Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Резюме

Простой способ описан для индукции эпителиальных к мезенхимальных перехода (EMT) в различных типах клеток. Методы анализа клеток в штатах ЕМТ по иммуноцитохимии включены.

Аннотация

Эпителиальный в мезенхимальных перехода (EMT) является жизненно необходимым для формообразования во время развития. Misregulation этого процесса была вовлечена как ключевое событие в фиброза и прогрессировании рака на метастатической стадии. Понимание процессов, лежащих в основе EMT важно для ранней диагностики и клинической контроля этих болезненных состояний. Расписание индукция ЕМТ в пробирке является полезным инструментом для открытия новых лекарств, а также для выявления общих подписей экспрессии генов для диагностических целей. Здесь показано, простой способ индукции ЕМТ в различных типах клеток. Методы анализа клеток до и индукционных после ЕМТ по иммуноцитохимии также включены. Кроме того, мы демонстрируем эффективность этого метода через основе антител анализа массива и миграция / вторжения анализов.

Введение

Эпителиальный в мезенхимальных перехода (EMT) является процесс, при котором поляризованная эпителиальных клеток претерпевает различные изменения, связанные в очень подвижных, фибробласту мезенхимальных клетки. Этот процесс происходит, в частности, путем внесения изменений экспрессии генов и деградации слипчивых соединений, что приводит к увеличению способности к миграции и вторгнуться. Физиологически, ЕМТ играет важную роль во время эмбрионального развития и заживления ран. Потеря должного контроля за EMT может привести к фиброза и метастазирование карциномы ^1,2.

Снижение Е-кадгерина на поверхности эпителиальных клеток является важным шагом в прогрессии клетки через ЕМТ ^3,4. Е-кадгерин является однопроходный трансмембранный белок, который непосредственно взаимодействует с кадгеринов белков на соседние ячейки. В дополнение к своей роли в клеточной адгезии, Е-кадгерин влияния клеток сигнализации через взаимодействий между цитоплазматическим хвостом E-кадгерина апда разнообразие регуляторных белков, в частности β-катенин. β-катенин играет роль в стабилизации слипчивых соединений. Во время канонической передачи сигналов Wnt, β-катенин освобождается от Е-кадгерина и перемещаться в ядро, где он выступает в качестве нижнего транскрипционного фактора в пути ^3,4,5 Wnt. В ядре β-катенин как было показано, увеличивают транскрипцию нескольких ЕМТ, связанных с факторами, включая кручение, Slug, фибронектин, и разнообразие матричных металлопротеаз ^3,6.

В дополнение к Wnts, TGF-β сигнализации было показано, играют важную роль в индукции ЕМТ как во время нормального развития и в пораженных государств ^7,8,9. TGF-β участвует в EMT, которая происходит во время формирования неба и в развивающемся сердце ^10. Он также участвует в фиброза и в прогрессии рака в метастазирования ^7.

Процедура, описанная здесь прovides соответствует индукция ЕМТ в различных типах клеток без необходимости генетических манипуляций. Эта процедура использует коктейль из Е-кадгерина, SFRP-1, и Dkk-1 блокирующие антитела и Wnt-5a и TGF-β1 рекомбинантные белки. Этот коктейль предназначен для блокировки E-кадгерина на основе адгезии при одновременном повышении Wnt и TGF-β сигнализации. Возможность для надежной индукции EMT имеет решающее значение для понимания биологии этого процесса и как манипулировать его в терапевтических целях. Текущие общие маркеры EMT, Е-кадгерин (подавляется в EMT) и Виментин (активируется в EMT), можно найти совместное выражается в раковых и таким образом не обеспечивают лучшие диагностические маркеры потенциальных метастатических клеток ^12. Важно отметить, что анализ различных типов клеток, которые подверглись EMT полезно разработать общие подписей экспрессии генов, которые могут быть использованы для диагностических целей в рака и фиброза ^11. Кроме того, недавние исследования показали, что EMT может играть определенную роль в формировании раковых стволовых клеток, предполагая, что клетки, которые подверглись EMT могут быть полезны для скрининга лекарственных средств для идентификации соединений, которые могут ориентироваться эти клетки ^13.

протокол

1. Индукция EMT

1. Теплый культуральные среды до 37 ° С на водяной бане. Культура СМИ используется такая же, как в средствах массовой информации, используемых для стандартной культурой ваших клеток, представляющих интерес. Например, карцинома легких клетки A549 человеческой линии выращивают в F12 Кайна с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина.
2. Урожай клеток интересных, использующими решение диссоциации (например TrypLE Express).
3. Приостановить клеток в подогретого культуральной среды в 15 мл коническую трубку.
4. Центрифуга клеточной суспензии при 400 х г в течение 5 мин.
5. Осторожно удалите супернатант путем заливки в контейнер для отходов.
6. Приостановить осадок клеток в подогретого культуральной среды.
7. Всего жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего. Удалить образец клеточной суспензии и разбавить в 0,4%-ном растворе трипанового синего. Поместите 10 мкл разведенного образца на гемоцитометре и считать жизнеспособных клеток (клеток, которые не синеет). Используйте количество клеток для определения клеток дensity в решении.
8. Пластинчатые клеток на культуре ткани обрабатывали пластин или колбы в 0,9-1,0 х 10 ⁴ клеток на см ^2. Например, 0,5 х 10 ⁶ клеток высевали в 100-мм пластины в культуральной среде, содержащей 1X EMT средства создани Supplement (6 мл среды на 100 мм пластины).
9. Культура покрытием клеток в 37 ° C / 5% СО ₂ инкубатора. Daily Monitor морфологии клеток.
10. Три дня после посева, удалить материал и замените свежим подогретого культуральной среде, содержащей 1X ЕМТ Склонение Медиа Дополнение. Продолжайте культуры в 37 ° C / 5% СО ₂ инкубатора.
11. Через пять дней после посева, клетки готовы для анализа. Морфология клеток визуализируется перевернутой световой микроскопии.

2. Анализ экспрессии белка по иммуноцитохимии

1. Подготовка стерильные 12 мм покровные для 24-луночного планшета путем размещения покровные в чашку Петри, содержащую 95% этанола. Аккуратно удалите покровные из этанола насING иглу и изогнутых щипцов и пламени стерилизовать. Наведите стерильную покровное в одну лунку 24-луночного планшета. Повторить с оставшимися покровные.
2. Подготовьте клеточной суспензии, как описано в разделе 1.1 - 1.7.
3. Пластинчатые 1,6 х 10 ⁴ клеток / лунку в 0,5 мл подогретого культура СМИ содержащий 1X ЕМТ Склонение Медиа Дополнение.
4. Расти и кормить клетки, как описано в разделах 1.9 - 1.11.
5. Через пять дней после посева, удалить носитель и зафиксировать клетки с 300 мкл / лунку 4% параформальдегида в 1X фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 20 мин при комнатной температуре.
6. Удалить фиксатор и промыть клетки 2x с 1X PBS, 500 мкл / лунку.
7. Инкубируйте клетки в 400 мкл / лунку блокирующего буфера (1X PBS, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 10% нормальной сыворотки осла, и 0,3% Triton X-100) в течение 1 часа при комнатной температуре.
8. Инкубировать в первичных антител у производителей рекомендованной концентрации в 400 мкл / лунку блокирующего буфера в течение 3 ч при комнатной темпере или в течение ночи при 4 ° С. При использовании первичных антител непосредственно конъюгированный с флуорохромом, нагрев образцов в темноте.
9. Вымойте клеток трижды в 500 мкл / лунку 1X PBS, содержащего 0,1% BSA в течение 5 мин каждый мытья. При использовании первичных антител непосредственно конъюгированный с флуорохромом, переходите к шагу 2,12.
10. Инкубируйте клетки в вторичными антителами при рекомендованной производителем концентрации в 400 мкл / лунку 1X PBS, содержащем 1% BSA в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
11. Вымойте клеток трижды в 500 мкл / лунку 1X PBS, содержащего 0,1% BSA в течение 5 мин каждый мытья.
12. При желании, контрастирующая ядра с раствором DAPI.
13. Промойте клетки в деионизированной воде и смонтировать покровные лицом вниз на слайде с помощью монтажных СМИ.

Результаты

. Индуцирующие EMT условия культивирования, описанные здесь, обеспечивают надежный метод для индукции ЕМТ в различных типах клеток рисунках 1 и 2 демонстрируют морфологию и уровни экспрессии маркера 4 различных клеточных линий человека: клетки глиобластомы T98G, НТ29 аденокарциномы толстой кишки клеток , карциномы легких A549 клетки и MCF10A эпителиальные клетки молочной железы. Клетки, которые были обработаны с приложением EMT средства создани изменен с классической эпителиальной морфологии (Фигуры 1A - 1D) в мезенхимальных, веретенообразной морфологии (фиг. 1E - 1H). EMT-индуцированные клетки появились менее плотно упакованные в плотные колонии по сравнению с неиндуцированных клеток. Образцы неиндуцированных MCF10A содержится плотно упакованные кластеры, окруженные более свободно упакованных клеток. Эти плотно упакованные кластеры были Е-кадгерин положительным (рис. 2D) и исчез после обработки с EMT средств индукции допВЫРАЖЕНИЕ (рис. 2H).

ЕМТ также оценивали подавлением эпителиальных маркеров и усилением активности мезенхимальных маркеров. Подавление экспрессии Е-кадгерина обычно наблюдается после индукции ЕМТ в различных типах клеток ^3,4 Рисунок 2 демонстрирует поверхностную экспрессию Е-кадгерина в большинстве необработанных клеток (Фигуры 2A - 2D, красный). В сравнении с его отсутствие после ЕМТ индукции (рис. 2E - 2H, красный). Один клеточная линия, T98G, было установлено, что крайне низкий исходный уровень Е-кадгерина до индукции EMT, который исключало ее анализ. Положительная регуляция мезенхимной маркера, фибронектин, был также видны после индукции с Дополнением ЕМТ Склонение СМИ (2А - 2D по сравнению с рис 2Е - 2H, зеленый).

Уровни экспрессии Е-кадгерина и фибронектин видели иммуноцитохимиибыли также подтвердил через вестерн-блоттинга от общего объема клеточных лизатов (рис. 3). Вестерн-блот подтвердил снижение экспрессии Е-кадгерина и усилением активности фибронектина выражения видно по иммуноцитохимии. Полосы определяли с использованием денситометрии и нормированы на GAPDH определить относительное изменение кратное следующий индукции ЕМТ. Уровни E-кадгерином сократились на 6,4 и в 3,4 раза в А549 и MCF10A клеток, соответственно. Уровни Фибронектин были увеличены 4,6, 4,1 и 2,3 раза в T98G, А549, и MCF10A клетки, соответственно. Несмотря на то, вестерн-блот не показывает значительное снижение уровней белка Е-кадгерина в клетки НТ29 после индукции EMT, результаты показывают, иммуноцитохимия уменьшение поверхностной экспрессии Е-кадгерина (рис. 2В в сравнении с 2F), который не может отличить в Вестерн-блоттинг всех клеточных лизатов.

Для дальнейшей оценки состояния ЕМТ, дополнительное известный маркерс для EMT были проанализированы заранее и индукции после ЕМТ. В соответствии с предыдущими результатами, Е-кадгерин был подавляется во всех исследованных клеточных линий, что указывает на EMT индуцировали. Кроме того, мезенхимальные маркеры, Виментин и улитки, были позитивно регулируется в А549, T98G и MCF10A клеток после обработки EMT средства создани дополнительная (рис. 4). Линия клеток НТ29 не показали экспрессию этих мезенхимальных маркеров с или без индукции ЕМТ (данные не показаны), которые могут указывать, что эти клетки использовать альтернативные пути индукции ЕМТ.

Хотя TGF-β является достаточным, чтобы вызвать EMT в определенной ячейке контекстов ^7,8,9, другие типы клеток не реагируют исключительно добавлением TGF-β ^14. MCF7 раковые клетки молочной железы человека и PANC-1 клетки поджелудочной железы карциномы человека оба сообщили, что не реагировать на TGF-β сигнализации в покое ^14. Чтобы определить, может ли обе линии пройти EMT в ВИТРО, клетки культивировали в присутствии дополнения EMT средства создани. Клетки стимулировали с рекомбинантным только TGF-β1, при концентрации в Приложении EMT средства создани. Эти клетки сохранили свою эпителиальную морфологию, состоящий из плотно упакованных колоний клеток (данные не показаны) и поверхностных уровней Е-кадгерин были подобны тем, которые наблюдаются в контрольных клетках (фиг. 5C и 5D против фиг.5А и 5В). В противоположность этому, клетки, стимулированные дополнения EMT средства создани показали резкое уменьшение поверхностных уровней Е-кадгерин (цифры 5E и 5F). Эти клетки также получают более мезенхимальных морфологию, а клетки становились менее компактной и более шпиндель, как (данные не показаны). Эти результаты показывают, что индуцирующий EMT Описанный здесь метод может способствовать морфологии EMT и изменения экспрессии маркеров в клетках, как правило, устойчивые к TGF-β-Induced ЕМТ.

В дополнение к изменениям в экспрессии маркеров, другой отличительной чертой мезенхимальных клеток является их способность мигрировать и вторгнуться. Миграция и инвазия клеток, культивируемых с или без дополнения ЕМТ Склонение СМИ были проанализированы с помощью 96 а BME Вторжение сотовый анализа в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце, клетки высевали на 96-луночные планшеты (50000 клеток / лунку), содержащий фильтрующие вставки с 8,0 мкм поры. Через 48 ч миграция оценивали по кальцеина AM окрашивание клеток, которые мигрировали через фильтр. Каждый образец был испытан в трех экземплярах дважды с аналогичными результатами. Типичные результаты одного эксперимента показаны на фиг.6А. Статистически значимое увеличение (Р-значение <0,003) в миграции клеток были замечены как с А549 и PANC-1 клеток после индукции ЕМТ. Чтобы оценить способность этих клеток к вторжению (т.е. мигрируют через внеклеточного матрикса), тот же анализ былвыполнены с базальной мембраны экстракта покрытием фильтра. ЕМТ-индуцированной клетки показали статистически значимое (Р-значение <0,001) увеличение возможностей вторжения сравнению с необработанными клетками, как показано на фиг.6В.

Прочная индукция EMT полезен для анализа изменений экспрессии генов и сигнализации, происходящих в этих клетках. На основе антител анализ массива с помощью лизаты оба обработанных и необработанных клеток является одним из методов для анализа уровней экспрессии различных молекул в одном образце. В качестве примера, мы проанализировали уровни фосфорилированных членов семьи МАРК в лизатов из не-индуцированной и EMT-индуцированной MCF7 и А549, используя массив Kit Протеом Profiler человека Phospho-МАРК. Массив проводили дважды из независимых EMT-индукционных процедур с аналогичными результатами. Фиг.7 показаны репрезентативные данные из одного массива. Оба типа клеток выставлены увеличение фосфорилирования CREB (S133), ERK1 (T2 02/Y204) и ERK2 (T185/Y187) в EMT-индуцированных клеток по сравнению с контролем. Различия в сигнальных событий наблюдались между двумя типами клеток, а также. А549 показали увеличение GSK-3 β (S9) фосфорилирования, в то время как MCF7 клетки показали увеличился p70S6K (T421/S424) фосфорилирования.

Рисунок 1. Мезенхимальные морфология индукции после стимуляции дополнения EMT средства создани (А - Д). Эпителиальной морфологии в четырех типах клеток показали следующее культуру в течение 5 дней в стандартной культуральной среде без дополнения EMT средства создани (E - H). Мезенхимальные морфология в четыре типа клеток указано культивировали с Дополнении ЕМТ Склонение СМИ в течение 5 дней.

нт "FO: держать-together.within-странице =" всегда ">
Рисунок 2. Подавление эпителиальной экспрессии маркеров и усилением активности мезенхимальных экспрессии маркеров в EMT-индуцированных клеток. Клетки окрашивали с помощью иммунофлуоресценции для определения экспрессии эпителиального маркера, E-кадгерина (красный), и мезенхимальные маркер, Фибронектин (зеленый). ( - D) Контрольные клетки, культивируемые без дополнения ЕМТ Склонение СМИ в течение 5 дней (E -. H) клеток, культивированных с дополнения ЕМТ Склонение СМИ в течение 5 дней. Все клетки контрастно с DAPI (синий).

Рисунок 3. Подтверждение эпителиальной и мезенхимальных экспрессии маркеров с Вестерн-блот ап . alysis Вестерн-блот всех клеточных лизатов четырех типов клеток указано, обрабатывают (EMT) или без (-) Дополнения ЕМТ Склонение СМИ в течение 5 дней. Полосы для Е-кадгерина, фибронектин, и контроля ГАФДГ загрузки являются, как указано слева. Размер маркера, как указано на рисунке справа.

Рисунок 4. Upregulation из мезенхимальных маркеров, виментин и Улитка в EMT-индуцированных клеток. Клетки окрашивали по многоцветной иммунофлюоресценции для выявления экспрессии эпителиального маркера, Е-кадгерин (серый), и мезенхимальные маркеры, Виментин (зеленый) и Улитка (красный) Контрольные клетки, культивируемые, без дополнения EMT Склонение Медиа на 5 дней. - (С). (D - F) Клетки культивировали с дополнения EMT Склонение Медиа на 5 дней.

сегда ">
Рисунок 5. Индукция ЕМТ в TGF-β1 не отвечающих клеток. (А и В) Клетки культивировали с одних средах течение 5 дней. (C и D)-клеток, культивируемых в среде, содержащей 10 нг / мл TGF-β1 течение 5 дней. (E и е) клеток, культивируемых в EMT средства создани дополнения течение 5 дней. Все клетки окрашиваются на E-кадгерина выражения (красный) и контрастно с DAPI (синий).

Рисунок 6. EMT-индуцированной клетки увеличились миграции и вторжения мощностей. А. Среднее число клеток, которые мигрировали через поры фильтра 8 мкм после инкубации в течение 48 часов. Б. Среднее числоклетки, которые были в состоянии вторгнуться через поры фильтра 8 мкм, покрытой с экстрактом базальной мембраны после инкубации в течение 48 часов. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение по три лунки.

Рисунок 7. Антитела основе массива анализ экспрессии индукции ЕМТ. Лизаты А549 (А и С) и MCF7 (Б и Г) клетки, культивируемые с или без ЕМТ Склонение Медиа дополнения были использованы для анализа массива, используя массив Kit Протеом Profiler человека Phospho-МАРК. Пятна выделены А и В были тогда количественно с помощью денситометрии. Сравнения не-индуцированных к ЕМТ-индуцированных лизатов приведены в соответствующих гистограмм ниже (C и D). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок </>.

Обсуждение

Предыдущие методы индукции ЕМТ, как правило, используется TGF-β стимуляции или генетической модификации. Хотя один TGF-β, как было показано, чтобы вызвать EMT в некоторых типах клеток, в настоящее время было показано, что TGF-β является необходимым для ЕМТ, но это не является достаточным во всех типах клеток ^6,14. Использование генетической модификации для индукции ЕМТ занимает много времени и трудоемким. Описанный здесь метод использует комбинацию факторов, включая, анти-Е-кадгерина человека, против человеческого SFRP-1, антитела против человеческого Dkk-1, рекомбинантный человеческий Wnt-5a и рекомбинантного человеческого TGF-β1, чтобы надежно индуцировать EMT. Такое сочетание факторов предназначен для блокировки E-кадгерина на основе адгезии имеет решающее значение для индукции EMT ^4, и повышения Wnt сигнализации, добавив белок Wnt-5a, а также использовать блокирующие антитела к ингибиторам Wnt, SFRP-1 и Dkk -1. Wnt и TGF-β сигнализации, как было показано действовать аутокринным петли, чтобы вызвать и поддерживать мезенхимальных клеток стате ^6. Этот метод индукции позволяет избежать генетических манипуляций и является более эффективным, чем использование в одиночку TGF-β. Важно отметить, что мы в состоянии наблюдать индукцию ЕМТ в типах клеток, в том числе MCF7 и PANC-1 клеток, которые были ранее показанного не отвечать исключительно для TGF-β стимуляции (рис. 5) ^14.

Клетки, обработанные с ЕМТ Склонение Медиа Дополнение шоу менее компактный и увеличился веретенообразный морфологии (рис. 1). Кроме того, есть уменьшение поверхностного E-кадгерина экспрессии пересекаются с увеличением экспрессии фибронектина, которые являются отличительными признаками ЕМТ (фиг.2 и 3). Дополнительные маркеры мезенхимальных такие как виментин и Улитка также активируется в ЕМТ индуцированных клеток, как по сравнению с неиндуцированных управления (рис. 4). Увеличение миграции и вторжения способности являются основными функциональные характеристики мезенхимальных клеток. В в пробирке Миграция и вторжения анализы, клетки, обработанные дополнения ЕМТ Склонение СМИ продемонстрировали значительно повышенную способность к миграции и вторгнуться (рис. 6).

Этот простой метод для индукции ЕМТ полезно для изучения сигнализации EMT, как показано, используя данные выражения массива антитела, показанные на рисунке 7. Различные типы клеток можно сравнить до и после индукции ЕМТ, чтобы получить общие подписей экспрессии, связанные с ЕМТ, такие как увеличение фосфорилированного CREB и ERK1 / 2, видимый на обеих MCF7 и А549 ЕМТ-индуцированной клеток. S133 фосфорилирование CREB из стимулирует ДНК-связывающие и было показано, действуют на выходе TGF-β1-индуцированную EMT ^15. ERK1 / 2 фосфорилирование Также было показано действовать ниже по потоку от TGF-β1-индуцированную EMT ^16. Различия в сигнальные пути между типами клеток также можно пояснить, как видно с увеличением ГСК-3β фосфорилирования в клетках А549 против p70S6К фосфорилирования в MCF7. ГСК-3β фосфорилирования в серин 9 уменьшается его функции, и GSK-3β было показано, ингибируют фактор транскрипции про-EMT, Улитка ^17. В противоположность этому, p70S6K индуцирует активность улитки и его фосфорилирование связано с активацией этого белка ^18.

В целом, простым и надежным индукция EMT, особенно в клетках ранее показанных не отвечать исключительно для TGF-β, полезно для понимания биологии EMT, выявления общих подписей экспрессии для использования в качестве прогностических маркеров, и разработки и оценки новые терапии для рака и фиброз.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Epithelial cells of interest			We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1
EMT Inducing Media Supplement	R&D Systems	CCM017
Recombinant Human TGF-β1	R&D Systems	240-B	Used at 10ng/ml
Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody	R&D Systems	NL648R	Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry
Anti-E-Cadherin	R&D Systems	MAB1838	Used at 0.1 μg/ml for western blotting
Anti-Fibronectin	R&D Systems	MAB1918	Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting
Anti-GAPDH	R&D Systems	AF5718	Used at 0.2 μg/ml for western blotting
Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody	R&D Systems	NL009	Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry
Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody	R&D Systems	HAF109	Used at 1:2000 for western blotting
Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody	R&D Systems	HAF007	Used at 1:2000 for western blotting
EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit	R&D Systems	SC026	Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.
96 Well BME Cell Invasion Assay	R&D Systems	3455-096-K	This kit was used according to the manufacturer's recommendations.
Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit	R&D Systems	ARY002B	This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.
Mounting Media	R&D Systems	CTS011
0.4% Trypan Blue Solution	Life Technologies	15350-061
1X Phosphate Buffered Saline (PBS)
95% Ethanol
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3311
Normal Donkey Serum	Jackson Labs	017-000-121
Triton-X-100	Roche Molecular Biochemicals	789-704	Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.
DAPI Solution	Sigma	D9542	Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.
Fine pointed curved forceps	Thermo-Fisher Scientific	08-875
12 mm coverslips	Carolina Biological	633009
Nonfat dry milk			Used at 5% in TBST for blocking in western blotting
TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]			For western blotting blocking and washing
PVDF Membrane			For western blotting
4-20% SDS-page gel			For western blotting
ECL substrate			For western blotting
15 ml conical tubes
Plates/flasks, tissue culture treated
24-well plates, tissue culture treated
Pipettes / pipette tips
Pipet Aid / pipets
Hemocytometer
37 °C Water Bath
37 °C/5%CO2 Incubator
Centrifuge
Inverted light microscope
Fluorescence microscope