Определение фагоцитарной активности Клинические образцы антител

Резюме

Мы представляем высокой пропускной проточной цитометрии анализа для определения фагоцитарной активности антиген-специфические антитела из клинических образцов, используя флуоресцентные антиген покрытые бисером и моноцитов клеточной линии, выразив несколько Fc рецепторов, обеспечение использования рецепторов и фагоцитарную определения активности в стандартизированной и воспроизводимые мода на любой антиген интереса.

Аннотация

Антитела управляемой фагоцитоз индуцирована с помощью участия Fc рецепторы на профессиональном фагоцитов, и может способствовать как клиренс, а также патологии заболевания. Хотя свойства вариабельных доменов антител уже давно считается критическим в естественных условиях функцию, способность антител к набору врожденных иммунных клеток через их области Fc становится все более ценится как главный фактор в их эффективность, как в настройке рекомбинантных моноклональных антител терапии, а также в ходе естественного заражения или вакцинации ^1-3.

Важно отметить, что несмотря на свою номенклатуру, как константного домена, домен антител Fc не имеет постоянной функции, и сильно модулируется IgG подкласса (IgG1-4) и гликозилирования на Аспарагин 297 ^4-6. Таким образом, этот метод для исследования функциональных различий антиген-специфических антител в клинических образцов будет способствовать соотношение фагоцитарной горшокдифференциальных антител к болезни государства, восприимчивость к инфекции, прогрессирование или клинического исхода.

Кроме того, это эффекторные функция особенно важно в свете документально подтвержденной способности антител к повышению инфекции, предоставляя доступ в патогенные клетки хозяина через Fc рецепторов управляемой фагоцитоз ^7. Кроме того, существуют некоторые доказательства, что фагоцитарная поглощение иммунных комплексов может повлиять Th1/Th2 поляризации иммунного ответа ^8.

Здесь мы описываем анализа предназначен для обнаружения различий в антитело-индуцированного фагоцитоза, которые могут быть вызваны дифференциальной IgG подкласса гликана структуры на Asn297, а также способность к образованию иммунных комплексов антиген-специфических антител в высокой пропускной способности моды . С этой целью 1 мкм люминесцентные бусины покрыты антигеном, затем инкубировали с антителами клинических образцов, создавая флуоресцентные антиген специфических иммунных комплексов. Эти antiboду-опсонизированным бисер затем инкубировали с моноцитов клеточной линии выразить несколькими FcγRs, в том числе и тормозных и активации. Анализ выход может включать фагоцитарную активность, секрецию цитокинов, и модели использования FcγRs, и полны решимости в стандартизованной форме, что делает это очень полезная система для анализа различий в это антитело-зависимой эффекторной функции в обеих инфекций и вакцины-опосредованной защиты ^9.

протокол

1. Культура фагоциты

1. Культура THP-1 клетках ¹⁰ в RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, как стационарные подвески в колбах T. Плотность клеток должна быть сохранена ниже 0.5x10 ⁶ / мл, чтобы сохранить постоянный уровень выражения FcγR и анализа производительности.

2. Подготовка Биотинилированные антигена

1. Рассчитайте количество сульфо-NHS ​​LC биотин реагентов необходимо biotinylate антигена-мишени интересов в соответствии с инструкциями производителя.
2. Растворите биотинилирование реагента в воду и сразу же добавить к расчетному количеству антигена в буфер, который не содержит первичные амины. Разрешить протекания реакции в течение 1 часа при комнатной температуре, время от времени смешивания.
3. Удалите излишки, неконъюгированного биотин от буфера обмена в Amicon центробежные единицу концентрацию соответствующего молекулярного веса обрезания сохранить маленький круглый щитт антигена. Добавить образца до верхней палаты концентрацией единицы и добавить PBS довести общий объем до 15 мл линии заполнения. Центрифуга при 4000 мкг довести объем до примерно 1,5 мл. Повторяя этот процесс дважды удалит 99% свободного биотина для обеспечения максимального покрытия антигена бисером.

3. Подготовка антигена Насыщенные бисер

1. Вымойте 100 мкл 1 мм люминесцентные бусины neutravidin два раза в 1 мл 0,1% PBS-BSA после спиннинг вниз в микроцентрифужных на высокой скорости. Ресуспендируют мыть бусин в 100 мкл PBS-BSA, и аликвоту в 10 трубок.
2. Для определения антигена покрытия условий, которые насыщают бусы, объединить 10 мкл мыть бусинка подвеска с различной концентрацией антигена биотинилированного в два раза шагов. Выдержите в течение ночи при 4 ° С в микроцентрифужных трубки на ротатор.

ПРИМЕЧАНИЕ: Насыщенность из бисера должны быть определены экспериментально. Это может быть достигнутопутем выявления бусинка покрытия условий, которые дают максимальный фагоцитоз, когда бисер впоследствии опсонизированным с контролем моноклональных антител.

3. Удаление несвязанных антигенов при помощи промывки 1 мл PBS-BSA и центрифуге при высокой скорости до бисер гранулированный. Удалить PBS-BSA и повторите упражнение.
4. Ресуспендируют антиген-покрытием бусин в конечном объеме 1 мл в PBS-BSA. Бисер может храниться до недели при температуре 4 ° C до использования.

4. Подготовка антител Образцы

1. Клинические образцы антител может быть очищен от плазмы с помощью дыни гель IgG очистки комплект в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные IgG могут храниться при температуре 4 ° С до готовности к использованию.

Примечание: соответствующие меры предосторожности по обращению человека образцы должны всегда было принято.

2. Определение концентрации очищенных антител абсорбции при A280, и разбавленных образцах до 1 мг / мл в PBS.
3. Подготовка постулироватьив и отрицательные моноклональных антител контроль путем разбавления до 1 мг / мл в PBS.

5. Покрытие эксперимент

1. Ресуспендируют промывают, антиген насыщенный раствор, приготовленный шарик сверху вортексе и передачи 10 мкл в каждую лунку с круглым дном 96-луночный планшет. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы постоянно агитировать бусинка подвески для обеспечения равного количества флуоресцентного бисера добавляли в каждую лунку.
2. Добавить различные концентрации антител, представляющих интерес для каждой скважины, создавая кривой доза-реакция для каждого антитела. Оптимальная концентрация будет отличаться от образцов в зависимости от титра антител, но диапазоне от 0,01-100 мкг / мл, конечная концентрация обеспечит хорошее покрытие и позволяет идентифицировать диапазоне концентраций интерес. Обеспечить антитела добавляются в объемах не более 20 мкл.
3. Инкубируйте бисером и антител образцы в течение 2 часов при температуре 37 ° C, чтобы антитела к opsonize бисером.
4. Подготовка приостановлении THP-1 клетках на уровне 2,5 х 10 ⁵ клеток / мл, и добавьте 200 мкл этой суспензии в каждую лунку, в общей сложности 5 х 10 ⁴ ТНР-1 клеток в каждой лунке.
5. Выдержите в течение ночи при 37 o C, 5% СО _2, в стационарных инкубатор, позволяющий клеткам и бусы для осаждения с помощью гравитации.

ПРИМЕЧАНИЕ: сигнал-шум может быть улучшено путем определения оптимального бусинка: антитела: THP-1 клетка отношения для данного источника антигена и антитела.

6. Проточной цитометрии

1. Удалить 100 мкл супернатанта из каждой лунки стараясь не нарушать клеточный осадок. Супернатант может быть сохранен, если секрецию цитокинов определений или другие анализы лучшего.
2. Для фиксации, добавьте 100 мкл 4% параформальдегида в каждую лунку и пипетки для ресуспендирования и смешать клетки.
3. Высокая пропускная способность проточной цитометрии можно выполнить с помощью BD LSR II оснащен читателя пластины HTS.
4. Программа программное обеспечение, чтобы смешивать каждую лунку три раза (100 мкл смеси) и анализ 30 мкл, или по крайней мере 2000 событий клетки, каждого образца.
5. Данные, собранные могут быть проанализированы в FlowJo или эквивалент программного обеспечения. Полезные метрики включают процентов из бисера +, или флуоресцентные клетки, которая обеспечивает показатель количества фагоцитирующих клеток, присутствующих, а также интенсивности флуоресценции фагоциты, который позволяет определить число фагоцитированы бисером. Умножив эти значения создает интегрированные люминесцентные означает интенсивность, или iMFI.
6. Среднее количество бусин фагоцитированы каждым фагоцитарной клетки может быть вычислена путем деления iMFI на среднее флуоресценции 1 шарик.

7. Представитель Результаты

Там должно быть четкое разграничение антител образцов из пораженных и здоровых субъектов. Рисунок 1А представляет FACS гистограммы антител выборки из ВИЧ-отрицательныйTIVE (черная линия) и ВИЧ-инфицированных (серый след) предмета, и демонстрирует, увеличилось фагоцитоз обусловлен наличием антиген-специфических антител.

Оптимальная чувствительность теста зависит от насыщенности бусины с биотинилированного антигена. На рисунке 1б представлена ​​фагоцитоза наблюдалась при бисером покрытием с различными количество антигена были опсонизированным с 3 контроль моноклональных антител (в том числе необязательных антител, треугольники), и устанавливает 2μg антиген / мкл бисером, как насыщающей концентрации этого антигена.

Кривой доза-реакция представлена ​​на рисунке 2, а также демонстрирует способность дифференциальных субъекта образцы антител вызывать фагоцитоз за диапазон антител концентрации 0,05-5 мкг / мл. Этот дифференциал фагоцитоза может быть вызвано либо различия в титра или Fc домен свойств, таких как IgG подкласса и гликозилирование государства.

Когда THP-1 клетках яМагед методом флуоресцентной микроскопии, существует явное свидетельство из бисера фагоцитоза. На рисунке 3 представлены два 63x неподвижные изображения ТНР-1 клеток после инкубации с антителом опсонизированным (зеленый) и не опсонизированным (красный) бусы, демонстрируя отсутствие фагоцитарной поглощения при отсутствии антител. При микроскопии промежуток времени выполнен, антитело-специфический фагоцитарной поглощения флуоресцентного бисера еще более разительна (фильм 1, 20-кратным увеличением).

Предыдущая работа подтвердила интернализации бисером связанных с клетками, и эксперименты с первичной моноцитов согласились также с фагоцитарной баллов (iMFI значения) в этой высокой анализа пропускной способности (данные не представлены).

Рисунок 1. Пробирного управления качеством. 1А, Проточная цитометрия гистограммы фагоцитоза для антител выборки из ВИЧ-отрицательных субъекта (черный луч) и ВИЧ-инфицированных субъекта (серый след).1B: Экспериментальное определение оптимальных условий бусинка покрытие для образца антигена. Антиген-специфические моноклональные антитела (круг, квадрат) демонстрируют максимальное фагоцитоз из бисера покрытые> 2 мкг антигена / мкл из бисера, в то время как контроль антител (треугольник) демонстрирует не фагоцитарной активности.

Рисунок 2. Фагоцитоз кривой доза-реакция. Клинические образцы антител от ВИЧ-инфицированных (лечить, лечить, и экспонирования контроль репликации вируса в отсутствие антиретровирусной терапии) и ВИЧ-отрицательные диск субъектов фагоцитоз gp120 (ВИЧ конверте), покрытых бисером дифференцированно.

Рисунок 3. Эффективное интернализации. Микроскопия подтверждает интернализация антител опсонизированным шариков (зеленый), в то время как не-опсонизированным бисером оставаться в зольution (63x увеличение).

Фильм 1. Покадровый микроскопии антител управляемой фагоцитоз был выполнен в течение 14 часов и позволяет визуализировать фагоцитарной активности THP-1 клетках, используемых в высокой пропускной способности анализа. Зеленый флуоресцентный бисер антител опсонизированным, красного флуоресцентного бисера обеспечить отрицательного контроля. Нажмите сюда, чтобы посмотреть фильм.

Обсуждение

Анализа, описанного здесь, позволяет с высокой пропускной анализ фагоцитарной активности клинических образцов антител с использованием клеточной линии моноцитов давно используются для исследования фагоцитарной процессы ¹⁰ и тарелка основана автоматизированной проточной цитометрии. Этот анализ является преимуществом по сравнению с другими в своей способности точно характеризуют антиген-специфических антител подмножества, позволяющая не только для изучения различий в фагоцитоз обусловлен конкретных заболеваний антитела от различных предметов, но и изучение нескольких особенностей антигена в пределах одного субъекта. Поскольку антитела набора врожденных эффекторных клеток, включая моноциты и другие антиген представляющих клеток сильно воздействие исход заболевания ^11-13, и является биологически переменной геометрией в зависимости антител, IgG подкласса и гликозилирования на Asparagine297 из Fc домен ^14-16, этот метод обеспечивает оценка важнейший механизм действия антител. Кроме того, поскольку антитела-МЕДИated фагоцитоз эксплуатируется некоторыми патогенными в ходе инфекции ^7,17,18, этот анализ перспективным в оценке процесса антитело-зависимой аксессуар и подчеркивает двойственную природу фагоцитоза как потенциально защитные, а также потенциально вредное активности антител.

Анализа, описанного могут быть использованы для анализа антител из клинических образцов от пациентов населения, но и привитых, а также может быть адаптирована для использования сыворотки, а не очищенным IgG. Кроме того, секрецию цитокинов в ответ на фагоцитоз могут быть проанализированы с супернатанта культуры и влияния конкретных FcR может быть определена с помощью FCR-блокирующих антител, что позволяет не только различия в фагоцитарной потенции, которые будут определены, но ниже по течению сигнальных событий, с пониманием в механизм, и возможно, поможет вам и уточнить понимание этого иммунный механизм.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
EZ-Link Micro сульфо-NHS-LC-биотинилирование Kit	Термо Scientfic	21935
Amicon Ultra-15 центробежный фильтр блок с Ultracel-50 мембраны	Millipore	UFC905024	Размер фильтра устройства может варьироваться в зависимости от размера антигена
FluoSpheres NeutrAvidin меченых микросфер, 1,0 мкм, желто-зеленый флуоресцентный (505/515)	Invitrogen	F-8776	Производители производят этот продукт в различные цвета
Дыня Гель IgG Очистка Kit	Thermo	45212	Следует проявлять осторожность, чтобы проверить чистоту образцов Ab по SDS-страницы.