Кожа биопсии эксплантата культуры для отвлечения Первичные человеческие фибробласты

Резюме

Культуре фибробластов эксплант протокол от человека биопсию кожи удар технически надежной и простой способ для получения клеток кожи в течение 4-8 недель для банковской около 15-20 миллионов клеток на низких проход.

Аннотация

Тканей и клеточных линий, полученных от индивидуума с заболеваниями являются идеальными источниками для изучения связанных с болезнью сотовых фенотипы. Пациент полученные фибробласты в этом протоколе были успешно использованы при выводе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для модели болезни ^1. Ранние проходы этих фибробласты могут также использоваться для основанных на клетках функциональных анализов для изучения конкретных путей заболевание, механизмы ² и последующие подходы скрининга препаратов. Преимущество представленных протоколов более ферментативной процедуры являются: 1) воспроизводимость техники из небольшого количества тканей, полученных из пожилых пациентов, например пациентов, страдающих болезнью Паркинсона, 2) технически простым подходом над более сложной методологии использования ферментативного лечения, а также 3 ) время рассмотрения: этот протокол занимает 15-20 минут и может быть выполнена сразу же после прибытия биопсии. Ферментативный лечение может занять до 4 часов, а есть проблемыизбытком, снижение жизнеспособности клеток и последующего прикрепления клеток, когда не обрабатываются должным образом. Этот протокол описывает Вскрытие и подготовка 4-мм человека биопсию кожи для отвлечения культуры фибробластов и имеет очень высокий показатель, что важно при работе с пациентом полученных образцов ткани. В этой культуре, кератиноциты мигрировать из биопсии ткани в течение первой недели после приготовления. Фибробласты появляются через 7-10 дней после первого вырост кератиноцитов. DMEM высокий сред глюкозы с добавлением 20% FBS способствует росту фибробластов на кератиноциты и фибробласты перерасти кератиноцитов. После 2 пассажа кератиноциты были разбавляют что приведет к возможности относительно однородных культур фибробластов выражающая фибробластов маркером SERPINH1 (HSP-47). Используя этот подход, 15-20 млн. фибробласты могут быть получены в течение 4-8 недель для мобильного банкинга. Вскрытие кожи занимает около 15-20 мин, клетки затем контролировать один раз в деньпод микроскопом, и средств массовой информации меняется каждые 2-3 дня после привязанности и нарост клеток.

протокол

Биопсия кожи получены с использованием стандартных процедур ³ (например, полученные с 4мм круглый инструмент Visipunch) не должны оставаться в полной DMEM СМИ 20% FBS на льду. После того, как образец прибыл в лаборатории, обрабатывать биопсии как можно скорее.

1. Подготовка кожи биопсии

ШАГИ 1.1-1.3 должны быть выполнены по биобезопасности ВНУТРИ ШКАФА

1. Подготовьте заранее: Добавить 1 мл 0,1% желатина в каждую лунку 6-луночный планшет. Установите пластину в сторону в течение 30-60 мин. Аспирируйте желатинового раствора и добавляют 800 мкл полной DMEM/20% FBS среды в каждую лунку. Убедитесь, что вся поверхность также покрыта информации.
2. Инверсия крышку стерильный 10 см чашку для культуры ткани и добавляют 1,5 мл DMEM / 20% FBS среды к середине крышки и распространено падения среды с кончиком серологической пипетки.
3. С помощью стерильного пинцета, место тОн биопсии кожи кусок в средствах массовой информации на блюдо.

2. Рассечение кожи биопсии

Шаги 9 2.1-2.2 должны быть выполнены внутри горизонтальных ламинаре

1. Поместите нижнюю часть 10 см чашку на перевернутой крышкой, и передают биопсии кожи для рассечения микроскоп в ламинарном боксе.
2. Проанализируйте 4-мм выстрел биопсии кожи в 12-15 одинакового размера куски с острыми краями, сокращая штук в равные половины с помощью одного скальпеля провести биопсию на месте, а второй скальпелем разрезают качения в одном направлении. Pieces с рваными краями способствуют неправильное прикладывание / Сотовые вырост.

3. Передача расчлененный биопсия кожи части в тканевую культуру,

ШАГИ 3.1-3.6 должны быть выполнены по биобезопасности ВНУТРИ ШКАФА

1. Поместите нижнюю часть 10 см чашку для культуры тканина вершине перевернутой крышки и передачи обратно в блюдо к шкафу биологической безопасности.
2. С помощью заостренного щипцов, место 2-3 биопсии части в каждой лунки подготовленных 6-луночный планшет, содержащий 800 мкл и не на сухих скважин. Использование нажав или скользящее движение, чтобы получить части для присоединения к забою скважины. Скальпель полезно удалить биопсию части от щипцов.
3. Поместите 6-луночный планшет в 37 ° С в инкубаторе. Контролировать ежедневное чтобы у пассажиров было пленкой СМИ покрытием дне колодца в течение первой недели, добавить ~ 200 мкл каждые 2 дня для замены любого выпаривали СМИ.
4. Через неделю увеличить количество средств массовой информации до 2 мл полной DMEM/20% FBS и изменение среды каждые 2-3 дня.
5. Как только фибробласты сливающийся в каждой лунке до точки, где фибробластов достигают краев хорошо, Trypsinize и проход 6-луночный планшет в 2X колбах Т75 (проход 1). Кусочки ткани могут быть переданы, а также. Они не придают и стирать Oут во время следующей смены СМИ.
6. Как только фибробласты сливающиеся, передавать их на 3X колбах Т175 (проход 2), замораживание в полной DMEM СМИ плюс 10% ДМСО при 1x10 ⁶ клеток / мл на флакон.

4. Характеристика Фибробласты через Иммуноокрашивание

1. Культуры фибробластов в 8 также слайд камере, покрытой желатином.
2. Когда клетки на 80% слияния, аспирации среды из каждой лунки.
3. Fix клеток в 4% параформальдегид в течение десяти минут при комнатной температуре.
4. Промыть лунки 3 раза 1X PBS.
5. Клетки проницаемыми с 150 мкл 0,3% Тритон Х-100 (в PBS) в течение 5 мин при комнатной температуре.
6. Промыть лунки 3 раза 1X PBS.
7. Добавить 200 мкл блокирующего раствора (PBS + 5% нормальной козьей сывороткой (Vector, S-1000)) в течение 1 часа при комнатной температуре.
8. Подготовить разбавления 1:250 Anti-SERPHIN-1 (Anti-кролика, МАБ, Sigma, S5950-200 мкл) в блокировании решения.
9. spirate блокирующего раствора и добавляют 150 мкл 1:250 разбавление AntiSERPINH-1. Инкубируют при 1-2 ч при комнатной температуре или при 4 ° С в течение ночи.
10. Промыть лунки 3 раза 1X PBS.
11. Подготовьте 1:200 козы против кроличьего моноклонального антитела (Alexa Fluor козы против кроличьего IgG (H + L), Invitrogen, A11008) в блокирующем растворе.
12. Добавить 150 мкл 1:200 козы против кроличьего моноклонального антитела в каждую лунку. Инкубировать в течение 1 ч, в темном, при комнатной температуре.
13. Вымойте скважин один раз 1xPBS.
14. Аспирируйте PBS, и осторожно снимите камеры, чтобы выявить только слайда.
15. Монтаж салазок с 2-3 капли монтажной средой, содержащей DAPI (Vector, H-1200).
16. Анализ слайд под флуоресцентным микроскопом.

Результаты

Кератиноциты, растущие из частей биопсии, как только 48 часа после вскрытия. Первый результат фибробластов можно наблюдать около одной недели после обработки. После скважин достигли слияния, фибробласты пассировать в течение еще двух отрывков, достигнет трех колб 150 см (T150) и клетки замо...

Обсуждение

С помощью этого протокола относительно чистых культур фибробластов кожи могут быть получены. Фибробласты имеют характерные морфологические особенности удлиненное, веретенообразной клеточных тел, круглой или овальной формы клеточных ядер, и фибробласты растут выровнены и в связках, ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Equipment	Company	Catalogue Number
Dissecting microscope	Leica	S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish	VWR	25382-166
6-well Tissue Culture plate	VWR	73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex	VWR	21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes	VWR	21008-940
2 mL Serological Pipettes	VWR	89130-894
5 mL Serological Pipettes	VWR	89130-896
10 mL Serological Pipettes	VWR	89130-898
Pasteur Pipettes	VWR	14672-380

Name of Reagent	Company	Catalogue Number
1X DMEM: High Glucose	Invitrogen/Gibco	11960-069
20% Fetal Bovine Serum	Invitrogen/Gibco	26140-079
1X L-Glutamine	Invitrogen/Gibco	25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids	Invitrogen/Gibco	11140-076
1X Penicillin/Streptomycin	Invitrogen/Gibco	15140-163