Анализ и построение структуры нуклеиновых кислот с 3DNA

Резюме

3DNA пакет программного обеспечения является популярным и универсальным биоинформатики с возможностями, анализировать, строить и визуализировать трехмерные структуры нуклеиновых кислот. В данной статье представлены подробные протоколы для подмножества новые и популярные функции, доступные в 3DNA, применимо и к отдельным структурам и ансамбли связанных с ними структур.

Аннотация

3DNA пакет программного обеспечения является популярным и универсальным биоинформатики с возможностями, анализировать, строить и визуализировать трехмерные структуры нуклеиновых кислот. В данной статье представлены подробные протоколы для подмножества новые и популярные функции, доступные в 3DNA, применимо и к отдельным структурам и ансамбли связанных с ними структур. Протокол 1 перечислены набор инструкции, необходимые для загрузки и установки программного обеспечения. После этого следует, в Протоколе 2, путем анализа нуклеиновых кислот структуры, включая назначение пар оснований и определение твердого тела параметров, которые описывают структуру и, в Протоколе 3 к описанию реконструкции атомное модель строения от своего твердого тела параметров. Самая последняя версия 3DNA, версия 2.1, добавлены новые функции для анализа и манипулирования ансамблей структур, таких, как вывести из ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и молекулярной динамики (MD) Моделирования; эти особенности представлены в протоколах 4 и 5. В дополнение к 3DNA автономный пакет программного обеспечения, веб-сервер w3DNA, расположенный на http://w3dna.rutgers.edu , предоставляет удобный интерфейс для выбранных функций программного обеспечения. Протокол № 6 демонстрирует роман особенность сайта для построения моделей длинных молекул ДНК украшены связанных белков в указанное пользователем место.

Введение

Понимание трехмерные структуры ДНК, РНК и их комплексов с белками, наркотиками и другими лигандами, имеет решающее значение для расшифровки их разнообразные биологические функции и на предоставление рационального проектирования терапии. Исследование таких структур влечет за собой три отдельных, но тесно связанных компонентов: анализа (для извлечения моделей в форм и взаимодействия), моделирование (для оценки энергетики и молекулярной динамики), и визуализации. Структурный анализ и построение модели по существу две стороны одной монеты, и визуализация дополняет их обоих.

3DNA набор компьютерных программ становится все более популярным структурным инструментарий биоинформатики с возможностями анализировать, строить и визуализировать трехмерные структуры нуклеиновых кислот. Более ранние публикации, изложенные возможностей программного обеспечения ^1, при условии, рецепты для выполнения выбранной задачи ^2, представила веб-интерфейсраспространенному особенности программного обеспечения ^3, представлены базы данных структурных особенностей собраны с помощью 3DNA ^{4, 5} и проиллюстрированы полезности программного обеспечения в области анализа и ДНК, и РНК структуры ^{6, 7.}

Целью данной статьи является приведение 3DNA комплект программного обеспечения для лаборатории ученые и другие с интересами и / или потребности исследовать ДНК и РНК пространственной организации с государством в самых современных вычислительных средств. Протоколы, представленные здесь включают шаг за шагом инструкции (I), чтобы загрузить и установить программное обеспечение на Mac OS X системы, (II-III) для анализа и изменения структуры ДНК на уровне учредительного пар оснований шаги, ( IV-V), чтобы проанализировать и согласовать наборы связанных структур ДНК и (VI) для построения моделей белка оформленные цепей ДНК с удобным интерфейсом веб w3DNA. Программное обеспечение имеет возможность анализировать отдельные структуры решены с помощью рентгеновских методов кристаллографических, а также крупныеансамбли структур определяется с ядерным магнитным резонансом (ЯМР) методы или сгенерированного компьютером-моделирования.

Структур рассматриваемых здесь включают (I) с высоким разрешением кристаллической структуры ДНК связаны с Hbb белка из Borrelia Burgdorferi ⁸ (клещевой бактерия, которая вызывает болезнь Лайма у людей ^{9, 10),} (II) два больших наборов последовательно родственные молекулы ДНК, полученная с молекулярным моделированием ¹¹ - 4500 снимков D (GGCAAAATTTTGCC) ₂ и D (CCGTTTTAAAACGG) ₂ собраны в 100-пс шагом при расчетах, и (III) небольшой ансамбль ЯМР-структур на основе оператора ДНК O3 связан с заставками из кишечной палочки Lac белок-репрессор ^12. Приведенные ниже инструкции включают в себя информацию о том, как получить доступ к файлам атомных координат, связанной с каждой из этих структур, а также как использовать 3DNA (копия Этот файл находитсяна форуме в 3DNA http://forum.x3dna.org/jove ) для проверки и изменения этих структур.

протокол

1. Установка пакета программ

1. Подключение к 3DNA сайте http://x3dna.org и нажмите на ссылку для 3DNA форума. В рамках Форума выберите 'регистрация' и следуйте инструкциям, чтобы создать новую учетную запись.
2. Ниже приводится подробная инструкция по установке программного обеспечения на OS X на основе Macintosh компьютер с оболочкой "баш 'по умолчанию. Порядок Linux или ОС Windows (Cygwin, MinGW / MSYS) систем с часто используемыми оболочек (в том числе "Tcsh ') находится в пределах 3DNA форума.
3. Как только Вы установили имя пользователя и пароль, войдите в Форуме. Выберите ссылку «Скачать» в разделе Добро пожаловать и на новой странице выберите '3 ДНК скачать ». Это приведет вас к 3DNA странице загрузки, где различные версии программного обеспечения могут быть загружены.
4. Выберите Mac OS X Intel ссылку, чтобы загрузить файл сжатый архив (tar.gz), содержащий программное обеспечение.
5. Дважды кликнутьК на (tar.gz) файл, чтобы создать папку с именем x3dna-v2.1. Эта папка, которая содержит 3DNA набор программного обеспечения, могут быть перемещены в любое место. Для этого рецепта, мы перетащить его в папку "Приложения". На этом этапе вы закончите с tar.gz файл и его можно удалить.
6. Откройте приложения терминала обычно находятся в разделе "Утилиты", и перейдите в x3dna v2.1-каталог, созданный на шаге 5 с помощью следующей команды (закончилась здесь, и во всех из приведенных ниже инструкций возврата каретки):
   CD / Applications/x3dna-v2.1
7. Запустите установочный скрипт, необходимый для 3DNA функционировать должным образом, набрав:
   ./bin/x3dna_setup
8. Скопируйте две строки настройки экспорта печатаются на этапе 7. Если пользователь поместил программное обеспечение в каталог "Приложения", две линии должен выглядеть следующим образом:
   экспорт X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
   Экспорт PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH
   Другого слова, кроме "Приложения" будет AppeAR в экспорте команду, если пользователь выбрал для установки программного обеспечения в другой каталог. Это альтернативное имя каталога заменит "Приложения" в этих двух команд. Заметим, что если оболочкой по умолчанию является 'Tcsh' вместо 'баш', содержание двух линий будет: SetEnv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1 и SetEnv путь / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ PATH.
9. Заезд "Finder", чтобы увидеть, если файл с именем ". Bashrc 'уже существует на вашем компьютере.
10. Откройте приложение TextEdit располагается в каталоге "Приложения" и выберите "Сделать Plain Text" в разделе "Формат" меню.
11. Если файл '. Bashrc ходьбы от Шаг 9 существует, откройте файл в TextEdit и вставьте настройки экспорта с шага 8 к концу файла. Если выхода нет ». Bashrc 'файла, вставьте сохраненных настроек Шаг 8 в пустой файл и сохранить с именем файла. Bashrc' в вашем домашнем каталоге. (Домашний каталог обозначается 'дом' значок на Macintosh.)
12. Для того, чтобы новые настройки Bэлектронной доступны, необходимо запустить недавно сохраненный файл 'Bashrc.' с помощью следующей команды в терминале программы:
    Источник ~ /. Bashrc
13. 3DNA пакет теперь установлен на вашей системе и вы можете выполнять в течение 2-5 протоколам терминальной программой. Протокол 6 выполняется с использованием w3DNA, веб-интерфейс для выбранных особенности 3DNA программного обеспечения.

2. Анализ кристаллической структуры

1. Проиллюстрируем анализ нуклеиновой кислоты с использованием структуры ДНК, связанный с белком Hbb от Borrelia Burgdorferi ^8. Файла атомных координат, связанной с этой структурой можно найти на Protein Data Bank ¹³ (PDB; http://www.rcsb.org ), где ему присваивается структурных 2np2 идентификатор. Прилагаемые дополнительные данные включают в себя копию этого файла, которую также можно найти на форуме в 3DNA http://forum.x3dna.org/jove.
2. Первым шагом в 3DNA анализ структуры является создание файла, который перечисляет все спаренных оснований. Это делается с "find_pair 'программу, набрав следующие:
   find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
   Здесь 2np2.pdb является входной файл координат атомов описанных выше, и является 2np2.bps выходного текстового файла, который содержит спаривания оснований информации. Последние пару оснований Файл может быть рассмотрен и редактироваться пользователем при необходимости.
3. Следующий шаг анализа заключается в определении геометрических параметров, характеризующих структуру. Они включают в себя стандартные химические торсионных углов ^14, псевдовращения углы, которые описывают сморщивание сахарного кольца ^15, твердотельное параметры, которые определяют механизмы оснований и последовательных пар оснований ¹⁶ и другие меры трехмерных химической структуры. Команда 'анализ' принимает в качестве входных пар оснований файл, созданный на шаге 2 и создает несколько OUTPUT файлов, которые появляются в настоящее рабочий каталог. Эти значения рассчитываются, введя следующую команду:
   проанализировать 2np2.bps
   Выход файлы, используемые здесь, включают 2np2.out, который содержит обзор расчетных параметров, и bp_step.par, которое содержит список твердого тела параметрами, описанными выше. Последний файл можно легко прочитать в программу электронных таблиц для дальнейшего анализа и построения. См. Представитель Результаты (рис. 1) для примера.

3. Строительство структуру ДНК от твердого тела Параметры

1. В дополнение к анализу нуклеиновых кислот структуры, 3DNA программное обеспечение предоставляет возможность построить структурную модель твердого тела параметров с помощью команды 'восстановления'. В этом протоколе мы покажем, как построить две спирали ДНК моделей, сначала с помощью твердотельного параметров из Hbb-ДНК, рассчитанному в Протоколе 2, а затем с помощью модифицированного набора параметров в WHICH выбранных углов крена не будут изменены. Угол крена измеряет степень изгиба последовательных пар оснований в пазы ДНК ^16. Положительные значения рулон связаны с сужением большой бороздки и отрицательные значения с сужением малой бороздки. Стандартная система отсчета ¹⁷ принятых 3DNA и других популярных программного обеспечения для анализа нуклеиновых кислот, например Curves + ^18, обеспечивает последовательность в численном рассчитанных параметров Уотсона-Крика пар оснований.
2. По умолчанию функция "Перестроить" 3DNA создаст точные атомные модели, которые содержат только координаты атомов в азотистых оснований. Для того чтобы создать приблизительную модель атома, которая включает в себя координаты и от основы и базовые атомов, введите следующую команду:
   x3dna_utils cp_std BDNA
   Эта команда 3DNA ввести стандартную B-конформации остова ДНК в строительстве моделей от твердого тела параметров.
3. Чтобы БуйLD двойной спирали, модель с твердотельным параметры, найденные в Hbb-структуры ДНК, введите следующую команду:
   восстановить атомный bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
   Вот-атомная "определяет строительство все модели атома с атомным координатам для всех тяжелых (не водород) атомов, 'bp_step.par' является файл, созданный на шаге 3 протокола № 2, который содержит введенные твердого тела параметрам , и '2 np2_rbld_org.pdb 'является выходной файл с атомными координатами созданной структуры. Последний файла отформатирован в соответствии со спецификациями PDB и, таким образом завершается. PDB.
4. Файл 'bp_step.par' могут быть отредактированы для создания модифицированной структурой. На Macintosh, изменения могут быть выполнены с помощью приложения TextEdit, как описано в Протоколе 1 Шаг 10.
5. Здесь мы изменим экстремальных углах барабан, образованный на двух участках наибольший изгиб. Ценности, которые выражаются в градусах, меняются к нулю от значения 64,95 на линии 17 и 600,93 в трубопроводе 26. Мы сохраняем измененный файл с новым именем, 'bp_step_roll0.par, и закрыть программу TextEdit.
6. Мы строим структуру, как и в шаге 3, с измененным набором параметров шага в качестве входного файла, введя:
   восстановить атомный bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
7. Эти две модели могут быть просмотрены в стандартных способов молекулярной зрителя, например PyMOL ( www.pymol.org ) с использованием сгенерированного файла координат (. PDB) в качестве входных данных. См. Представитель Результаты (рис. 2) для изображений восстановленного структур.

4. Анализ Multi-модель структуры файлов

1. В отличие от протокола № 2, в котором мы анализируем одного нуклеиновых кислот содержащие структуры, здесь мы покажем, как для анализа большого массива структур. Рассмотрены изменения во времени из твердого тела параметров вдоль серию из 14 пар оснований цепи ДНК, полученных от молекулярной динамики (МД) ¹¹ . Анализ считает 4500 структурам, которые находятся на расстоянии в 100-пс ступени в расчете MD, и сохраняются в отдельных файлах 4500. Прилагаемые дополнительные данные включают в себя копии этих файлов, а также множество других файлов 4500 для моделирования ДНК с обратной последовательности (см. вводный текст для точного порядка оснований). Два набора файлов и меньший набор данных также можно найти на форуме в 3DNA http://forum.x3dna.org/jove .
2. Первым шагом в анализе является таким же, как выполняются в 2 протокола, выявление спаренных оснований, запустив 'find_pair' программы. Так как весь набор структур разделяет те же спаривания оснований схема нужна для запуска 'find_pair' только один раз на репрезентативной файла. Здесь мы выбираем 1001-структуры в моделировании цепей ДНК содержащих центральные На этапе, с именем файла md_AT_set1.pdb.1001. После родов инструкциюTES спаривания оснований информацию и сохраняет ее в файле md_AT_set1.bps:
   find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
   Пользователь может просмотреть идентифицированной базовой кожура и вручную внести изменения в файл на основе знания структуры.
3. Следующим шагом является определение геометрических параметров всей набор структур с помощью "x3dna_ensemble Проанализировать" команды. Эта программа использует в качестве входных пар оснований файл, созданный на шаге 2 (md_AT_set1.bps), а также файл, содержащий список из структур для анализа. Последний файл, называемый здесь md_AT_set1.list, содержится 4500 файлов, которые будут проанализированы, с именами файлов вступил на отдельных линиях в порядке, порожденных МД-моделирования. Копию этого файла включен в дополнительный материал, а также предлагаемых в 3DNA форума. Пользователь должен быть предупрежден, в связи с большим количеством файлов, что вычислительная время может быть длинным (~ 20 мин на 1000 файлов на AMD Phenom II X4 965). Thэлектронной команда выполняется, введя следующие:
   x3dna_ensemble анализировать md_AT_set1.bps-B-L-O md_AT_set1.list md_AT_set1.out
   В приведенном выше примере относится '-B' на пару оснований файл, созданный в шаге 2, '-L' указывает, что список файлов дается, и '-O' позволяет пользователю присвоить имя выходного файла. Есть много вариантов, которые могут быть использованы в сочетании с командой 'x3dna_ensemble анализа, такие как выбор конкретной модели. Пользователь может ввести "x3dna_ensemble проанализировать-H 'для получения более подробной информации об этих параметрах.
4. Следующим шагом является извлечение нужного твердого тела параметрами из файла Обзор выход, md_AT_set1.out, созданного на шаге 3. Это выполняется с помощью команды 'x3dna_ensemble экстракта. Список доступных геометрических параметров можно найти 'x3dna_ensemble экстракт-L' печатать. Здесь мы извлекаем углов крена и создать текст, разделенный запятыми файл (CSV) из углов крена с помощью следующей команды:
   x3dna_ensemble экстракт-Pролл-S,-F-O md_AT_set1.out md_AT_set1_roll.csv
   '-Р-ролл в этой команде указывает параметр, который будет извлечен,'-с, "означает разделенный запятыми файл, '-F' обозначает выходной файл получается из ансамбля проанализировать команду, а '-O 'позволяет пользователю имя файла CSV выход углов крена вдоль ДНК во всех проанализированных структур. Этот файл может быть прочитан в другие программы для дальнейшего анализа и построения. См. Представитель Результаты (рис. 3) для анализа изменения рулон в двух MD-порожденных наборами данных описано выше, и 3DNA Форум для сценария MATLAB используется для создания этих образов.

5. Наложение нескольких модельных структур на общей раме Ссылка

1. Самая последняя версия 3DNA (версия 2.1) имеет новую функцию, которая позволяет пользователю смотреть на несколько структур из общей перспективы. 'X3dna_ensemble переориентировать' команды накладывает коллекцию связанных структурноы на общей пары оснований или пар оснований шаг. Следующий протокол применяется эта возможность ЯМР-производных структур оператора O3 ДНК связан с заставками белка Lac репрессор ^12. Эти структуры хранятся в PDB под идентификатором 2kek в мульти-модель структурного файл, который содержит все структуры модели в одном файле, а не отдельные файлы, такие как те, которые используются для каждой из моделей в 4500 протокола 4. Прилагаемые дополнительные данные включают в себя копию этого файла, которую также можно найти на форуме в 3DNA http://forum.x3dna.org/jove .
2. Как и в предыдущих протоколов, первый шаг состоит в вычислении спаривания оснований ДНК с программой 'find_pair. В этом случае мы используем в качестве входных файлов kek.pdb '2 'и введите следующую команду:
   find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
   Спаривания оснований генерируется с использованием первой модели в PDB файла. Руководство поправки к выводимой BASE-пары файлов, '2 kek.bps ', может быть сделан на основе знания структуры.
3. Программа 'x3dna_ensemble переориентировать "будет согласовывать отдельные модели в мульти-структуры модели на общей системе отсчета. Эта программа требует как PDB файлов и спаривание оснований файл из предыдущего шага в качестве входных данных и управляется с помощью следующей команды:
   x3dna_ensemble переориентировать 2kek.bps-B-F 1-E-O 2kek.pdb 2kek_fr1.pdb
   Здесь ключ '-б' задает спаривание оснований файла '+ 1' обозначает пар оснований, на которых все структуры выровнены, в данном случае пара основание 1 на 5'-конце последовательности, несущей нити, '-E' задает входной файл ансамбль, и '-O' позволяет пользователю ввести имя выходного файла, в данном случае kek_fr1.pdb '2 '. Более подробную информацию о командной строке может быть получен 'x3dna_ensemble переориентироваться-H' печатать. См. Представитель Результаты (рис. 4) для обсуждения выровненных структур.

6. Construие белка оформленные молекулы ДНК

1. Интерфейс веб-w3DNA включает в себя несколько популярных функций 3DNA пакет программного обеспечения. Здесь мы обращаем внимание на возможности для построения трехмерных моделей белок-ДНК оформлен с веб-сервером. Связанных фрагментов ДНК принять твердого тела параметры выбранного белок-ДНК, при этом значения ДНК, связанный с белком Hbb проанализированы протокола 2. Несвязанных участков ДНК может принимать одно из трех выбранных пользователем спиральной формы (A, B или C). A, B и C относятся к трем каноническим моделей ДНК, полученные из ранних экспериментов дифракции волокно, с соответственно 11, 10 и 9 пар оснований на виток двойной спирали ^19-21.
2. Первый шаг в построении белка оформленные модели ДНК, это посетить сайт w3DNA расположен на http://w3dna.rutgers.edu . Выбор «реконструкции» из меню в верхней левой части страницы актизание модель онлайн потенциала возможностей.
3. Следующим шагом является нажмите на ссылку "Связанный белок-ДНК-матрицы 'найдены в слегка затененное окно в середине новой страницы. Этот выбор будет активировать выпадающее меню, которое позволяет пользователю указать количество связанных белков. Здесь мы выбираем два связанных белков и нажмите на кнопку "Продолжить". Следует отметить, что модели ограничены в размерах до 1000 пар оснований, или 2000 нуклеотидов и тридцать связанные белки.
4. Выбор числа связанных белков приводит к странице с техническими характеристиками, аналогичный показанному на рисунке 5. Эта страница позволяет пользователю определять последовательность ДНК, спиральная форма несвязанного ДНК и идентичность и местоположение связанные белки.
5. Пользователь вводит или пасты в нужной последовательности в текстовом поле в середине спецификации (Рис. 5, этикетки 1). Обратите внимание, только стандартные остатки - A, T, C, G и U - не принимаются. Здесь мы входим в 81 пар оснований Homopolymer, полностью состоит из пары · Т с в последовательности, несущие нити.
6. Существует выпадающего меню (рис. 5, этикетки 2), под текстовым полем, чтобы выбрать спиральной конформации несвязанных участков ДНК. В этом примере мы выбираем B-форме конформацию.
7. Существует текстовом поле в нижней части страницы спецификации, чтобы войти в позицию сшивания (ы) и имя файла (ов) связанного белка (ов) (рис. 5, этикетки 3). Положении связывания указывает местоположение центра белком фрагмента на последовательности ДНК. Если связанной ДНК содержит нечетное число пар оснований, как в Hbb-структуры ДНК, связывание позиции обозначает местоположение средней пар оснований фрагмента. В случае Hbb-связанной ДНК, эта средняя пара база T · T mispair. В этом примере, где связывать две копии Hbb белка с ДНК-матрицы, T · T пара находится в положениях 20 и 63 из 81 пар оснований ДНК себепоследовательности. Следует отметить, что последовательность связанного фрагмента не должен совпадать с введенный на шаге 5. Если белком область содержит четное число пар оснований, связывание позиции обозначает местоположение средней пар оснований шагом на ДНК. Таким образом, центральный пар оснований шаг связанного фрагмент помещается между парами оснований п и п +1, где п указанный номер вдоль отрезка. Также отметим, что пользователь может украшать ДНК с любой белок, при условии, что структура его комплекса с ДНК, как известно, и хранятся в стандартном формате PDB ^13.
8. В нижней части спецификации странице есть окно, которое позволяет пользователю создавать предварительный просмотр с белком ДНК (рис. 5, этикетки 4). Здесь мы проверяем, что поле и нажмите кнопку "Продолжить". Это действие генерирует отзыв страницу со списком выбранных параметров, а также любые ошибки, которые могут возникнуть из-за перекрытия выбранных сайтов связывания. Пользователь может SEраскройте его, выберите кнопку "Назад", если любые изменения должны быть сделаны или 'Build', чтобы продолжить.
9. На следующей странице статическое изображение ДНК-белкового комплекса в наиболее расширенном соглашении и позволяет для он-лайн с помощью интерактивной визуализации и Jmol Webmol. Пользователь может также загрузить координаты (. PDB-файл), который отформатирован в соответствии со спецификациями PDB. Это можно сделать, выбрав "Загрузить файл восстановлен PDB 'ссылку ниже создается изображение. Последний файл можно легко прочитать в молекул в графическом виде для дальнейшей визуализации. См. Представитель Результаты (рис. 6) для примеров Hbb оформленные ДНК, описанных выше, и немного длиннее (86 пар оснований) цепь с Hbb центру в положениях 20 и 67.

Результаты

3DNA программных средств, которые обычно используются для анализа структуры нуклеиновых кислот. Например, личность пар оснований и твердого тела параметров, характеризующих механизмы баз в двойной спирали фрагменты ДНК и РНК структур вычисляются автоматически и хранятся для каждой но?...

Обсуждение

Набор протоколов, представленных в этой статье, лишь коснуться возможности 3DNA набор программ. Инструменты могут быть применены к РНК структуры идентифицировать неканонические пары оснований, чтобы определить вторичные структурные контексты, в которых такие спаривание происходит, дл...