Модели хронического Питательные инфузии у крыс

Резюме

Протокол для хронических инфузии глюкозы и Intralipid у крыс описана. Эта модель может быть использована для изучения влияния на избыток питательных функции органов и физиологических параметров.

Аннотация

Хроническое воздействие чрезмерного уровня питательных веществ постулировано, чтобы повлиять на функции нескольких органов и тканей и вносить свой вклад в развитие многих осложнений, связанных с ожирением и метаболическим синдромом, в том числе диабета типа 2. Для изучения механизмов, посредством которых чрезмерные уровни глюкозы и жирных кислот влияет на панкреатических бета-клеток и секрецию инсулина, мы создали модель хронического питательных инфузии у крыс. Процедура состоит из катетеризации правую яремную вену и левую сонную артерию под наркозом, позволяющий 7-дневный период восстановления; соединительный катетеров к насосам с использованием поворотной и противовеса система, которая позволяет животному свободно перемещаться в клетке, и инфузии глюкоза и / или Интралипид (соевое масло, которое генерирует смеси, содержащей приблизительно 80% unsaturated/20% насыщенных жирных кислот при инфузии с гепарином) в течение 72 часов. Эта модель предлагает несколько выгодноео.э.р., включая возможность тонко модулировать целевые уровни циркулирующего глюкозы и жирных кислот; возможность совместного влить фармакологических соединений, и относительно короткий промежуток времени, в отличие от диетического моделей. Он может быть использован для изучения механизмов питательных индуцированной дисфункции в различных органах и для проверки эффективности лекарственных средств в данном контексте.

Введение

Хронически повышенные уровни глюкозы и липидов в кровотоке было предложено внести свой вклад в патогенез сахарного диабета 2 типа путем изменения функции некоторых органов участвуют в поддержании гомеостаза глюкозы, включая, но не ограничиваясь этим, панкреатических бета-клеток (обзор в ^1). Glucotoxicity гипотеза предполагает, что хроническая гипергликемия усугубляет бета-клеточный дефект, которые привели к гипергликемии, в первую очередь, создавая тем самым порочный круг и способствует ухудшению контроля уровня глюкозы крови в 2 типа больных сахарным диабетом. Кроме того, glucolipotoxicity гипотеза предполагает, что сопутствующее высотах глюкозы и липидов, как это часто наблюдается при диабете 2 типа, являются вредными для бета клетки.

Расшифровка клеточные и молекулярные механизмы вредного воздействия хронически повышенным питательных веществ на панкреатических бета-клеток является ключом к understandiнг патогенезе сахарного диабета 2 типа ^1. В связи с этим, большое количество исследований рассмотрены механизмы хронической питательных избыток естественных бывший в изолированных островков Лангерганса или в пробирке в клональных, секретирующих инсулин клеточных линий. Тем не менее, перевод данные, полученные в этих модельных систем на весь организм является сложной, в частности, из-за концентрации жирных кислот, используемых в культивируемых клетках островков или редко соответствуют уровни циркулирующего в непосредственной близости от бета-клеток в естественных условиях ^2. С другой стороны, механизмы бета-клеток отказ в ответ на питательный избыток были исследованы на моделях грызунов диабета, примером которых диабетическое жирных крыс Zucker ^3,4, песчанки Psammomys оЬезиз ⁵ и высоким содержанием жиров, ФРС мыши ^6. Эти модели, однако, характеризуются внутренней метаболических нарушений и не так легко поддаются манипуляции глюкозы в кровии / или уровней липидов в более контролируемых и менее хроническое обстановке. Для того, чтобы изменить циркулирующие уровни питательных веществ в сроки дней в противном случае нормальных животных, мы разработали модель хронического инфузии у нормальных крыс, что позволяет нам изучить влияние липидов и глюкозы, отдельно или в комбинации, на физиологические параметры и функции ^7,8.

протокол

Обзор: Процедура состоит из катетеризации правую яремную вену и левую сонную артерию под наркозом, позволяющий 7-дневный период восстановления; соединительный катетеров к насосам с использованием поворотной и противовеса система, которая позволяет животному свободно перемещаться в клетке; и инфузии глюкозы и / или Интралипид (соевое масло, которое генерирует смеси, содержащей приблизительно 80% unsaturated/20% насыщенных жирных кислот при инфузии с гепарином ⁹⁾ в течение 72 часов.

1. Canulation в правую яремную вену и левую сонную артерию

1. Стерилизация хирургических инструментов. Canulation трубка должна быть холодной стерилизации с использованием жидкого стерилизующего вещества (2,6% глутарового альдегида) до процедуры. Погрузите трубку в автоклаве контейнер в течение 16-24 часов. Промыть и тщательно промыть стерильной дистиллированной водой, чтобы удалить все следы глутаральдегиде перед использованием.
2. Взвесьте крысы для расчетадозы препарата:
   Carprofen 5 мг / кг: разбавление 1/10 = Масса тела (г) х 0,001 мл SC (анальгетик)
   Glycopyrrolate 0,01 мг / кг: разбавление 1/10 = BW (г) x 0,0012 мл SC (антихолинергические)
3. Обезболить крысы использованием изофлуран и кислорода.
4. Положите крысу на животе. Бритье области за ушами к основанию плеч. Положите крысу на спину. Бритье области под шею, чтобы передние лапы.
5. Prep места хирургической операции хлоргексидин, спирт и йод. Администрирование наркотиков.
6. Передача крысы операционного поля.
7. С помощью асептической техники, canulate правую яремную вену и в левую сонную артерию с ПЭ-50 канюли прикреплен к 1 мл шприц с 5 U гепаринизированной солевой раствор. Промойте канюли с 50 U гепаринизированного физиологического раствора, чтобы избежать свертывания во время восстановительного периода. Используйте притупляются иглы 23G. Закройте все канюли 23G с PIN-кодом.
8. После операции, обрезать примерно 2,5 мм отрезцы нижней и место крыса в инфузии куртку, чтобы предотвратить канюли от поедания.
9. Подать кислород (1 л / мин в течение 10 мин), чтобы помочь эвакуировать изофлурана.
10. Положите крысу в клетку с подогревом, пока она не полностью проснулся.
11. Эксплуатация четырех крыс использовать один за инфузии условие (табл. 1).

2. Послеоперационный уход (пост-хирургического лечения и подключение катетеров)

1. Взвесьте крысы в ​​день 1 и 2-й день после операции.
2. Администрирование гликопирролатом (BW (г) х 0,00048 мл) SC два раза в день 1 после операции и через на 2 день после операции.
3. Дополнительных вспомогательных процедур можно вводить в случае необходимости: жидкости, грелки, влажные диеты, кислородная терапия, анальгетики, антихолинергические средства.
4. На 7 день после операции крыс взвешивают для расчета расхода для инфузии.
5. Подключите каждую крысу инфузионная система помощи троса и поворота установлен на верхней клетке гриль (рис. 1).
6. Промойте канюли с 5 U гепаринизированного физиологического раствора, чтобы удалить сгустки. Промойте канюли еще раз с 50 U гепаринизированного физиологического раствора, чтобы предотвратить свертывание.
7. Разрешить крыс привыкнуть к троса и поворотные течение по крайней мере 24 часов до начала инфузии.

3. Вливание

1. Ничья 0,15 мл крови из сонной каждого гликемии крысы и меры. Промойте яремной канюли. Использование 50 ед гепаринизированной физиологического раствора, чтобы предотвратить свертывание в обоих канюли каждой крысы.
2. Передача образца крови в 0,5 мл пробирку, содержащую 2% ЭДТА. Центрифуга при 10000 оборотов в минуту в течение 2 минут и заморозить плазмы при -20 ° C.
3. Заполните две 60 мл шприцы для каждого из вливание перечисленных ниже условиях. Место Шприц 1 на переднем положении насоса и место Шприц 2 на заднем положении насоса.
4. Регистрация каждой пары решений вместе с Y-разъемы и CO-EX T22 трубки, которые были стерилизованы. Поместите на шприцы Гарвардского 33сдвоенный насос шприца.
5. Измените нижней клетке и удалить все продукты питания из верхнего гриля клетке.
6. Взвесить 150 г стандартным кормом и места на верхнем гриле клетке.
7. Подключите шприцы поворотный на клетке гриль. Промойте шприцы правильно удалить воздух из линий.
8. Вычислить инфузии расхода использованием веса тела, которое было принято перед подключением крысы инфузионной системы. Ставки рассчитываются с файлами Microsoft Excel, которая преобразует скорость инфузии глюкозы (ВМР) в мл / час.
9. Установите насос для управления расходом в течение 60 мл шприцев в соответствии с настройками производителя. Введите значение для Шприц 1 (спереди шприц) и тариф для Шприц 2 (обратно шприц).
10. Запустите насос.

4. Мониторинг

1. После запуска насоса, убедитесь, что нет утечки из поворотных или из канюли и что вливание трубка не перекручены. Также убедитесь, что нет никаких пузырьков воздуха втрубки.
2. Через 3 ч инфузии принимать образец крови для мониторинга гликемии. Повторить через 6, 24, 48 и 72 ч инфузии. В качестве меры предосторожности, гликемия также контролируется через 30, 34, 54 и 60 ч инфузии. Содержание глюкозы в крови можно измерить, используя одну каплю цельной крови с помощью портативного монитора глюкозы. Это ограничивает количество крови, взятой во время инфузии и, следовательно, позволяет избежать значительного изменения объема крови и / или гематокрита.
3. Ставка по 1 шприц модифицируется на основании значений гликемии для поддержания глюкозы в крови 220-250 мг / дл. Ставка по 2 шприца не изменяется в течение 72 ч инфузии потому что свободные жирные кислоты поддерживают на 1 ммоль / л
4. Инфузионные условия являются парными, так что объем полученных для контрольных животных эквивалентен объему полученных для подопытных животных (табл. 1).
5. Через 24 часа после инфузии, изменить нижнюю клетку и взвесить еду оставшихся в клетке гриль. Вернуться несъеденную T частиØ клетку гриль. Повторяйте за 48 часа.
6. Refill шприцы день по мере необходимости в течение 72 ч инфузии.
7. Во время инфузии необходимо соблюдать крысы на наличие признаков воспаления или дискомфорта. Администрирование соответствующей помощи в случае необходимости.

5. После инфузии Эвтаназия

1. Через 72 ч инфузии, крыс анестезировали внутривенно 0,5 мл кетамина / ксилазина коктейль (182 мг / кг кетамина и 11,6 мг / кг ксилазина разводили 1:02 в 0,9% NaCl).
2. Ноги-пинч рефлекса используется для проверки уровня анестезии. Дополнительные анестетик вводят по мере необходимости.
3. Когда крыса находится под наркозом, брюшную полость открывается с хирургическими ножницами. Крысу обескровлены, рисуя 10-15 мл крови в шприц из аорты или полую вену.

Результаты

Из серии из 42 крыс, которым была сделана операция, 5 крыс были потеряны во время послеоперационного периода и 1 крыса была потеряна во время инфузии, представляющих общий уровень успеха 86%. Средний вес тела 37 крыс, которые в конечном счете инфузии была 608 ± 5 г до операции и 588 ± 6 г на начала ?...

Обсуждение

Хотя в ряде предыдущих исследований использовали хронических вливания глюкозы (например, ^10-15) или липиды (например, ^16,17) у грызунов, по нашим данным комбинированной инфузии обоих видов топлива сообщалось только у мышей ^18. Модели хронического инфузия, представ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline 0.9%	BD	JB1324
Dextrose 70%	McKesson
Intralipid 20%	Fresenius Kabi	JB6023
Metricide (Glutaraldehyde 2.6%)	Metrex	11-1401
Heparin Sodium 10,000 USP u/ml	PPC
Carprofen	Metacam
Glycopyrrolate	Sandoz
Isoflurane	Abbott
Chlohexidine 2%
Alcohol 70%
Iodine
PE-50	BD	427411
CO-EX T22	Instech Solomon	BCOEX-T22
Connector 22G	Instech Solomon	SC22/15
Swivel 22G	Instech Solomon	375/22PS
Y-Connector 22G	Instech Solomon
Counterbalance and arm	Instech Solomon	CM375BP
23 G blunted needles	Instech Solomon	LS23
23 G canulation pins	Instech Solomon	SP23/12
Tethers (12 inch)	Lomir	RT12D
Infusion jackets	Lomir	RJ01, RJ02, RJ03, RJ04
(SM-XL)
Tether attachment piece	Lomir	RS T1
60 ml syringe	BD	309653
1 ml syringe	BD	309602