Производство дисульфид-стабилизировались трансмембранного пептидные комплексы для структурных исследований

Резюме

Биофизические и биохимические исследования взаимодействий между мембраной вложенных областей белка сталкиваются со многими техническими проблемами, первым из которых является получение соответствующего учебного материала. В этой статье описывается протокол для получения и очистки дисульфида стабилизированного трансмембранного пептидных комплексов, которые подходят для структурного анализа по решению ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и других аналитических приложений.

Аннотация

Физическое взаимодействие между липидов встроенным альфа-спиральных областей мембранные белки играют важную роль в сворачивании и монтаж комплексов мембранных белков и в динамических процессов, таких как трансмембранный (ТМ) сигнализации и регуляции клеточной поверхности белка. Понимание особенностей вождения ассоциации определенных последовательностей требует сложных биофизических и биохимических анализов комплексов ТМ пептидов. Тем не менее, крайние гидрофобность TM области делает их очень трудно манипулировать, используя стандартные методики химии пептидов, и производство из подходящего материала исследования часто оказывается чрезмерно сложной. Определение условий, при которых пептиды могут принять стабильный винтовой конформации и образуют комплексы спонтанно добавляет дополнительный уровень сложности. Здесь мы приводим процедуру для получения гомо-или гетеро-димерных TM пептидные комплексы из материалов, которые выражаются в E. седлоЯ, таким образом позволяя включения стабильных изотопов этикетки для ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или не природные аминокислоты для других приложений относительно недорого. Основным новшеством в этом методе является то, что ТМ комплексы производят и очищают, как ковалентно связаны (дисульфид-сшитого) сборки, которые могут образовывать стабильные, стехиометрические и однородной структуры при восстановлении в моющие средства, липидов или других мембран-миметического материалов. Мы также представляем тщательно оптимизированы процедуры для экспрессии и очистки, что в равной степени применимы ли производство единичных доменов TM или сшитые комплексы и предоставлять рекомендации для адаптации этих методов к новым последовательностям TM.

Введение

Этот протокол подробности процедуры мы разработали для получения дисульфида стабилизировалась комплексов трансмембранных (ТМ) пептиды для структурных исследований с использованием решения ЯМР. Процедура использует надежные выражения предоставляемой ΔtrpLE1413 слияние системы (см. ниже) и позволяет TM пептидных комплексов определенного состава, которые будут созданы с использованием сложных стабильных изотопных методов маркировки для современного многомерного ЯМР экспериментов. Мы использовали эти методы, чтобы определить несколько структур ЯМР, который показал новую важную информацию о том, как лимфоцит-активирующих immunoreceptors собираются из нескольких субъединиц мембранного белка через взаимодействие среди своих TM области (недавно рассмотрели в ^1). Эти методы применимы ко многим другим мембранным белком систем, а также широкий спектр вниз по течению аналитических методов в дополнение к решению ЯМР. Хотя пример, приведенный здесь используется родной остатков цистеинасоздать комплекс, который имитирует естественно дисульфидными связями белка, дизайн одинаково хорошо подходит для создания инженерных дисульфидные связи для стабилизации комплексов, которые обычно удерживаются вместе слабыми, нековалентных взаимодействий, таких как гомо-и гетеро-TM димерных комплексов рецептора эпидермального фактора роста (EGFR)-белков семейства ^2-4 или гетеродимерные αβ интегрина комплексы ^5,6.

Чрезвычайно гидрофобных пептидных последовательностей, таких как полученные из липидного бислоя, охватывающий часть белков TM чрезвычайно трудных предметов для биохимических и биофизических исследований. Кроме того, что очень сложно манипулировать с использованием стандартных белков и методы химии пептидов, они часто весьма токсичны для клеток и, следовательно, трудно производить рекомбинантно. Мы ^7,8 и др. ^9-11 имели значительный успех выражения таких сложных пептидных последовательностей у бактерий, как в рамке карбоксиконцевойслияния с модифицированной версией ΔtrpLE1413 последовательность, полученную из E. оперона кишечной ГТО ^12. ~ 13 кДа trpLE полипептида, кодируемого этой последовательности могут быть произведены на высоком уровне под промотором Т7 и полностью локализованы тельца включения, где проблемы, связанные с токсичностью и / или нестабильности обойти. Модификация последовательности путем добавления аминоконцевой 9-гистидин тегов ¹³ и устранения внутренних метионина и цистеина из trpLE последовательности позволило trpLE ^{14-пептид} слияния должна быть очищена от иона металла аффинной хроматографии и переваривается использованием цианогенбромидом (CNBr ), чтобы освободить желаемого пептидной последовательности. Мы успешно использовали эту систему, чтобы выразить более десятка различных последовательностей, как trpLE слияния представляют мембранные белки, которые содержат фрагменты целых четыре TM областях ^(7,8 и неопубликованные результаты, см. также раздел обсуждения).

Основным новшеством в этом протоколе является определение условий, при которых неструктурированные и очень плохо растворимы trpLE-TM слияния может быть эффективно дисульфида сшитые в контексте рационализации процессов. Некоторые аспекты высокодоходные выражения, обработки и очистки пептидов продукты также были тщательно оптимизированы, и рекомендации, представленные здесь, являются одинаково актуальными для производства не-дисульфид-сшитого (мономерные) продукции ТМ пептидов.

протокол

1. Клонирование и построить Design

Клонирование последовательности интерес в ПММ-пептида вектор (которая может быть предоставлена ​​по запросу) с помощью HindIII и BamHI сайты рестрикции (см. Рисунок 1). Двухцепочечной ДНК-вставки должны включать, в следующем порядке: сайт HindIII; одного кодона метионина для расщепления CNBr; E. палочки кодон-оптимизированный пептида кодирующей последовательности; стоп-кодона; сайт BamHI. Все остальные methionines в пептидной должны быть устранены и дипептид последовательность Asp-Pro следует избегать, поскольку она также будет расщепляться в кислых условиях.

Уникальный остаток цистеина должно быть введено в каждой пептидной последовательности, в зависимости от желаемого расположения дисульфидных сшивания в конечном комплексе, и все другие цистеина должно быть мутировал в серина. Плазмида несет кассету канамицину для выбора.

2. Выражение trpLE-peptiде-Fusion

1. Макияж и стерильный фильтр M9/Kan минимальной среде роста (0,1 мм CaCl _2, 2 мМ MgSO _4, 3 г / л KH ₂ PO _4, 7,5 г / л Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 0,5 г / л NaCl, 1 г / л NH ₄ Cl, 4 г / л глюкозы, 50 мг / л канамицина сульфат). Дополнение с Centrum Полный чтобы обеспечить цинка витаминов и микроэлементов: растворить 1 таблетку в 40 мл H ₂ O при перемешивании в течение 30 мин, центрифугу для удаления нерастворимого материала и стерильного фильтра оранжевый супернатант. Хранить раствор при 4 ° С в темноте в течение 2 недель и использовать 4 мл / л в M9.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ¹⁵ N-обогащенных NH ₄ Cl, ¹³ C-обогащенные глюкозой или других стабильных изотопов-меченых предшественников могут быть включены в среде М9 на данном этапе, если это необходимо.
2. Инокуляции 100 мл закваски из свежего превращается BL21 (DE3) штамма E. палочки в среде M9/Kan. Расти в течение ночи при 37 ° C при встряхивании при 200 оборотов в минуту.
3. На следующее утро, проверьте OD ₆₀₀ из закваски - это должно быть в диапазоне от 2 или больше. Развести 100 мл закваски на 1 л общего объема Centrum-дополнена средой M9. Разделить на две 2 л сбит с толку колбы (500 мл культуры в каждой колбе) и растут при температуре 37 ° C встряхивании при 140 оборотов в минуту до OD ₆₀₀ достигает 0,6.
4. Установите температуру шейкере до 18 ° C и продолжают встряхивании в течение 1 часа, позволяя культурам полностью остыть, прежде чем индукция.
5. Возьмите предварительно индукции образца для SDS-PAGE анализа (эквивалент 50 мкл от культуры в OD ₆₀₀ = 1), а затем добавить IPTG до 0,1 мм конечная концентрация для индукции экспрессии trpLE-пептид слияния. Продолжать расти при температуре 18 ° C/140 оборотов в минуту в течение ночи (16-20 ч) под IPTG индукции.

3. Включение подготовка тела и связывания никеля матрицы

1. Окончательный OD ₆₀₀ овернайт культур выражение в минимальной среде является переменной и шоULD быть между 2,5 и 5,0. Возьмите образец для SDS-PAGE анализа (эквивалент 50 мкл от культуры в OD ₆₀₀ = 1) и сбора клеток путем центрифугирования в течение 20 мин при 5000 х г.
2. Ресуспендируют осадок клеток из 1 л культуры в 50 мл буфера для лизиса (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 20 мМ β-ME, 0,2 М NaCl). Клеточные суспензии можно хранить в замороженном для последующей обработки.
3. Lyse клетки ультразвуком на льду на максимальной мощности в течение 1 мин и отдыха на льду в течение 5 мин. Мы используем Sonicator Misonix 3000 (максимальная мощность 600 Вт) с ½-дюймовой высокой интенсивности сменным наконечником. Повторите ультразвуком / охлаждения в течение трех циклов.
4. Сбор нерастворимые включения тела (IB) материала центрифугированием в течение 15 мин при 20000 х г и отбросить супернатант. Рыхлый, тонкий слой более светлого остатков клеток могут быть видны в верхней части плотных гранул IB, это могут быть смыты водой или буфером с нежным агитации. Шаги 3.3 и 3.4 может быть повторен для улучшения чистоты фракции IB, если Дезикрасный цвет. Образцы осадок и надосадочную жидкость материала должны быть приняты для SDS-PAGE анализа для подтверждения trpLE-TM слияния локализации телец включения.
5. Растворите IB гранул в гуанидина решение (6 M гуанидин HCl, 50 мМ Трис-HCl рН 8,0, 200 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 5 мМ β-ME), используя 25-50 мл на литр культуры обработаны. Этот шаг потребует нескольких часов при перемешивании и иногда мягкий ультразвуком.
6. Снимите IB лизата центрифугированием в течение 1 часа при 75,000-100,000 XG и 20 ° C. Слейте супернатант и фильтр через 0,2 мкм мембрану.
7. Комбинат очищенных лизатов IB, в 50 мл коническую трубку или большего судна, которые могут быть закрыты надежно, с никель смоле, которая была промывают водой и доведены до решения гуанидина. Используйте 3-4 мл поселился смолы на литр культуры обработаны для слияний, которые выражают в такой же степени, как trpLE-DAP12TM показано здесь (рис. 3, дорожка 2). Пакетное связывание путем инкубирования в течение ночи при комнатной т emperature при осторожном перемешивании.

4. В колонке окислительного сшивания

1. Загрузите IB лизат / никель смолы подвеской в ​​пустую колонку самотеком с пористой подложки кровати, добавив, непрерывно, пока весь объем протекающей через. Сбор и отложить в сторону расходе, которые могут по-прежнему содержат белок несвязанного слияния.
2. Вымойте никеля смолы самотеком с 5 объемами слоя раствора мочевины (8 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 200 мМ NaCl), содержащем 5 мМ β-ME.
3. Вымойте никеля смола снова с 5 объемами слоя раствора мочевины без β-ME.
4. Вымойте никеля смолы в третий раз, с 5 объемами слоя раствора мочевины, которая была дополнена 20 мкМ CuSO ₄ и 2 мМ окисленного глутатиона. После этого мыть, закройте выход колонки и инкубировать 30 минут при комнатной температуре, чтобы максимальное образование дисульфидных связей.

5. TFA элюирования и количественного

Содержание "> ВНИМАНИЕ: трифторуксусной кислоты (ТФК) вызывает сильные ожоги при контакте с кожей и паров очень раздражает Концентрированный TFA должны использоваться только в утвержденной химический вытяжной шкаф с защитой для глаз и не латексные перчатки Проверьте химическую совместимость всех.. Материалы, используемые; полипропилена является совместимым со всеми этапами этого протокола.

1. Промыть окислительного раствора мочевины с 10 объемами слоя водой и высушить колонке кровати, применяя вакуумную линию на выходе из колонки.
2. Закройте выход колонки и добавить 1,5 объема слоя чистого (99-100%) TFA. Размешайте смолу никеля с небольшой шпатель для равномерного воздействия кислот и инкубировать в течение 5 мин. Откройте выходе из колонки и собирать кислоты элюата, мягко давления с помощью шприца или сжатого воздуха, если это необходимо, чтобы вытеснить все жидкости.
3. Повторите шаг кислоты элюирования еще 1,5 объемами слоя аккуратным TFA. Работают быстро на этом этапе, чтобы избежать полного растворения beadeг агарозы матрицы. Выход белка может быть определена в этой точке в соответствии с Beer-Lambert уравнения и теоретические молярный коэффициент вымирания trpLE-пептидной последовательности. Развести образца элюата TFA (1:20 до 1:50) в трифторэтанол (ТФЭ) и измеряют поглощение при 280 нм, используя TFA / ТФЭ в то же разведение, как пустой.

6. CNBr пищеварения

ВНИМАНИЕ: цианогенбромидом (CNBr) является чрезвычайно токсичным и должны быть обработаны только в утвержденных химический вытяжной шкаф. СИЗ, включая защитные очки, халат и не латексные перчатки совершенно необходимы. CNBr является реагирует на влагу и должны быть доведены до комнатной температуры перед открытием. Обратитесь к институциональным офис безопасность инструкции по нейтрализации / утилизацию CNBr-загрязненных растворов и материалов.

1. Развести кислоты элюата до 80% конечной концентрации TFA по каплям добавляли воду при перемешивании осторожно. Если образуется осадок,дд назад небольшого объема (0,5 к 1 мл) чистого TFA, пока раствор не разъясняет, а затем вновь правильной до 80% воды. Возьмите 5 мкл предварительно дайджест образцов для SDS-PAGE анализа, замораживание в жидком азоте и лиофилизации образца немедленно.
2. Добавить CNBr кристаллов примерно 0,2 г / мл, заботясь, чтобы взвесить все токсичные химические безопасности в закрытых, предварительно взвешенные трубы или с использованием баланса внутри химический вытяжной шкаф. Аккуратно перемешайте до полного растворения. Промойте и запечатать реактор в атмосфере инертного газа (азота или аргона поток) и инкубировать 3-4 часа при комнатной температуре, в защищенном от света.
3. Возьмите 5 мкл сообщение-дайджест образцов для SDS-PAGE анализа и заморозить и lyophilize немедленно. Передача реакции дайджеста регенерированной целлюлозы кассеты диализа или трубки (ацетат целлюлозы растворяется в концентрированной кислоты) с молекулярной среза весом 3,5 кДа или меньше, в зависимости от размера ожидаемой комплекс пептидов. Диализировать ночи до 4 л воды вхимический вытяжной шкаф для снижения концентрации TFA и разлагаются непрореагировавшего CNBr. Оставьте место в кассете диализа или трубы для значительного увеличения объема (насколько это в два-три раза) в течение ночи диализа.
4. Снимите диализованной решение реакцию со взвешенными осадок из кассеты диализа или трубки (большая часть белка будет выпадать в осадок, когда концентрация TFA уменьшается) и передать подвески до 50 мл конические пробирки. Замораживание и lyophilize, чтобы удалить воду и следы CNBr / TFA. Этот шаг, вероятно, потребуется несколько дней.
   ВНИМАНИЕ: Оба диализованной реакции дайджест и диализ воды должны по-прежнему рассматриваться как токсичные и обрабатываются / утилизировать вместе с соответствующими мерами предосторожности.
5. Образцы культур из предварительно индукции и урожай этапа, включение тела супернатант и осадок, TFA элюата и CNBr-переваривается материал может быть проанализированы SDS-PAGE. Подготовка образцов при нагревании до 95 ° C в Invitrogen NuPAGE LDS SAMPLэлектронной буфера. TFA элюата и дайджест образцы должны быть подготовлены как в сокращении и невосстанавливающих условия для облегчения идентификации продукта и оценки окислительного сшивания.
6. Отделить образцы на 12% NuPAGE бис-трис сборных акриламида гель использованием MES-SDS работает буфера для оптимального разрешения самых маленьких продукты дайджест.

7. Обращенно-фазовой ВЭЖХ очистки дисульфид-сшитого пептидные комплексы

1. Растворить до 100 мг лиофилизированных продуктов дайджеста в 2-3 мл аккуратно муравьиной кислоты и нагрузка на препаративных масштабах (21,2 х 150 мм) Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT колонки в растворителе (как правило, 10-20% ацетонитрил или 5 -10% изопропанола в воде с 0,1% TFA).
2. Элюируйте дайджест продуктов в градиент растворителя В (ацетонитрил или изопропанол с 0,1% TFA) в течение не менее 5 объемов колонки. См. обсуждение на предложения по выбору оптимальных условиях градиента для различных пептидных последовательностей.
3. Принимать50-100 мкл образцов от каждой фракции ВЭЖХ для SDS-PAGE анализа и заморозить и lyophilize немедленно. Удаление растворителей HPLC является быстрым и должна быть завершена в течение 1-2 часов.
4. Подготовка лиофилизированный HPLC образцов для SDS-PAGE при нагревании до 95 ° C в Invitrogen NuPAGE буфера для образцов LDS, не восстановитель. Охладить и разделить каждый образец равномерно на 2 трубы микроцентрифужных, добавив, 100 мМ DTT к одному из них и повторного нагрева кратко.
5. Отделить пониженной и неприведенного ВЭЖХ проб на 12% NuPAGE бис-трис сборных акриламида гель с MES-SDS работает буфера, как указано выше. Маленький, гидрофобные пептиды часто не занимают Кумасси хорошо окрашиваются и не может работать на их ожидаемой молекулярной массой. Тем не менее, сравнение пониженной и не восстановленных образцов должна способствовать идентификации сшитых пептидов продукции и оценка чистоты.
6. Анализ кандидата пептид-содержащих фракций матрица-активированная лазерная десорбция ионизация время пролета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии (см. обсуждение) для идентификации видов, представляющих интерес и подтвердить свою ожидаемую массу.
7. Комбинат, замораживания и lyophilize ВЭЖХ фракции, содержащие чистые, сшитые TM пептидный комплекс и взять сухой вес конечного продукта, чтобы определить доходность. Фракции с высоким содержанием изопропанол не могут оставаться замороженными. Если пептидных фракций высохнуть до фильма, а не пушистым лиофилизированный продукт, повторно распустить фильм полностью в небольшом объеме чистой гексафторизопропанол (HFIP), заморозить и lyophilize снова. HFIP обработанного продукта должна быть небольшой, белый конус, который легко опрокидывается, и взвешивают.

Результаты

Уровень экспрессии достигается при trpLE слияния является переменной и сильно зависит от аминокислотной последовательности пептида прилагается. Рисунке 3 показан SDS-PAGE анализа предварительной индукции (полоса 1) и время-урожая (дорожка 2) образцы культуры, которые дали примерно 1...

Обсуждение

Выражение trpLE-TM слияния. По нашему опыту, trpLE-TM слияния слабо выражены в богатой питательной среде при температуре 37 ° C, и культура условиях, описанных здесь оказались успешными для различных последовательностей, содержащих от одного до четырех TM областях с выходами в пределах от 50 ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Цианогенбромидом	ALDRICH	P.No-C91492, CAS-506-68-3	Опасного вещества. ОПАСНЫХ ГРУЗОВ. Очень токсичен при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании. При контакте с кислотами выделяет очень токсичный газ. Очень токсичен для водных организмов, может вызывать долгосрочные неблагоприятные изменения в водной среде.
Трифторуксусной кислоты	Sigma-Aldrich	P.CODE-1000984387, CAS номер 76-05-1	Опасного вещества. ОПАСНЫХ ГРУЗОВ., Вызывает сильные ожоги. Опасен при вдыхании. Вредно для водных организмов, может вызывать долгосрочные неблагоприятные изменения в водной среде.
2-меркаптоэтанол	Sigma-Aldrich	P.No M7154, CAS номер 60-24-2	Опасного вещества. ОПАСНЫХ ГРУЗОВ. Токсичен при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании. Раздражает кожу. Риск серьезного повреждения глаз. Может вызвать сенсибилизацию путем контакта с кожей. Очень токсичен для водных организмов, может вызывать долгосрочные неблагоприятные изменения в водной среде.
1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол	Sigma-Aldrich	Номер продукта 52512, CAS-No. 920-66-1	Опасного вещества. ОПАСНЫХ ГРУЗОВ. Опасен при вдыхании и при проглатывании. Вызывает ожоги.
Муравьиная кислота	Merck KGaA	K41186564	Горючая жидкость и пар. Вызывает серьезные ожоги кожи и повреждения глаз.
Мочевина	Univar, AJAX FINECHEM	Номер продукта, 817, КАС № 57-13-6	При нагревании декабряomposes до диоксида углерода и аммиака, если сожжены, излучает небольшое количество оксидов азота. Может вызвать покраснение и раздражение кожи и глаз.
Гуанидингидрохлорида	Amresco	P.No-M110, CAS-номер: 50-01-1	Опасно при проглатывании, вызывает серьезное раздражение глаз, вызывает раздражение кожи, острая токсичность Oral, раздражение кожи, раздражение глаз.
TRITON X-100	SIGMA	Номер продукта-T8532 CAS No: 9002-93-1	Тритон Х-100 представляет собой неионный моющих средств, 100% активного вещества, которое часто используется в биохимических приложений для растворения белков. Тритон Х-100 не имеет антимикробные свойства и считается сравнительно мягкий неденатурирующем моющих средств
Его-Select никель-Affinity Гель	Sigma-Aldrich	Каталог Num-P6611	IS-Select никель Affinity Гель иммобилизованными ионами металлов аффинной хроматографии (IMAC) продукта. HIS-Select NickAffinity-эль-гель является собственностью quadridentate хелатных на бисером агарозном взимается с никелем, который предназначен для специфически связываются гистидин содержащие белки.
(-)-Глутатион, окисленные	Sigma-Aldrich	Каталог число 150568
Misonix S-3000 ультразвуком	QSONICA	S-3000 (выпуск прекращен)	Максимальная выходная мощность 600 Вт. 1/2-inch сменным наконечником зонда имеет 1/2-дюймовый высокой интенсивности, большого объема советов и ряда высокой интенсивности, низким уровнем советы. Ближайший моделей в настоящее время от этой компании Q500 и Q700.
RP-HPLC: BioLogic DuoFlow хроматографической системы, программное обеспечение версии 5.3	Bio-Rad Laboratories	Каталог Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705	Пептиды связываются с обращенной фазой столбцов в высоком воднueous подвижной фазы и элюируют с RP колонны высокоэффективной жидкостной хроматографии с высоким содержанием органических подвижной фазы. В RP ВЭЖХ пептидов разделяются в зависимости от их гидрофобный характер. Пептиды могут быть разделены работает линейного градиента органического растворителя.
Подготовка HT C3 ZORBAX 300SB-аналитической ВЭЖХ колонки, 21,2 х 150 мм, 5 мкм размер частиц	Agilent	Продукта: 895150-909	Обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии столбе
NuPAGE 12% Bis-Tris Гели	Life Technologies	NP0341BOX	Предварительно гели, поданных за электрофореза белков
Слайд-A-анализатора G2 диализа Кассеты, 3.5K MWCO	Thermo Scientific	Номер продукта: 87724	Пример диализа