Измерение листьев гидравлические проводимости и проводимости устьиц и их реакции на освещенность и обезвоживание Использование метода испарительного Flux (EFM)

Резюме

Мы описываем относительно быстрой (30 мин) и реалистический метод для одновременного измерения листа гидравлические проводимости ( K Лист) И проводимости устьиц ( Г S) Для транспирирующей вырезали листья. Этот метод может быть модифицирован для измерения света и обезвоживания ответы K Лист И Г S.

Аннотация

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to achieve a high stomatal conductance (g_s) to capture CO₂ for photosynthesis, water is lost by transpiration^1,2. Water evaporating from the airspaces is replaced from cell walls, in turn drawing water from the xylem of leaf veins, in turn drawing from xylem in the stems and roots. As water is pulled through the system, it experiences hydraulic resistance, creating tension throughout the system and a low leaf water potential (Ψ_leaf). The leaf itself is a critical bottleneck in the whole plant system, accounting for on average 30% of the plant hydraulic resistance³. Leaf hydraulic conductance (K_leaf = 1/ leaf hydraulic resistance) is the ratio of the water flow rate to the water potential gradient across the leaf, and summarizes the behavior of a complex system: water moves through the petiole and through several orders of veins, exits into the bundle sheath and passes through or around mesophyll cells before evaporating into the airspace and being transpired from the stomata. K_leaf is of strong interest as an important physiological trait to compare species, quantifying the effectiveness of the leaf structure and physiology for water transport, and a key variable to investigate for its relationship to variation in structure (e.g., in leaf venation architecture) and its impacts on photosynthetic gas exchange. Further, K_leaf responds strongly to the internal and external leaf environment³. K_leaf can increase dramatically with irradiance apparently due to changes in the expression and activation of aquaporins, the proteins involved in water transport through membranes⁴, and K_leaf declines strongly during drought, due to cavitation and/or collapse of xylem conduits, and/or loss of permeability in the extra-xylem tissues due to mesophyll and bundle sheath cell shrinkage or aquaporin deactivation^5-10. Because K_leaf can constrain g_s and photosynthetic rate across species in well watered conditions and during drought, and thus limit whole-plant performance they may possibly determine species distributions especially as droughts increase in frequency and severity^11-14.

We present a simple method for simultaneous determination of K_leaf and g_s on excised leaves. A transpiring leaf is connected by its petiole to tubing running to a water source on a balance. The loss of water from the balance is recorded to calculate the flow rate through the leaf. When steady state transpiration (E, mmol • m^-2 • s^-1) is reached, g_s is determined by dividing by vapor pressure deficit, and K_leaf by dividing by the water potential driving force determined using a pressure chamber (K_leaf= E /- Δψ_leaf, MPa)¹⁵.

This method can be used to assess K_leaf responses to different irradiances and the vulnerability of K_leaf to dehydration^14,16,17.

протокол

1. Измерение листьев гидравлические проводимости для Гидратированный листья (K _макс)

1. Сбор побеги желательно в вечернее или ночное время, что ксилемы напряженность низкий, разрезать воздух и поместить в темное пластиковые мешок с мокрыми бумажными полотенцами. В лаборатории, Recut по крайней мере, двумя узлами в конце каждой съемки под водой. Пусть стреляют увлажняет ночь в чистой воде, или другие решения, которые будут использоваться для измерения K _листа. Сверхчистой воды рекомендуется в качестве потока решений, если последствия различных решений должны быть исследованы как фактор.
2. Разрежьте лист от побега с новым лезвием бритвы под частично дегазированной потока раствора. Сверхчистой воды рекомендуется в качестве потока решений, если последствия различных решений должны быть исследованы как фактор. Мы рекомендуем дегазации решение в течение ночи в колбе с помощью вакуумного насоса, но и другие методы могут быть использованы.
3. Wrap предварительно растянутой парафильмом вокруг petioле, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между черешком и трубопроводов. Этот шаг является особенно полезным для некруглой черешках, как упаковка дополнительные парафильмом поможет вокруг черешка, чтобы поместиться внутри трубки. Стоматологическая паста может быть применена к черешка до обертывания парафином, чтобы заполнить пазы в черешках.
4. Подключите листа на силиконовой трубки под сверхчистой воды для предотвращения попадания воздуха в систему. Как листа поднимается над источником воды, воды в трубопроводе находится под давлением ниже атмосферного, и таким образом уплотнение хорошо, если воздух не втягивается в трубку во время измерения. В качестве альтернативы герметизации черешках непосредственно в силиконовые трубки, компрессионный фитинг с резиновой прокладкой могут быть использованы (например, (Omnifit A2227 отверстие адаптера; Omnifit, Кембридж, Великобритания); такой подход полезен для черешки с особенно сложной формы, или травинки , который можно обернуть вокруг стеклянного стержня и скреплено компрессионный фитинг. Когда это возможно, герметизации черешок непосредственно в сиlicone трубка имеет то преимущество, что быстрое и оставляя черешок НКТ узел, который является прозрачным, что позволяет пузыри, чтобы быть более легко видеть. Трубка соединяет лист на жесткий трубопровод работает в мерный цилиндр на балансе (± 10 мкг разрешение), которое записывает данные каждые 30 секунд на компьютере (например, с помощью «Баланс Link" программное обеспечение; Mettler-Toledo GmbH, Greifensee, Швейцария) Для расчета расхода через листья.
5. Листья должны быть проведены адаксиальной поверхностью вверх в лес кадры с нанизанными на леску над большой поклонник коробки и под источником света (> 1000 мкмоль • м ² • с ^-1 фотосинтетически активной радиации высокой освещенности измерения), что несколько выше уровня мениска в мерный цилиндр. Лист должен быть помещен над водой в мерный цилиндр, чтобы убедиться, что движение воды в лист обусловлен транспирации, и не входящие в лист под давлением силы тяжести, равно как ив случае, если лист были помещены ниже мениска воды в цилиндре. Малый контейнеров с мокрым бумажным полотенцем должны быть размещены внутри баланс камеры для обеспечения воздухом в балансе насыщен водой, что позволяет избежать испарения с источником воды в атмосферу в балансе. Эта возможность может быть проверена путем прекращения потока в слой с использованием четырех-ходовой кран клапан в трубы, и убедившись, что масса воды цилиндр на баланс не уменьшается.
6. Поместите прозрачный контейнер Pyrex заполнен водой выше листьев для поглощения тепла от лампы.
7. Поддержание лист температуре от 23 ° C и 28 ° C в течение всего эксперимента, добавляя больше холодной воды в контейнер Pyrex, что тепла лампы не нагреваются контейнер Pyrex достаточно, чтобы нагреть воздух вокруг листьев ниже.
8. Разрешить листа к выяснится на аппарат в течение по крайней мере 30 минут, что дает достаточно времени, чтобы акклиматизироваться к высокой освещенности, а также дополнительonally, пока расход стабилизируется, не вверх или вниз тенденция, и с коэффициентом вариации <5%, по крайней мере, 5-10 измерений, проведенных на 30-секундными интервалами поток. Важно, чтобы скорость потока для достижения устойчивого состояния, потому что этот метод предполагает стабильное _лист Ψ. Предыдущие исследования показали, эти критерии должны быть достаточными для стабилизации расхода (E), Ψ _листа и _листа K; тесты с более длинными периодами измерения после стабильный поток был создан показали никакого отношения _листа K для измерения времени для каждого из семи видов широком Диапазон листьев емкостью ^17,18. Стабилизация обычно занимает 30 минут или меньше, но у некоторых видов может потребоваться более часа для некоторых видов.

Примечание: При расходе очень низкой (<8 мкг с ^-1), стабильность может быть определена с помощью скользящего среднего за последние пять каждые 30 сек.

9. Откажитесь измерений, если поток внезапно меняется, либо из-за внезапного закрытия устьичных, или видимая утечка из уплотнений или блокировка в системе частиц или пузырьков воздуха.
10. Когда поток стабилизируется, записывать лист температуры с помощью термопары.
11. Быстро удалить лист из трубки, мазок высушить и поместить черешок листа в герметичный мешок, который ранее был выдохнул, чтобы остановить испарение.
12. Пусть слой равновесие в своей сумке, по крайней мере 20 мин.
13. Средний последних 10 измерений расхода. Это будет ваш E измерения.
14. Когда лист находится в равновесии, измерить окончательный потенциал воду листьев (Ψ _финал) с напорной камеры.
15. Измерьте площадь листьев с планшетного сканера и программного обеспечения для обработки изображений, или с метра площади листа.
16. К _лист рассчитывается как E / _{ΔΨ-лист (лист,} где ΔΨ = Ψ _{окончательное} - 0 МПа) и далее нормированной площади листа. Единицы в ммоль м ^-2 с ^-1 МПа ^-1. Потому что листья расположены чуть выше уровня воды в мерный цилиндр, действие силы тяжести в снижении давления воды на входе в лист будет незначительным, особенно по отношению к Ψ _финал, который всегда> -0,1 МПа.
17. Для коррекции изменений в K _листа индуцированных температурную зависимость вязкости воды ^15,19,20, стандартизировать значения K _листа до 25 ° C с помощью следующего уравнения:

18. Проводимости устьиц _(г) может быть определена как E, деленная на лист-воздух паров перепад давления, что эквивалентно паре давлеRe дефицит (ДДП), определяется с помощью температуры и относительной влажности датчик рядом с листа. ДДП рассчитывается по следующей формуле ²¹

где RH является относительной влажности, вице-президент является давление насыщенных паров в воздухе (в кПа; зависимости от температуры, в соответствии с уравнением Arden Buck ^22), А. П. атмосферного давления (в кПа).

2. Измерение листьев гидравлические проводимости для обезвоженной Листья

1. Сбор побеги желательно в вечернее или ночное время, что ксилемы напряженность низкий, разрезать воздух и поместить в темное пластиковые мешки с мокрыми бумажными полотенцами. В лаборатории, Recut по крайней мере, двумя узлами в конце каждой съемки под водой. Пусть стреляют увлажняет ночь в чистой воде, или другие решения, которые будут использоваться для K _леAF измерений. Сверхчистой воды рекомендуется в качестве потока решений, если последствия различных решений должны быть исследованы как фактор.
2. Вырезать побеги на отрезки по меньшей мере тремя листьями под сверхчистой воды и обезвоживанию побеги с вентилятором для различных периодов времени в диапазоне значений Ψ _листа.
3. Как только побеги обезвоженной, разместить герметичные мешки (Вихрь-Pak; Nasco, Форт-Аткинсон, Висконсин, США), которые были ранее в выдыхаемом) вокруг каждого листа побега, а затем поместить весь стрелять в большой герметичный мешок с мокрой бумаге полотенце.
4. Пусть стреляют равновесия в течение по крайней мере 30 минут (для сильно обезвоженной побегов более длительное время уравновешивания может быть необходимым).
5. После уравновешивания, акцизы верхнего и нижнего листа и мерой начальной Ψ _лист (Ψ = _O) с помощью барокамеры.
6. Откажитесь от побега, если разница в _лист Ψ этих двух листьев более 0,1 МПа (для стронGly обезвоженных листьев, этот диапазон может быть расширен до 0,3 МПа).
7. Третий лист затем используется для определения K _{листьев} и д _ы с EFM, следующие шаги 1,2 -1,18 выше. Примечательно, что устойчивый E состоянии может быть получена даже листья, которые были сильно обезвоженной листья, как устьица остаются открытыми и генерировать значения _G S существенно выше, чем кутикулярной проводимости ^17.
8. Для построения кривых гидравлических уязвимости, вычислить K _листа помощью Ψ _финал, как в шаге 1,16, а затем сюжет K _листа значения против зависимости от того, низкая, Ψ Ψ _о или _{окончательный,} т. е. сильным обезвоживанием испытывают листа в ходе эксперимента (= Ψ _{самый низкий).} Кроме того, снижение г _с в ответ на обезвоживание листьев может быть определена путем построения г _с против Ψ _{низкая.} Предыдущая работа имеет ш собственные, что обезвоживание вызывает по меньшей мере частично необратимым снижением K _{листьев} и г _с ^14,16.
9. Мы рекомендуем получения по меньшей мере 6 K _листа значения в 0,5 МПа интервал Ψ _низкая (этот интервал может быть сокращен до 0,25 МПа, если вида вы работаете с действительно уязвимы к обезвоживанию).
10. Выполните Диксон выброса тест на значениях K _лист для каждой 0,5 МПа водный потенциал интервал Ψ _низкая для удаления выбросов от вашей уязвимости кривой ^23.
11. Потому что виды различаются в своих ответах К _{листьев} и г _а к обезвоживанию ^14,16, подходят различные функции для каждого вида и выбрать максимального правдоподобия (AIC низкая стоимость; см. ¹⁴ для подробностей). Мы рекомендуем установку по меньшей мере четыре функции, которые ранее использовались в литературе: линейный (ГУ "FO: содержание ширина =" 1,4 дюйма "FO: SRC =" / files/ftp_upload/4179/4179eq3highres.jpg "/>), сигмоидальных ( ), Логистика ( ) И экспоненты ( ).

3. Представитель Результаты

Падение листьев гидравлической проводимости с обезвоживанием сильно варьирует у разных видов (рис. 1). Засуха чувствительных видов испытывать сильное снижение на менее негативные потенциалы воды, чем более засухоустойчивых видов, при измерении в условиях высокой освещенности (PAR> 1000 мкмоль • м ^-2 • с ^-1). Водыпотенциал на 80% потерь гидравлической проводимостью (P ₈₀₎ для мезоатомов травы Helianthus Annuus было 3 МПа менее негативно, чем Heteromeles arbutifolia, родом из Калифорнии колючий кустарник. Heteromeles arbutifolia ответил линейно на снижение водного потенциала, в то время как Helianthus Annuus показали, не -линейное снижение.

Оба проводимости устьиц _(г) и листьев гидравлические проводимости (K _лист) могут также реагировать на резко излучения (рис. 2). Для Raphiolepis показателей, проводимости устьиц сильно сократилось с обезвоживанием для листьев измеряется в условиях высокой освещенности (PAR> 1000 мкмоль • м ^-2 • с ^-1) и при свете лаборатории (PAR <6 мкмоль • м ^-2 • с ^-1). При высокой освещенности, листья измеряли с EFM, которые были обезвоженной к воде потенциал, который характерен для хорошо освещенных LeaVES на интактных растений в середине дня показал аналогичный _G S, как и для листьев измеряется на интактных растений с порометров (звезда на рис. 2). Примечательно, что для листьев при максимальной гидратации, K _листа была в четыре раза выше, листья подвергаются воздействию высоких, чем низкая освещенность (11 против 2,8 ммоль м ^-2 с ^-1 МПа ^-1), и, следовательно, K _{листьев} показал более сильный свет ответ в хорошо гидратированных листьев, чем г _с. Кроме того, в условиях высокой освещенности, K _листа сократился более тесные связи с обезвоживанием. P ₈₀ был 0,93 МПа менее негативно, чем при высокой низкой освещенности.

Рисунок 1. Листьев гидравлического кривые уязвимости для засухи чувствительных (вверху) и устойчивых к засухе (внизу) видов (от ^14,24). Каждая точка представляет собой грехGLE измерения листа гидравлические проводимости (K _листа) на отдельном листе методом испарения потока (EFM). Вертикальные полосы представляют собой водный потенциал, при котором виды потеряли 80% от начальной листом гидравлические проводимости (P _80). Идеально подходит функций с помощью максимального правдоподобия построены для обоих видов.

Рисунок 2. Реакции проводимости устьиц _(г) и листьев гидравлической проводимости (K _листа) к снижению потенциального листьев вода для Raphiolepis показатели измеряются при высоком против низкой освещенности (из ^16). (PAR> 1000 и <6 ммоль • м ^-2 • с^-1). Каждая точка представляет собой одно измерение на отдельном листе методом испарения потока (EFM), с белой и черной точек, представляющих листьев измеряется в условиях высокой и низкой освещенности соответственно. Уравнения для устьичного кривых проводимости в высоком против низкой освещенности: и . Уравнения для уязвимости в кривых высокими и низкими освещенности: и . Серая звезда в верхней панели представляет собой среднее ± станцииndard ошибка _с г листьев и водный потенциал измеряется на листьях интактных растений в середине дня с порометров. Серые и черные вертикальные полосы в нижней панели представляют собой водный потенциал, при котором виды потеряли 80% от начальной листом гидравлические проводимости (P ₈₀₎ при высокой и низкой освещенности соответственно.

Обсуждение

Метод испарения потока, представленные здесь позволяет относительно быстрой (30 мин) определение лист гидравлические проводимости в лабораторных условиях с одновременным измерением проводимости устьиц.

EFM до сих пор метод, который наиболее близко повторяет естественные пути воды в листьях, учитывая, что вода испаряется в лист воздушном пространстве и диффундирует из устьиц ^15. Ряд других экспериментальных методов определения _листа K существует ^25, с тремя быть особенно часто. (1) В высоком методом давления потока (HPFM), вода выталкивается через листья под высоким давлением ^15,26. Тем не менее, уязвимость кривых не могут быть получены с помощью этого метода, поскольку применяется положительное давление может пополнения эмболии и увлажняет мезофилла ткани. (2) В методе регидратации кинетику (РКМ), K _листа рассчитывается с использованием аналогии между регидратации обезвоженные листья с ч.arging конденсатора последовательно с резисторами ^27,28. Этот метод является быстрым, но не воспроизводит всю систему природных transpirational пути в листьях и не так легко изменена, чтобы измерения листьями приспособиться к высокой освещенности. (3) В методе вакуумного насоса (ВПМ) листьев помещают в камеру, ее черешок подключен к источнику воды на баланс, в то время как пылесосы различной интенсивности применяются к воде листьев вождения потери от листьев ^15,26. Этот метод может занять много времени. Измерения с использованием всех трех методов было установлено, дают согласующиеся результаты ^15,28,29, и таким образом EFM часто используется с учетом его основываясь на transpirational движения воды, и ее относительная быстрота, и его модификация для измерения K _листа в различных условиях.

Все типичные методы, используемые для определения K _листа включают уровень неопределенности в количественном соответствииurately движущую силу соответствующего транспирации ^25. В EFM, _лист ΔΨ используется для расчета K _лист ниже, чем истинная движущая сила, так как она основана на основной _лист Ψ после того, как лист находится в равновесии для давления бомбы. На данный момент, основной _лист Ψ не обязательно представляет собой водный потенциал клетки в конце гидравлического пути, где вода испаряется, а объем средневзвешенной за относительно небольшое число клеток с низким потенциалом воды, где вода перемещение и испарения, а также для более многочисленных клеток высокий потенциал воды, которая может быть изолирована от испарения потока. Сколько _{листьев} Ψ отличается от истинной движущей силой таким образом, зависит от того, где вода испаряется в лист. Если вода испаряется по всему листу, основной _лист Ψ может быть близка к истинной движущей силой, и если вода испаряется только из относительно небольшого числа слоктей около устьица, основная _лист Ψ может существенно недооценивает истинной движущей силы, т. е. водный потенциал этих клеток на самом деле может быть гораздо ниже, и таким образом фактически _листа K будет ниже, чем определяется с EFM. Таким образом, степень, что K _листа определяется EFM представляет настоящий _лист K чувствительна к воде потока путей, которые до сих пор не совсем понятны. В то время как EFM предоставляет данные, которые совпадают с другими методами для измерения K _листа (см. выше), и отлично подходит для сравнительного использования, возможность видами изменение пути потока воды через мезофилла нуждается в дальнейшем исследовании. Действительно, даже для листьев данного вида, эти водные пути могут отличаться в разных условиях, например, при различных облучения и тепловых нагрузок ^4,30 или различные состояния воды (с учетом усадки ткани) ^31. Далее знанийна путях водного транспорта, таким образом, позволяют EFM быть использованы для решения последствий изменения путей на общую листьев гидравлического транспорта.

Измерения проводимости устьиц в EFM имеет преимущества позволяющий определение ответов на излучение и обезвоживание, а также предоставление соответствующих ответов г _с с _листа K. Кроме того, эффект предыдущей обезвоживание листа следует регидратации на д _ы могут быть оценены с помощью этого метода. Однако, этот метод имеет две потенциальные недостатки. Во-первых, это измерение _G S выполнен на вырезают лист, а не на заводе нетронутыми, и, во-вторых, определения проводимости устьиц основан на измерении климата на некотором расстоянии от листьев, а не рядом с листа, как в камере порометров , хотя вентиляции листа с вентилятором уравновешивает поверхности листа с окружающим воздухом. Для некоторых видов подакцизныхЛистья могут показывать различные устьичного ответов, чем листьев на заводе ^16,32 нетронутыми. Тем не менее, для некоторых видов _с г оценивается с использованием EFM был похож на значения, полученные на интактных растений с порометров для листьев в середине дня Ψ _лист ¹⁶ (рис. 2).

EFM могут быть применены для понимания физиологической, т. е. исследования динамики K _{листьев,} в своей основе структуры и анатомии, а также ответы на факторы окружающей среды. Кроме того, метод может быть использован для сравнения растений данного вида, выращенных в различных условиях, или разных возрастов, или сравнить растений разных видов, приспособленных к различным средам.

По построения кривых лист уязвимости, можно получить представление о механизмах виды допусков к засухе. Во время засухи, кавитации и клеточной распада было показано, что происходит в лист ксилемы некоторых видов, и сотовые усадки в мезофилла при дегидратации может также повлиять на движение воды (обзор в ^14). Дальнейшие исследования будут необходимы, чтобы определить относительную важность каждого из этих процессов в движении падение K _{листьев} и устьичного закрытия.

Irradiance также является сильным фактором, влияющим K _{листьев} и EFM хорошо подходит для измерений в условиях высокой освещенности. Объединенная реакция аквапорины к освещенности и засухи должны получить большой интерес. Высокая освещенность приводит к увеличению экспрессии и / или активации аквапорины, которые позволяют быстрее потока воды через живые клетки, увеличивая K _листа, в то время как обезвоживание приводит к снижению экспрессии и / или де-activatation аквапоринов, уменьшая K _листа. Комбинированное воздействие освещения и водоснабжения на _листе K требуют дальнейшего изучения ^4,10,16,33.

палатка "> Кроме того, у разных видов, K _листа и его уязвимость была связана с распределения видов по отношению к источнику света воды и других ресурсов ^3,13,24. Виды из засушливых районов, как правило, проявляют большую устойчивость к гидравлическим спад, стоящих перед более отрицательных потенциалов воды в почве, а также поддержание высокого _листа K при более отрицательных потенциалах воды, они могут поддерживать высокую г _с и продолжить съемку CO ₂ для фотосинтеза ^13,14. Таким образом, исследование листьев гидравлические свойства позволяют судить на уровне клетки, лист, и все растение и его реакции на окружающую среду, и, скорее всего, с получением многочисленных важных новых открытий на всех уровнях.