Оценка сенсомоторной функции в модели мыши болезни Паркинсона

Резюме

В заболеваний и расстройств движения Паркинсона, в целом, чувствительных и надежных поведенческих анализов необходимы для тестирования новых потенциал терапии. Здесь мы описываем управляемую батарею тестов сенсомоторными для мышей, чувствительных к различной степени травмы нигростриарного системы и полезной для доклинических исследований.

Аннотация

Чувствительным и надежным поведенческие критерии оценки имеют важное значение для оценки потенциального терапевтического лечения в доклинических испытаний для многих нейродегенеративных заболеваний. При болезни Паркинсона, сенсомоторных проверяет чувствительных к различной степени нигростриатной дисфункции являются фундаментальными для тестирования эффективности потенциал терапии. Надежный и довольно изящный сенсомоторными меры применяются для крыс, однако многие из этих тестов мера сенсомоторной асимметрии в крысу и не совсем подходит для новых генетических моделей мышей БП. Мы собрали ряд тестов сенсомоторными вдохновлен чувствительные тесты на крысах и адаптированы для мышей. Тест батарей выделены этом исследовании выбрана для а) его чувствительность в самых разнообразных моделей мыши PD, б) простоты реализации в исследовании, и в) его низкого расхода. Эти тесты оказались полезными в характеризующего новые генетические модели мыши болезни Паркинсона, а также в испытании горшокдифференциальных иммуномодулирующим терапии.

Введение

Болезнь Паркинсона (БП) является изнурительных нейродегенеративных расстройств первую очередь характеризуется прогрессирующей потерей дофаминергических нейронов в черной субстанции и развитие Леви включения тела в центральной и периферической систем. Пациенты страдают от сенсомоторных нарушений, в том числе брадикинезией, тремор, ригидность и постуральная неустойчивость, ухудшаются с течением времени. Хотя и редко, семейные формы заболевания обнаружены в течение последних 15 лет привели к выявлению важных целей для потенциального романа иммуномодулирующим терапии. Мутации в генах, кодирующих альфа-синуклеина, Паркин, DJ-1, LRRK2 и ATP13A2 среди прочего отметить разработку нового "поколения" животной модели PD, генетические модели мыши.

Отлично, не медикаментозный поведенческие меры применяются для хорошо изученных односторонних 6-гидроксидопамина (6-OHDA) крысы модели БП. Они включают в себя тесты для конечностей использование асимметрии, движениеинициирование, соматосенсорной пренебрежения, достигнув способности, а в последнее время ультразвуковые вокализации ^1-6. Эти тесты чувствительны к различной степени нигростриатной потери нейронов допамина и широко используются для оценки эффективности различных видов терапии потенциал ^7-11. Тем не менее, с генетической модели мыши нет четкого консенсуса относительно наилучшего тесты сенсомоторных использовать или сколько в использовании. Это проблематично, характеризуя новые генетические модели мыши, в доклинических исследованиях, а также при попытке сделать сравнение между моделями. За последние десять лет мы работали, чтобы соединить батарею тестов сенсомоторными для мышей подобный тому, что был успешно использован у крыс. Испытания, описанные в этой статье, были использованы, чтобы помочь характеризуют многочисленные генетические мышиные модели PD и в настоящее время используются в доклинических исследованиях тестирования новых потенциальных терапии ^12.

Наиболее распространенные тесты используютD для оценки двигательной функции у мышей активность в открытом поле и Rotarod испытание координации ^13. Хотя оба эти тесты автоматизированы, относительно просты в использовании и предоставляют информацию о сенсомоторной функции, им часто не хватает чувствительности, необходимого для обнаружения тонких изменений в нигростриарного системы допамина. Например, Паркин дефицитных мышей с тонкими изменениями в функции дофамина не отображают нарушения на Rotarod но сделать дисплей моторных нарушений на сложных тестовом пучке ^14. Кроме того, мыши, получавшие умеренные дозы нейротоксина 1-метил-4-фенил-1 ,2,3,6-тетрагидропиридина (МРТР) не показывают нарушений на Rotarod но имеют значительные изменения в походки и нарушения на инвертированный сетки тесте ^15. Таким образом, исследования, которые используют только для Rotarod фенотипических оценки может пропустить более тонкие нарушения. Оптимальный подход, на наш взгляд, к поведенческим характеристика является тот, который включает в себя баttery тестов, которые чувствительны к различным аспектам сенсорные и моторные функции, и тонкие изменения в базальных ганглиях ^13-15 функцию. Здесь мы опишем, как измерять и анализировать сенсомоторной функции у мышей использованием сложных пучков обхода теста, теста спонтанной активности в цилиндре, и в ответ на сенсорные стимулы теста.

протокол

Оптимально мышей должны быть проверены во время их активной (темный) цикла. Мышей в нашей лаборатории ведутся на обратном цикле свет / темнота, которая позволяет нам удобно проверить мышей во время их активного периода (и наш). Тестирование не запускается, пока по крайней мере, один час в темное цикла. Тем не менее, это не всегда возможно для исследователя поддерживать отдельное помещение мышь с обратным циклом свет. В этом случае, все три испытания могут проводиться в течение светового цикла, но имейте в виду, что время, чтобы пройти на балке, количество шагов и выращивает в цилиндре, и контакт и удаление раз может быть больше, при испытании в течение этого времени.

Все три испытания, описанные ниже, можно выполнить одним экспериментатором, но для тех, кто не такие опытные обработки и работы с мышами или практически не имеют опыта измерения поведения у мышей затем дополнительно экспериментатора могут быть необходимы. В этом случае второй экспериментатор может помочь снелегким испытанием луч мышей путем размещения на балку, а другой экспериментатор записывает судебного разбирательства или в тесте удаления клея второй экспериментатор может запустить таймер в то время как в других местах наклейку на морду и мест мыши в клетке.

1. Оспаривание Луч Процедура обхода

1. Инверсия 3 чистых клетках мыши на столе или в клетку мыши меняющейся станции. Линия клеток до равномерно, так что они могут поддерживать длине балки (1 метр).
2. Соберите четыре секции балки из самых широких в узком сечении и место на вершине перевернутой клетки мыши.
3. Поместите homecage из мышей, которые планируется проверить на своей стороне, и в конце пучка так, что узкий конец балки ведет прямо в homecage.
4. Возьмите первую мышь, основания хвоста и поддержать ее задние конечности с ладони. Наведите в широком конце пучка и отпустить хвост и удалить ваш ХанD.
5. Пусть мыши нюхают и передвигаться, чтобы стать лучше ориентироваться в устройстве-если мышь оборачивается мягко перенаправить его в нужном направлении.
6. Поднимите homecage (даже если она имеет cagemates в нем) держать его в том же положении на боку и приблизить ее к испытанию мыши. В тесте на мышах начинает пробовать и введите homecage переместить его обратно так, что мышь не входит, но делает шаг вперед. Продолжайте делать это все время вниз луч. В конце позволяют мыши, чтобы войти в homecage. Выполните ту же процедуру для каждой мыши в клетке. Это первая "помощь" судебное разбирательство.
7. Пучок должен быть тщательно очищен между клетками с дезинфицирующим предоставляемых ухода за животными или ветеринарного персонала. В клетке важно, чтобы счистить любой мочи или фекальных шариков от луча до следующего мышь запускается, потому что это будет отвлекать следующий мыши.
8. После того как все мыши в клетке прошли через одно испытание помощью затемПодобрать первую мышь снова и поместите его в широком конце пучка. Если необходимо, с вашей рукой осторожно ориентироваться мышь в нужном направлении и слегка коснуться его задней стенке, чтобы поощрять его двигаться по длине балки в свою homecage. Если мышь останавливается, чтобы понюхать или ходить с бревна исправить мыши рукой или забрать его и поместить его на том же разделе, где он ушел. Ваши руки вблизи в руководстве мыши к концу балки. Вы хотите, чтобы попытаться свести к минимуму остановки мыши и изучения в то время как на пучок. Чем больше это делается во время тренировки, тем меньше мышей как правило, делают это во время тестирования.
9. Процесс заканчивается, когда мыши один из своих передних конечностей в homecage. Следующим мышь может затем получить своем ^2-м испытании. Мыши получают в общей сложности 5 испытаний в первый день обучения, чередуя мышей так, что каждая мышь имеет Интервал между ~ 30 сек или больше. Обычно на последних нескольких мышей испытаний будет проходить длинупучком, сами по себе, без необходимости для коррекции.
10. 24 час спустя 2 дня обучения может начаться. На 2-й день мыши получают еще 5 испытаний на той же совокупности пучков, что и в 1-й день. Мыши не требуется какой-либо помощи, но, возможно, придется быть исправлены или коснулся задней для предотвращения остановки или исследовать.
11. 24 часа в сутки позже фактического дневный тест может начаться. При испытании в день, луч устанавливается таким же образом с предыдущим 2 дней обучения. Тем не менее, в настоящее время сетки сетки, которые соответствуют каждой ширине луча находится на верхней части каждого сечения пучка. Видеокамера используется для записи все пучком обхода испытаний и может быть выполнен одним или несколькими экспериментаторами.
12. Этикетка карточку с необходимой информацией эксперимента (дата, мышь #, # суде и т.д.). Разместите эту карту перед камерой и записывать в течение 2-3 сек, так что вполне понятно, каким мыши проходит испытания и что суд он включен.
13. Мышь помещают на верхнюю часть поверхности сетки на самом широком сечении пучка и записаныс движется вдоль луча. Запись должна быть достаточно близко, так что по всей длине тела мыши видна на камере. Если она слишком далеко, то скользит трудно увидеть, и если он находится слишком близко, то движения конечностей могут быть пропущены. Камера должна быть расположена таким образом, что сетка находится в середине зрителя.
14. В день испытания всех мышей получать 5 исследований на сетке покрытия луча.

2. Анализ видео Луч

1. Видео можно просматривать непосредственно с карты памяти или подключении к телевизору или компьютеру, чтобы увеличить экран. Видеоролики должны быть забит экспериментатор слепы к генотипу и лечения состояние в течение эксперимента.
2. Ошибки для каждого испытания оцениваются как видео воспроизводится в замедленном темпе. Промахи и ошибки подсчитываются, когда мышь сторону и двигаться вперед. Проскользнуть или вне сетки считается ошибкой, когда конечности скользит за 0,5 см ниже поверхности сетки (наполовину вниз). Любой скользитсделаны после остановки мыши или ориентирует свою голову в сторону, не считаются ошибками. Если мышь не движется вперед и конечности или конечностей неоднократно проскальзывает через сетку, то это не считается ошибкой. На узкой сечение пучка основанию задних конечностей может быть на верхней части сетки и пальцы висит от стороны, это не считается ошибкой.
3. Шаги также учитываются в замедленном темпе. Задние конечности, лицом к камере используется для отслеживания количества шагов. Отсчет начинается, когда мышь делает свой первый шаг, и заканчивается, когда мыши размещает свои передние конечности в homecage.
4. Время для прохода забил помощью секундомера и осуществляется в режиме реального времени. Таймер запускается, когда мышь начинает двигаться вперед и заканчивается, когда первый переднюю лапу помещается в homecage.

3. Спонтанная активность в цилиндре процедуры

1. Инверсия 3 чистых клетках мыши на столе или в клетку мыши меняющейся станции. Организовать две клетки, расположенному возле электронногоACH другие ~ 18 см друг от друга таким образом, что перед клетки сталкиваются с экспериментатором. Оставшиеся клетки помещается от двух других клетках и будет служить для поддержки зеркала.
2. Поместите кусок стекла на верхней части 2 клетки и установить его так, что стекло при поддержке внешнего края первых 2 клетках.
3. Поместите цилиндр на верхнюю часть стекла и зеркала под углом под стеклом, опираясь на ^3-й клетке в спине. Угол может варьироваться от 30 ° - 45 °, но что еще более важно вид из зеркала должно включать в себя полный диаметр цилиндра.
4. Установите видеокамеру в перед зеркалом и регулировать как зеркала и видеокамеры, пока вы можете просмотреть весь диаметр нижнего цилиндра.
5. Установите таймер на 3 мин и пометить карту с важной детали эксперимента (дата, мышь # и т.д.). Видеозапись этикеткой на 2-3 сек.
6. Наведите в цилиндре и нажмите запись и таймер. ЗаписьOrd мыши в течение трех минут. Важно, что тестирование Район тихий, как громкие звуки и разговор может отвлечь мыши и потенциально привести к замораживанию поведения.
7. В 3 мин использовать ручной счетчик для подсчета количества подъема на задние лапы мыши делают в то время как в цилиндре. Задней определяется как вертикальное движение с обеих передних конечностей от пола таким образом, что мышь стоит только на ее задних конечностей. В конце 3 мин удалить мыши и поместить его обратно в свою homecage.
8. Очистите цилиндр и стекло с дезинфицирующим предоставляемых ухода за животными или ветеринарного персонала. Разрешить очищающий раствор высохнуть перед установкой следующего мыши в цилиндре.

4. Анализ спонтанной активности

1. Видео можно просматривать непосредственно с карты памяти или подключении к телевизору или компьютеру, чтобы увеличить экран. Видеокассеты следует забил экспериментатор слепы к генотипу и лечения состояние в течение эксперимента.
2. Передних конечностей шаги считаются как видео воспроизводится в замедленном темпе. Шаг передних конечностей отсчитывается, когда животное перемещает обе передние конечности последовательно по полу цилиндра в один последовательный движения. Движение передних конечностей не учитывается, если время между движением одной передней конечности и другие лапы больше, чем 5 секунд. Задних конечностей шаги рассчитывали таким же образом, как передних конечностей шагов.
3. Время, потраченное на уход измеряется с помощью секундомера и воспроизведение видео в режиме реального времени. Стрижка боев на морде, вибриссы, и тело измеряются.

5. Устранения клейкой

1. Место мыши в своей homecage в тестировании комнате или в клетке мыши меняющейся станции.
2. Извлеките подающий лоток BIN из клетки и замените крышку клетки. Разрешить мыши / мышь для привыкания к комнате тестирования и клетки без подачи течение 1 часа.
3. Для тестирования используйте чистую клетку, чтобы поместить cagemates так что тест мыши является единственным в homecage.Удалить ~ 3/4 из постельных принадлежностей и поместите его в чистую клетку с cagemates.
4. В homecage шкирку тесте на мышах, чтобы сдержать его и с помощью пары щипцов небольшое место одного наклейку на морду мыши. Аккуратно нажмите на этикетке на рыло с щипцами и отпустите кнопку мыши. Поместите крышку на клетку и начать секундомер. Когда мышь делает попытку удалить ярлык с его передними лапами записывать время. Если мышь вступает в контакт, но не удаляет метку затем сохранить таймер собирается пока этого удалить его и записать это время, а также (и удаление контактов времени).
5. Если мышь не контактирует или удалить наклейку в течение 60 секунд, то суд закончился и наклейка удалены вручную экспериментатором.
6. Положите тест-мышь в чистую клетку и удалите следующий мыши и поместите его в homecage и начать тестирование. Все мыши получали 3 испытания. Важно, чтобы выбрать между мышами, а не делать всех трех испытаний вмыши в одно время. Испытания где метка падает или не является безопасным на рыло, не учитываются.

Результаты

Сложных пучков, спонтанной активности в цилиндре, и клей тесты удаления все очень достоверные тесты сенсомоторных функций у мышей. Мы нашли изменения в сенсомоторной функции с использованием этих испытаний в множественных генетических и токсин мышиных моделях болезни Паркинсона в том числе паркина нокаутом, паркина Q311X, Pitx3-афакия, альфа-синуклеина гиперэкспрессией и односторонний 6-гидроксидопамина мышей ^{14, 16-19}. Здесь мы показываем, данные, полученные от мышей дикого типа сверхэкспрессирующей человеческого альфа-синуклеина под Thy1 промотор (Thy1-асинхронный) и Pitx3-афакией мышей ^18,20. На сложных пучков мы надежно обнаруживать ошибки увеличилась за шагом в Thy1-ASYN сравнению с мышей дикого типа ( Рисунок 1). В том же линию мышей мы также неоднократно обнаружить надежный снижение задних конечностей шагая в цилиндре ( Рисунок 2) ^{12, 16, 21}. В тесте удаления клея Pitx3-афакией мышей с глубоким снижением нигростриарного нейронов допамина показывают значительно увеличилось время, чтобы связаться по сравнению с диким типом управления ( Рисунок 3).

Рисунок 1. Ошибки на сложные в дикого типа (N = 13) и Thy1-ASYN (N = 4) при 4-месячного возраста.) Ошибки на шаг, средний из пяти испытаний. B) Средние ошибки на каждом ширины пучка. Представляет ** р <0,01, соответственно, по сравнению с мышами дикого типа. Стьюдента тест.

Рисунке 2. Задних конечностей активизируют в цилиндре в дикого типа (п = 13) и Thy1-ASYN (п = 4) мышей в возрасте 4 месяцев. * Означает Р <0,05 по сравнению с диким типом. Стьюдента тест.

Рисунок 3. Время контакта в дикого типа (п = 10) и Pitx3-афакия (п = 12) мышам в возрасте 4 недель. Представляет ** р <0,01 по сравнению с диким типом. Mann-Whitney U.

Test Параметры Анализ вариантов

Борьба Луч	Ошибки	Ширины луча (только ошибки) Среднее из 5 испытаний Индивидуальные гонки
	Время
	Шаги
Спонтанной активности	Передних конечностей шаги	Среднее Передняя конечность / задних конечностей побед
	Шаги задних конечностей
	Rears	Среднее
	Стрижка Время	Среднее
Устранения клейкой	Время контакта	Среднее Медиана Лучшие / худшие оценки Время удаления Время контакта Оценка
	Время удаления

Таблица 1. Сенсомоторной функции тест батареи: Параметры анализа.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы показываем, как выполнять и анализировать три полезных тестов сенсомоторной функции у мышей. К ним относятся сложные луч, спонтанной активности в цилиндре, и ответ на сенсорные стимулы (удаления клея). Эти тесты были выбраны по следующим причинам 1) мы и другие обнаружили, что они очень чувствительны к различной степени нигростриатальных дисфункции дофаминергической в генетической модели мыши ^14,16-18, 2) только короткий промежуток подготовки необходим для луча и регулировать для ответа на сенсорные стимулы и тесты После обучения анализы могут быть выполнены в одной тестовой сессии, и 3) цены на оборудование, необходимое для проведения испытаний, является довольно низким по сравнению с покупкой более автоматизированным оборудованием, таким как Rotarod и открытой поля камер.

Нелегким испытанием луч не только полезна в обнаружении характеристики двигателя и координации дефицитов в генетических моделях мыши PD, но полезен и ян выявления нарушений в 1-метил-4-фенил-1 ,2,3,6-тетрагидропиридин-обработанных и 6-гидроксидопамина-обработанных мышей и мышей с дефицитом норадреналина ^{19, 23-25.} Кроме того, мы находим сложный пучок будет меньше зависит от массы тела по сравнению с другими тестами производительности двигателя и координация (Rotarod и полюс тест). Это особенно полезно при работе с взрослых самцах мышей, которые могут весить до 50 грамм +. Подобно лучу, изменения в спонтанной активности надежно наблюдается в Паркин нокаутом, PQ311X, Thy1-ASYN, Pitx3-афакии и LRRK2 мышей ^{14, 16-18, 26.} ИСПЫТАНИЕ удаления также чувствительна к генетической манипуляции, включая Паркин нокаутом, Паркин Q311X, Thy1-ASYN и DJ-1 нокаутом мутаций у мышей ^{14,16, 17, 22.} В односторонних 6-гидроксидопамина обработанных мышей клей тест удаление выполняется аналогично тому, как это обычно делается с крысами ^1,2. Клей этикетка наклеена на каждой передней лапе использованиемщипцов и время, чтобы удалить метку записана. Мы обнаружили, что 6-hyrdoxydopamine-обработанных мышей будет удалить ярлык с непораженной конечности до удаления этикетки на пораженной конечности ^19.

Этот тест батареи можно легко реализовать в исследованиях с использованием старения лечения хронических заболеваний, но это также легко использовать в фармакологических исследованиях. Как только животные обучены и готовы для тестирования испытательной станции для каждого анализа можно настроить. Затем животных работать в том же порядке по каждому тесту. Препарат интереса можно вводить один раз и желаемой концентрации препарата пик достигается каждой мыши могут быть проверены на балке, а затем перемещается в цилиндре в течение трех минут, а затем на клей тест удаления. Мы нашли эту стратегию, чтобы хорошо работать при тестировании различных агонистов дофамина в ^{18 мышей, 21.} Оба луча и клей испытаний удаление поддаются повторное тестирование, однако спонтанной активности в цилиндре зависит от повторных Testiнг что приводит к снижению активности на протяжении времени ^16. В зависимости от того, насколько надежной является дефицит в мыши вы можете все еще ​​быть в состоянии обнаружить различия с повторным тестированием в цилиндре ^16. В общем, привыкание и снижение активности наблюдается, как только вторая воздействия цилиндров однако, мы находим, что мы можем получить достаточного уровня активности, когда мы бежим спонтанной проверки активности, сразу после прохождения пучка в фармакологических исследованиях ^18,21. Число спонтанных сессий тестирования деятельности включить в исследование будет зависеть от линии мышей (некоторые, безусловно, более активны, чем другие) и продолжительности лечения. В нашем фармакологических исследований на мышах по смешанной C57BL / 6 X DBA фон измеряли активность между 2-4 раза и тестирование сессии были разделены одной недели ^21.

Луч и цилиндр тесты требуют пост-тестирование анализ videorecorded поведения. Для этого аспекта анализаОсобенно важно, чтобы рейтинговые агентства, которые являются слепыми к условиям эксперимента. Когда мы обучаем новых рейтинговых агентств в лаборатории у нас есть поведение человека Оценка на видеокассетах ранее проанализированных эксперт оценщик из лаборатории. Критерии будут объяснены и показаны на новый оценщик, а затем человек начинает забивать ранее проанализированных ленты на свои собственные. Счет стал по сравнению с рейтингами эксперт. Человек не имеет права для голосовать новых данных, пока они не находятся в пределах 95-98% точности эксперт. Все данные затем случайно спот-проверяются на точность эксперт оценщик.

Тестов описаны в данном исследовании предназначен для оценки сенсомоторных функций у мышей. Однако, когда характеризующих модель нового мыши заболевания всегда важно сделать основной рассмотрении животного, а также. Масса тела и температуры должны быть проверены в ходе тестирования и любые ненормальное поведение, следует отметить, как и удаление вибрисс или CLasping задних конечностей при поднятии за хвост. Основные неврологические оценки описаны в других местах подробно ^27-29.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Challenging beam apparatus	Starks Plastics	Segment 1= 3.5 cm Segment 2= 2.5 cm Segment 3= 1.5 cm Segment 4= 0.5 cm	Contact information: 11276 Sebring Dr. Forest Park ,OH 45240 USA Ph +1 (513) 541-4591 Fax +1 (513) 541-6773
Cylinder	Starks Plastics	15.5 cm diameter 12.7 cm height	Contact information: 11276 Sebring Dr. Forest Park ,OH 45240 USA Ph +1 (513) 541-4591 Fax +1 (513) 541-6773
Mesh Grid Wiring	Ace Hardware	1 cm2
Mouse Cages	Ancare	19 x 29 x 12.7 cm
Glass	Ace Hardware	19 cm2
Mirror	Ace Hardware	18 x 13 cm
Camcorder	Sony HDR-HC9
MiniDV Tapes	Sony DVC premium	90 min long play
Labels	AveryColor Coding Labels	6.35 mm diameter (1/4" Round)