Генетическое изучение регенерации аксонов с искусственного взрослых нейронов ганглиев

Резюме

В пробирке Модель для генетических исследований регенерации аксона использование культурного взрослой мыши нейронов ганглия корень описано. Метод включает в себя re-suspension/re-plating шаг, чтобы аксона возобновления роста от нейронов проходят генетических манипуляций. Этот подход особенно полезен для потерей функции исследования регенерации аксона использованием РНК-интерференции на основе белка нокдаун.

Аннотация

Хорошо известно, что зрелые нейроны в центральной нервной системе (ЦНС), не может восстановить свои аксоны после травмы в связи со снижением внутреннего способность поддерживать рост аксонов и враждебной среде, в зрелом ^1,2 ЦНС. В отличие от зрелых нейронов в периферической нервной системы (ПНС) легко восстанавливать после травм ^3. Взрослые спинномозговых ганглиев (DRG) нейронов хорошо известны надежно восстанавливать после повреждений периферических нервов. Каждый нейрон DRG растет один аксон из клетки сомы, которая разделяется на две ветви аксонального: периферические ветви, иннервирующие периферический цели и центральный филиал распространяются на спинной мозг. Травмы периферических DRG результаты аксонов в регенерации аксона существенное, в то время как центральные аксоны в спинной мозг восстанавливает плохо после травмы. Однако, если периферическое аксонального повреждения происходит до травмы спинного мозга (этот процесс называется кондиционирования поражения), регенерацию аксонов центральной greatlу улучшилось ^4. Кроме того, центральные аксоны DRG нейроны одни и те же враждебном окружении как убыванию кортикоспинальных аксонов в спинном мозге. Вместе, он предположил, что молекулярные механизмы, контролирующие регенерацию аксонов взрослых нейронов DRG могут быть использованы для повышения ЦНС Аксон регенерации. В результате взрослые нейроны DRG настоящее время широко используются в качестве модельной системы для изучения восстановительного роста аксонов ^5-7.

Здесь мы опишем метод взрослых DRG нейрона культуры, которая может быть использована для генетического исследования регенерации аксонов в пробирке. В этой модели для взрослых DRG нейронов генетически модифицированных с помощью электропорации опосредованной трансфекции гена ^6,8. По трансфекции нейронов с ДНК плазмиды или Si / ShRNA, такой подход позволяет как усиление и потерей функции экспериментов по исследованию роли любого гена интересов, в аксон роста у взрослых нейронов DRG. Когда нейроны трансфицированных Si / ShRNA, целевой белок является эндогеннымОбычно обедненного через 3-4 дня в области культуры, во время которых высокие темпы роста аксонов уже произошло, в результате чего с потерей функциональных исследований менее эффективными. Чтобы решить эту проблему, метод, описанный здесь, включает в себя повторное приостановление и повторное покрытие шаг после трансфекции, которая позволяет аксонам повторно вырастить из нейронов в отсутствие целевого белка. Наконец, мы приведем пример использования этой модели в пробирке для изучения роли аксона регенерации связанных генов, с-Jun, в качестве посредника аксона роста у взрослых DRG нейронов ^9.

протокол

1. Подготовка Покровные, культуры средних и пищеварения ферменты

1. 12-мм выстрел # 1 стакан покровные служат для нейронов культуры. Покровные очищаются на 10% HCL ночь следует ультразвуковая стирка дистиллированной и деионизированной водой 3 раза (20 мин / время). Очищенные покровные хранятся в 70% этанола для использования в будущем. Перед каждым экспериментов, покровные которые сушат на воздухе и помещали в культуру пластину.
2. Для покрытия сухие покровные, 100 мкл покрытия раствор, содержащий 100 мкг / мл Poly-D-лизина и 10 мкг / мл Ламинин рабочего раствора добавляют на каждый покровное и культуры пластины переносят в 37 ° C инкубатора. Через 1-2 ч, раствор для покрытия удаляют, а покровные промывали 3 раза стерильной 1X PBS.
3. Для приготовления питательной среды, минимально необходимого среднего (MEM) дополнен с 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 1X пенициллин-стрептомицина решения (500 единиц penicilлина и 500 мкг стрептомицина), 1X GlutaMAX-я добавка, и антимитотическим реагентов, содержащих 20 мкМ 5-фтор-2-дезоксиуридина и 20 мкМ уридина (FDU / R). Для свободной от сыворотки среде, FBS заменяется дополнением B27.
4. Коллагеназы раствор готовится путем растворения порошка коллагеназы с MEM, чтобы рабочие концентрации 1 мг / мл. Для трипсина, 1X TrypLE Экспресс используется.

2. Вскрытие и урожай взрослых мышей нейроны DRG

1. После эвтаназии 6 - 10 недель взрослой мыши, удалите спинной кожи и отрезать весь позвоночный столб. Вымойте удалить позвоночник с 1 X PBS 2-3 раза.
2. Прикрепите удалить позвоночник на вскрытии пластины с вентральной стороной вверх, и тщательно удаляет мышцы подвергать чувствительные нервы при вскрытии микроскопом. Нервов связана с ДРГ на пиломатериалы уровне толстой и легко найти. Таким образом, для большинства экспериментов только поясничныйДРГ собирают.
3. Избавьтесь от каждого позвонка вдоль осевой с маленькими ножницами и осторожно удалите межпозвоночных дисков. Используя щипцы для разделения каждого позвонка, чтобы разоблачить спинного мозга.
4. Чтобы вскрыть из древесины ДРГ, поднимите каждый нерв пиломатериалы щипцами и проследить к спинному мозгу, чтобы найти связанные поясничного ДРГ (от L1 до L6).
5. Отрежьте каждую DRG от приложенных периферических нервов, спинной и брюшной корни весной ножницы, и хранить его в микроцентрифужную трубки с MEM среде, помещенной на льду. Более ДРГ на различных уровнях спинного (например, грудной ДРГ) можно разрезать в Аналогичным образом, когда это необходимо.

3. Пищеварение и диссоциация взрослой мыши Нейроны DRG

1. После сбора всех расчлененный ДРГ, заменить MEM среде с 1 мл коллагеназы решение и инкубировать микроцентрифужную трубы при 37 ° С в течение 90 мин.
2. Замените коллагеназы решение с объемом 500 мкл 1X TrypLE Экспресс такlution и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 15-20 мин.
3. Удалить TrypLE решение Экспресс и мыть ДРГ 1 мл подготовленной питательной среде (содержащей 5% FBS) в 3 раза.
4. Добавить 600 мкл питательной среды и осторожно пипетировать вверх и вниз, чтобы растереть тканей в 20-30 раз с использованием 1 мл синий, окончил пипетки.
5. После растирания, позволяющие не-диссоциированных тканей осесть на дно микроцентрифужную и передачи клеточной суспензии в 10 мл стерильной пробирке. Добавьте еще 600 мкл культуральной среды, и повторите шаг растирания до самой ткани разобщены. Полученную суспензию клеток содержит нейроны и не нервных клеток. В большинстве случаев, клетки с 6 ДРГ (~ 5 × 10 ⁴⁾ используются для одного электропорации реакции.

4. Генетические манипуляции нейронов через Электропорация

1. Подготовка трансфекции решение путем смешивания раствора Amaxa nucleofection мыши нейронов с ДНК плазмиды (~ 10 мкг) Или миРНК олигонуклеотидов (~ 0,2 нмоль), чтобы конечный объем 100 мкл для каждого трансфекции.
2. Центрифуга диссоциированных клеток при 680 оборотов в минуту в течение 7 минут при комнатной температуре, а также отказаться от супернатант как можно больше. Добавьте приготовленный раствор трансфекции и осторожно пипетировать вверх и вниз по 3-4 раза с 200 мкл наконечники повторно приостанавливать клеток.
3. Передача суспензии клеток смешивается с трансфекции решение электропорации кюветы и electroporate клеток с использованием системы Amaxa Nucleofector программе G-013.
4. После электропорации, сразу же добавить 500 мкл подогретого (37 ° C) культуральной среде, содержащей FBS в кювет и передать все решения (~ 600 мкл) в покрытие пластин культуры в желаемой плотности клеток. Для эксперимента, который требует повторного приостановления и повторное покрытие, нейроны культивировали непосредственно на пластиковой блюдо культуры при высокой плотности (10000-20000 клеток / лунку). Для эксперимента, который непосредственно рассматривает аксона роста нейронов покрытием ОНТО покрытием покровные стекла при низкой плотности (3000-5000 клеток / лунку). Поместите пластину культуры в инкубатор (37 ° C, 5% CO _2).
5. Четыре часа после нанесения покрытия, когда нейроны прикреплены к подложке, мягко замену питательной среды (в котором содержится решение Amaxa nucleofection) с 500 мкл свежей и подогретого культуральной среде, и вернуть пластины в инкубатор для дополнительного культуры (37 ° C , 5% СО _2). Оба культуральной среде, содержащей FBS или бессывороточной среде могут быть использованы на этом этапе.

5. Культивирование взрослых DRG нейроны для Axon Анализ роста

1. Для нейронов трансфицированных ДНК плазмиды, экспрессия гена интересов, (например, EGFP) можно наблюдать уже через несколько часов после электропорации. Для нейронов трансфицированных siRNAs, мы обычно ждать 3-4 дней, чтобы обеспечить достаточное истощения эндогенных белков. Культивируемых нейронов может быть либо непосредственно установленной для анализа роста аксонов в варионас моменты времени (1-4 дней после электропорации) или повторно приостановлена ​​и вновь покрыты проанализировать аксона отрастания (см. ниже).
2. Для RNAi-опосредованной потерей функциональных исследований, культивируемых нейронов может быть повторно приостановлено и вновь покрыты, чтобы вырастить аксоны от нейронов, в которых целевые белки уже исчерпаны. Чтобы это сделать, заменить старые питательной среды высокой плотности культивируемых нейронов с 1 мл подогретого свежего среднего и пипеткой осторожно вверх и вниз по 6-10 раз повторно приостанавливать прилагаемой нейронами из культуры пластины. Потому что без нервных клеток (например, Шванн клеток) приложить гораздо крепче, чем блюдо культуры нейронов, ресуспендировали клетки в основном нейроны.
3. Передача ресуспендировали нейронов в микроцентрифужную трубку и нежно растереть в 10-15 раз повторно отделить клетки сгустки в суспензии отдельных клеток.
4. Re пластины повторно диссоциированных нейронов на недавно подготовленный покровные при низкой плотности (3000-5000 клеток / лунку) и культуры в течение ночи (16-24 часов).

6. Фиксация, Иммуно-окрашивания и флуоресценции

1. Аспирируйте среды и добавить 4% параформальдегид (PFA) (200 мкл / лунку), чтобы зафиксировать клетки в течение 15-20 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки затем промывают 1X PBS 3 раза.
2. Аспирируйте PBS и добавьте в блокирующий раствор (1% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Тритон Х-100 и 2,0% нормальной козьей сывороткой в ​​1X PBS) с фиксированной нейронов в течение 60 мин при комнатной температуре.
3. Чтобы ярлык аксонов, нейронов иммуно-окрашенных анти-НФ или анти-βIII тубулина антителами. Для этого поместите каплю 30μl первичной решение антител (1:1200 разбавления для βIII-антитело тубулина) на парафильмом для каждого покровным. Обратить покровные и поместить их на первичном решение антител в течение 60 мин при комнатной температуре.
4. Вернуться покровные к первоначальному пластины культуры и промойте их 1X PBS 3 раза.
5. Повторите ту же процедуру для вторичногоtibody.
6. Вымойте покровные дистиллированной водой 3 раза, а затем смонтировать на покровных стекол с монтажными решение (например, продлить Золото Antifade).
7. Окрашенные нейроны могут быть отображены с любой флуоресценции системы микроскопии оснащена цифровой камерой. Аксон длины измеряются и анализируются с помощью программного обеспечения анализа изображений.

7. Представитель Результаты

В отсутствие добавленную внеклеточных факторов роста, взрослые нейроны DRG обычно начинают расти аксонов 48 часов после первого покрытия. Аксоны часто показывают разветвленной морфологии (рис. 1). С другой стороны, повторное покрытие нейроны начинают распространяться аксоны лишь несколько часов после того, как покрытие, а аксоны удлиненное с очень уменьшена ветвления (рис. 2). Эти результаты показывают, что повторное покрытие нейроны имеют схожие свойства этих кондиционирования пораженном нейронов. Используя этот подход, мы недавно провели потерьпо-функциональных исследований для изучения роли аксона регенерации связанного фактора транскрипции с-Jun роста аксонов от взрослых DRG нейроны в пробирке. Результаты показали, что электропорации группа из 4 различных siRNAs предназначенные для разных регионов с-Jun (ON-TARGETplus) заметно снизили уровни белка С-июнь у взрослых нейронов DRG 3-х дней после трансфекции (рис. 3) ^9. Когда нейроны были повторно покрытием и культурной ночь, рост аксона от С-Jun нейронов нокдаун был значительно уменьшен (Control: 348,37 ± 16.21mm, Si-C-июнь: 262,32 ± 15,69 мкм, 3) ^9. Эти результаты показывают, что культивируемых нейронов DRG взрослых стать полезной модели системы для изучения роста аксонов от взрослых нейронов.

Рисунок 1. Взрослых нейронов мыши DRG культивировали при низкой плотности в течение 3 дней. Нейроны были окрашены анти - и бETA, III тубулина антителами. Заметим, что большинство аксонов показать разветвленной морфологии. Масштаб по сайту: 125 мкм.

Рисунок 2. Повторное покрытие взрослой мыши DRG нейроны через 3 дня в области культуры. (A) нейроны взрослых DRG культивировали при высокой плотности в течение 3 дней. (B) Re покрытием нейронов взрослого DRG культивировали при низкой плотности на ночь. Заметим, что большинство аксонов показать удлиненный морфологии с небольшим аксона ветвления. Шкала бар: 250 мкм и 125 мкм в B.

Рисунок 3. Роль в-июнь в аксон роста у взрослых нейронов DRG в пробирке. (A) Вестерн-блот анализ с-Jun в мышь взрослых DRG нейронов после электропорации с-Jun siRNAs. Результат показывает, заметно снижается уровень С-июне (B) Управление нейронов трансфицированных EGFP вырос длинный аксонов после повторного покрытия и ночной культуры. (C) Co-транс-дезинфекции с-Jun siRNAs и EGFP нарушение роста аксонов от взрослых DRG нейронов после повторного покрытия и ночной культуры. Красный: Tuj-1 окрашивания; Зеленый: EGFP. Масштаб по сайту: 125 мкм. Эти результаты были опубликованы в Saijilafu соавт. ^9.

Обсуждение

Взрослые нейронов DRG восстановить свои аксоны решительно после повреждения периферического нерва в естественных условиях и в пробирке, обеспечивая тем самым полезную для изучения регенерации аксонов у взрослых животных. В пробирке культуру взрослых нейронов DRG станови...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
MEM	Invitrogen	11090-081
Поли-D-лизин гидробромида	Sigma-Aldrich	P6407
Ламинин	Invitrogen	23017-015
5-фтор-2-дезоксиуридина	Sigma-Aldrich	F0503
Уридина	Sigma-Aldrich	U3003
Коллагеназы	Roche	10103578001
TrypLE Экспресс	Invitrogen	12604-013
Эмбриональной телячьей сыворотки	Invitrogen	10270-098
Пенициллин, стрептомицин (100X)	Invitrogen	15140-122
GlutaMAX-I (100X)	Invitrogen	35050-038
Стекло покровные (# 1)	Электронная микроскопия наук	72196-12
24-луночный планшет культуре клеток	Becton Dickinson	35-3047
1X PBS	Mediatech	21-040-CV
Стерильные, дистиллированной и деионизированной воды	Mediatech	25-055-CV
Nucleofector и электропорации Наборы для мыши Нейроны	Lonza	ВПГ-1001
ON-TARGETplus миРНК против С-июнь	Dharmacon	L-043 776
Анти - βIII антител тубулина (Tuj-1)	Covance	MMS-435P
Продлить Золото Antifade решение для монтажа	Invitrogen	P36930