис. 2Б и С показывают, DIC и 2-фотонного изображения G-CaMP2 ломтик ВНО, соответственно.

3. Изображениями камера создана

1. Место среза ВНО в середине перфузиикамеры (Siskiyou, Грантс-Пасс, Орегон) и удерживать часть вниз с кусочком якорь (Warner Instruments, Hamden, CT) (рис. 3А). Нити якорь достаточно нажать на части LMA среза, а не ткани ВНО. Кислород mACSF доставляется перфузии камеру через входное отверстие при ~ 100 мкл / сек, и жидкость сливают через всасывающие иглу через выходное отверстие, чтобы обеспечить непрерывный поток свежего mACSF (рис. 3А, Б).
2. Заполните шприц 30 мл с раствором Рингера и зажмите его в шприц насосом (Нью Системс насоса эры, Farmingdale, Нью-Йорк). Установить скорость насоса на 300-600 мкл / мин обеспечить непрерывный поток раствора Рингера над сектором (рис. 3С).
3. Подключите выход Рингера для инъекций ВЭЖХ петли (Chromtech, Apple Valley, MN) (рис. 3D). Различные размер петли могут быть выбраны для точного контроля объема доставляется. Мы используем 20 мкл цикл в оУра экспериментов. Контроль инъекции цикл имеет два потока маршрутов (рис. 3Е). В "нагрузку" положение, образцы могут быть загружены в пример цикла с помощью шприца точностью Гамильтон. Избыточный выход образец образец цикле отходов розетки. Раствор Рингера вводят путем шприцевой насос обходит образец петлю и идет непосредственно в розетку, которая связана с перфузии наконечник (рис. 3А и Е). В "инъекции" положении, насос решение проходит через образец петли и нажмите стимулы в розетку (рис. 3Е). До визуализации эксперимента, пузырьки воздуха должны быть изгнаны, чтобы обеспечить плавное течение перфузионной жидкости. Другие коммерческие или на заказ системы впрыска топлива также может быть реализован для стимулом доставки.
4. Отрегулируйте перфузии наконечник под 5х или 10х объектив так, чтобы кончик составляет около 1 мм от среза ВНО.
5. При новой системе перфузии установки, рекомендуется для измерения времени задержки и образец мажорation с флуоресцентным красителем. Нагрузка 0,1% красителя родамина 6G в образец петли и переключатель клапан для введения позиции на 5 секунд после начала захвата изображения (рис. 3F). Флуоресцентный сигнал обнаружен в пределах 10-30 секунд. Гладкая кривая флуоресцентного сигнала также указывает, что существует мало турбулентности, генерируемой при погружение линзы и что адекватной перфузии кислородом mACSF достигает среза.

4. Временной интервал изображения

1. Мы используем Zeiss AxioSkope FS2 микроскоп с 10X или 20X воды нагишом линзы на время визуализации недействительной. Стандартный GFP полосовой фильтр (450-490nm) используется для G-CaMP2 сигналов. Epifluorescent изображения приобретена ПЗС-камера (Zeiss HRM) с 1x1 или 2x2 биннинга в зависимости от уровня экспрессии G-CaMP2.
2. Установить приобретения скорости 1 кадр в секунду. Отрегулируйте интенсивность света, чтобы свести к минимуму отбеливания G-CaMP2 сигналов и фото повреждения клеток. Для каждого бывшегоЭксперимент, мы обычно приобретают 60-кадр стека (~ 60-70 секунд). Переключатель клапана инъекции позиции в конкретный момент времени (например, 5 секунд на рис 3F) за один комплект эксперимент, чтобы получить последовательное время задержки во всех испытаниях.
3. Выполните тест выполняется с использованием раствора Рингера, как стимул. Подрегулировать перфузии установка, если движение артефакт вводится в образец инъекций.
4. Выполните позитивный контроль запуска с помощью мыши моче растворенный в 1:100 в растворе Рингера. Типичные максимальной f / F значение G-CaMP2 ответ на мышь моче составляет около 20-40%. При необходимости, можно подтвердить жизнеспособность срез, обеспечивая 10 мМ KCl в Рингера, чтобы стимулировать ломтики в конце эксперимента.
5. Промыть шприц Гамильтон в растворе Рингера не менее трех раз после загрузки одного раздражителя. Промыть образец петля с раствором Рингера крайней мере три раза между различными стимулами. Эти меры предотвращения перекрестного загрязнения между differeнт образцов.
6. Подождите 4-10 мин для VSNs для восстановления перед нанесением следующего стимула.

5. Анализ данных

1. Выполнить изображение регистрацию всех изображений, полученных от одного среза. Мы используем специально написанный сценарий VBA в AxioVision (Carl Zeiss, Северная Америка), чтобы автоматизировать этот процесс. Все кадры изображения в пределах одного эксперимента являются зарегистрированными против общего выбранной системы отсчета с упругими регистрации (рис. 4А). Упругие регистрации, также известный как нелинейные регистрации, категория регистрации изображений технику подчеркнув, преобразование изображения цели, не жестко эталонного образа. Здесь мы использовали реализацию из AxioVision.
   
   Это отсчета выбирается произвольно из образа стеков.
2. Выполните вычитания изображений для идентификации ответа клеток. Мы используем пользовательские макросы в письменной ImageJ v1.42 ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ , NIH, Bethesda, MD), чтобы автоматизировать этот процесс. Минимальный проецирования изображения создается для каждого стека. Отвечая клетки появляются после минимальный проектор вычитается из сырых стеков (рис. 4В).
3. Определить области интереса (ROI) от вычитается стеки и получить возврат инвестиций координат с использованием Multi-Мера плагин от ImageJ. Обработать все стеки для одного эксперимента и сохранить все ROI координаты в список ROI мастера (рис. 4С).
4. Используйте список ROI мастер для измерения клеточного ответа из сырого стеков изображения со специально написанный макрос и Multi-Мера плагин от ImageJ (рис. 4D). Участок ответ кривые и Тепловая карта в Matlab (Mathworks Inc, Натик, Массачусетс).

6. Представитель Результаты

Пример эксперимента ВНО визуализации с использованием мочи образцов, взятых из четырех отдельных мышей показано на рисунке 5. Ломтик реагирует на стимуляцию мочи с различными рatterns активации. Около 80 клетки выявляются показывает ответ на хотя бы одного из мочи раздражителей и их реакция f / F значения приведены на Тепловая карта (рис. 5А). Ответ следы клетки 1, 2 и 3 приведены на рис 5B показывает время активации курса мочи раздражители. Ячейка 1 отображает ответ на как женщины, так образцы мочи, но не мужчин образцов, в то время как ячейка 2 показывает обратное модели активации и реагирует на мужчин только образцы. Ячейка 3 активируется как индивидуальные, так мужские и женские образцы. Клетки 1 и 2 показаны характерные ответ на секс конкретные сигналы в моче ^15.

Рисунок 1 Схематическое изображение процесса вскрытия ВНО. А. анатомического расположения в ВНО мыши голову. Глава G-CaMP2 мышь была расчленена и укладывают вниз головой с мягкой тВопрос удален из неба, чтобы разоблачить ВНО. Вход показывает флуоресцентное изображение одного и того же изображения. Neuroepithelia о ВНО имеют ярко-зеленый. Б. вид сбоку изолированных ВНО, который заключен в сошника кости (сверху) и флуоресцентное изображение одного и того же ВНО (внизу). C. корональных зрения ВНО и диссекции процесса. Один ВНО отделен от перегородки и сошника кости могут быть удалены, чтобы выбраться нейроэпителия. Д. ВНО будет встроена в LMA. Е. встроенный блок приклеивается к ткани держатель для секционирования. Ткани держатель передовые при температуре 180-200 мкм на ломтик нажатием блок агарозы из металлическую бочку для секционирования. Лезвие располагается близко к металлической бочке. Ф. Вид сбоку VF300 система резки ткани. BV, кровеносных сосудов. СВ, нейроэпителия.

Рисунок 2 ВНО ломтиками. А. ВНО ломтиками ведутся в mACSF кислородом при комнатной температуре. Б. DIC картину среза ВНО. C. 2-фотонного образ ВНО из G-CaMP2 мыши. Шкала бар, 50 мкм.

Рисунок 3 Иллюстрация перфузии настройки системы. А. типичные камеры перфузии с входным и выходным. ВНО часть расположена в центре камеры и нажал вниз с ткани якорь. Средний темы удаляются из тканей якорь так, чтобы ткань ВНО не нажата. Б. перфузии камеру помещают на столик микроскопа под погружения цели. Вход mACSF, выход всасывания и перфузии наконечник указаны. C. один насос шприца обеспечивает непрерывный поток Рингера через перфузии чаевые. Д. ВЭЖХ ИнджеСистема ction цикл принята для удобной загрузки образца стимула и инъекции. Е. Схематическое изображение направлениях потока при загрузке и инъекции позиции. Рингера, зеленый. Стимул образца, пурпурный. Стрелки указывают направление потока. Ф. Задержка и смыть время измерения перфузии системы. Родамина 6G флуоресцентного красителя загружается в образце петли и клапан переключается на инъекции позиции на пятую секунду, что обозначается стрелкой. Флуоресцентные изменения обнаружении сигнала в пределах 10-30 секунд и уменьшается после этого.

Рисунок 4 Обработка изображений трубопровода. A. Все кадры изображения для одного среза являются зарегистрированными против отсчета. Б. Вычитание минимальный проектор из стека из сырья кадры. Отвечая клетки становятся видными после вычитания. C. RОИ выбираются и их координаты, компилируются в основной список. Д. Измерение ответа клетки, используя ROI основной список из необработанного стека.

Рисунок 5 представителей G-CaMP2 ВНО изображений эксперимента. A. f / F ответ Тепловая карта с ломтиком стимулировали отдельные мужские и женские мочи. Образцы мочи собирают из отдельных мужских и женских мышей. По оси Х, отвечая клетки идентифицированы срез. Y-ось, мочи, используемых в эксперименте. Цвет полоса указывает на f / F значение. B. Время отклика течение 3-х представителей в ячейки, помеченные стрелками А. указать время стимулом применения. F-FVB, женский FVB, F-CBA, женский ЦБ; М-FVB, мужчина FVB; М-BL6, мужчина C57BL / 6.

Таблица специфических реагентов и оборудования:

Названиереагент	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно)
перфузии камеры	Siskiyou	PC-H	горизонтальный
часть прижимной	Warner инструменты	SHD-22CL
Держатель перфузии порт	ALA научных, Inc	MPIOH-S
шприцевой насос	Новые системы насоса эры, Inc	NE-300
низкий клапан давления впрыска	Chromtech	V-451
PEEK трубки	Chromtech	1531	1 / 16 "OD, 0.25мм ID
PEEK образец петля	Chromtech	1803	20 мкл
Гамильтон шприц	Chromtech	80630	100 мкл

Обсуждение

Большинство вомероназального рецепторов (VRS) остаются сиротами рецепторов с момента их открытия Дюлаком и Аксель ^5. Феромона лигандами для этих хемосенсорных рецепторы и их роль в посредничестве животного поведения, не до конца понятны. До сих пор только одна пара лиганд / рецепто...