Контекстная и подают реплики Страх принадлежности Тест Использование видео параметры системы у мышей

Резюме

Данная статья представляет собой протокол для контекстной и подают реплики страха теста кондиционирования с использованием системы видео для анализа и оценки страх обучения и памяти у мышей.

Аннотация

Тест контекстная и подают реплики страх кондиционирования является одним из поведенческих тестов, что оценивает способность мышей к обучению и запомнить ассоциацию между сигналами окружающей среды и отвращение опыта. В этом тесте мышей помещают в испытательной камере и даны обрезки условного раздражителя (слуховые CUE) и отталкивающее безусловного раздражителя (электрический Footshock). Через некоторое время задержки, мыши подвергаются той же камере кондиционирования и различной формы камеры с презентации слуховой кия. Замораживание поведение во время испытания измеряют как показатель страха памяти. Для анализа поведения автоматически, мы разработали систему анализирующей видео с помощью программы прикладного программного обеспечения ImageFZ, который доступен для бесплатной загрузки на http://www.mouse-phenotype.org/. Здесь, чтобы показать детали нашего протокола, мы демонстрируем нашу процедуру контекстной и подают реплики тест кондиционирования страх у мышей C57BL/6J помощью ImageFZ систэм. Кроме того, мы проверили наш протокол и производительность системы видео анализ, сравнивая замерзания время, измеренное системой ImageFZ или измерительной системы компьютера photobeam основе с тем, что забил человека-наблюдателя. Как показано в наших представительных результатов, полученные ImageFZ данные были аналогичны тем, анализировали с помощью человека-наблюдателя, указывая, что поведенческий анализ с использованием системы ImageFZ обладает высокой надежностью. Настоящий фильм статье приводится подробная информация о процедурах тестирования и будет способствовать пониманию экспериментальной ситуации.

Введение

Тест контекстная и подают реплики страх кондиционирования является поведенческая парадигма используется для оценки ассоциативный страх обучения и памяти у грызунов ^1-3. Этот тест широко используется, чтобы понять нейробиологические механизмы страха обучения и памяти в трансгенных и мышей с ^1,4-16. Замораживание поведение, которое определяется как полной неподвижности, за исключением дыхания, является общим ответом на страшных ситуациях. В этом поведенческой парадигмы, после животные подвергаются спаривания слуховой кия с электрическим Footshock, они реагируют на страх производящих стимула, отображая Замирание, которая измеряется как показатель ассоциативного обучения страха и памяти. Этот тест требует меньше сложную технику, меньше физических нагрузок следователем и гораздо меньше времени обучения для мышей по сравнению с другими обучения и памяти задач, это как правило, требует примерно 5-10 мин / день на мышь в течение 2 дней. Хотя процедура тестирования сиmple и требует мало времени для выполнения, исследователь должен внимательно наблюдать и измерять поведение мыши, поэтому несколько автоматизированные измерительные системы были разработаны для проведения поведенческого анализа ^17-20. Наша система видео-анализ, который мы разработали с программой ImageFZ программного обеспечения, позволяет легко анализировать поведение замерзания и производят очень надежные результаты. Эта статья содержит подробную информацию на нашем процедуры тестирования и описывает, как использовать программу ImageFZ программного обеспечения.

протокол

Все эксперименты должны быть выполнены в соответствии с руководством и протоколов, установленном местными комитетами уходу и использованию животных.

1. Аппарат Настройка

1. Устройство для испытания на кондиционирования и контекстного представляет собой квадрат камера с electrifiable решетчатым полом, источником звука, и калиброванный генератор шок. Различные размеры камеры используются, с размерами колеблется от 54 см х 27 см х 30 см ²¹ до 25 см х 35 см х 30 см ^22. В этом протоколе, при этом устройство состоит из акрилового квадратного камеры (33 см х 25 см х 28 см; прозрачной в передней и задней стенками; белый в боковых стенках) с металлическими сетками (0,2 см диаметр, расположенных 0,5 см друг от друга), покрытый прозрачной акриловой крышкой (рис. 1А). Необходимо поместить камеру на белой акриловой этаже (рис. 1В) для анализа поведения черных, агути, или разбавить коричневых мышей, потому что анализ образ системы с IПрограмма mageFZ программное обеспечение (доступна для свободного скачивания, см. Таблицу материалов / реагентов) отличает темного объекта из белом фоне в каждого захваченного видеоизображения. Белых мышей также могут быть проверены с помощью черных металлических сеток и черную акриловую пол (рис. 1В). Светодиод (LED) подсветка прикреплены к над установкой потолка. Сетка этаж горит при 100 лк на светодиодные фонари. Динамик подключен к белым шумом / тон-генератор (рис. 1в) монтируется на потолке 5 см выше крышки представить слуховой кий (белый шум, 55 дБ) в качестве условного раздражителя (CS). Сетки подключены к ударной генератора (рис. 1в), чтобы доставить электрический Footshock как безусловного раздражителя (США). Испытательная камера помещается в звуконепроницаемой комнате (170 см х 210 см х 200 см) (рис. 1D), чтобы минимизировать внешние шумы во время испытаний. Это условие также предотвращает мышей, которые в настоящее время не подвергаетсяпроверить от слуха слуховой кий или вокализации испытаний мышей.
2. Устройство для испытания подают реплики состоит из камеры, имеющей различные свойства от испытательной камере, что обеспечивает новый контекст. Крайне важно, чтобы изменить сенсорные сигналы, насколько это возможно, так что мышь воспринимает новый контекст как будучи связаны с испытательной камере. Как правило, различной формы коробка или треугольная камера используется. Кроме того, различные осветительные и / или обонятельные сигналы также предоставляются мыши. В этом протоколе, устройство представляет собой акриловый треугольной камера (33 см х 29 см х 32 см, белые в каждой боковой стенке) с плоской, белый пол для черных, агути, или разбавить коричневых мышей или плоской, черный пол для альбиноса мыши, покрыта прозрачным акриловым крышкой (рис. 1E). Света СИД прикреплены к вышеуказанному устройству потолка. Уровень освещенности полу установлен на 30 лк. Динамик установлен на потолке 5 см выше крышки, чтобы PRESENT слуховой кий, которая является такой же, как при условии мышам в момент воздуха. Треугольная камера расположена в другом звуконепроницаемой комнате от помещения, в котором выполняются кондиционирования и испытания контекст.
3. Каждая камера оснащена потолочный прибор с зарядовой связью (ПЗС) камеры, подключаемые к компьютеру Windows, с помощью четырех сплиттер видео и USB захвата изображения устройства, чтобы отслеживать поведение мышки, а также образов аппарата и мыши захвачены и проанализированы программное обеспечение программа ImageFZ (см. Протокол № 6). Белый шум и Footshock генераторы автоматически контролируется программой ImageFZ программного обеспечения; время начала и продолжительность белого шума и Footshock должны быть написаны в текстовый файл (см. пример текстовый файл 'просто-конд', показанный в видео для Подробности того, как параметры записываются в файл), который прочитал в приложение.
4. Перед каждым испытанием начинается акриловый стенкии полы протирают полотенцем, смоченным в супер хлорноватистой воды (рН 6-7), и сетки убираются с 70% этанола, чтобы предотвратить смещение на основе обонятельных сигналов. Решетки протирают этанолом вместо воды супер хлорноватистой чтобы гарантировать, что сетки не уменьшить их электропроводность за счет ржавчины.

2. Подготовка животных

1. Как правило, 3:58 мыши расположены на клетку в контролируемой температурой выдержки комнате (23 ± 2 ° С) при 12-часовом цикле свет / темнота (например, свет включали в 7:00 утра).
2. В этом протоколе, чтобы уменьшить возможные влияния клетке транспортировки на поведение и адаптировать мышей в экспериментальной среде, сепараторы, содержащие мышей передаются от комнате для задержанных животных в звуконепроницаемой комнате ожидания, прилегающей к звуконепроницаемой комнату тестирования не менее 30 мин до начала каждого испытания.
3. Все эксперименты (рис. 2а) должны быть выполнены в течение сAme период времени в светлой или темной фазы каждый день, чтобы свести к минимуму поведенческие изменения полученных в результате испытаний в разное время ^23,24. В этом протоколе, все эксперименты проводятся в период с 1 часа после начала легкой фазы и 1 ч до наступления темной фазы (с 8:00 до 6:00 вечера в легкой фазе). Если только один аппарат доступен, мыши из каждого генотипа должны быть проверены в уравновешенной, чтобы уменьшить возможные последствия экспериментальной времени и тестирования порядка предметам по поведенческой производительности. ImageFZ может управлять максимум 4 аппаратов. Тестирование 4 мышей одновременно с помощью 4 аппаратов в уравновешенной того позволяет исследователю сэкономить время и уменьшает возможные последствия экспериментальных параметров на поведение мыши.

3. Кондиционирование

1. Мышей помещают в испытательной камере, и мыши, как правило, может свободно исследовать камеру для 120 с. После этого а.е.ditory кий, такие как белый шум, тон, и слуховой зазывала, представлен как CS в течение 30 сек, и мА Footshock 0,1-0,8 уделяется мышей как США в течение последних 2 сек звука. Презентация CS-американского кожура повторяется укрепить ассоциацию. Мышей оставили в камере для отрезка времени после последнего представления в дальнейшем установить связь между контексте камеры и отвращение опыт. В этом протоколе после 120 сек свободного разведки, слуховой сигнал (белый шум, 55 дБ) представлена ​​в течение 30 сек, и Footshock 0,3 мА подается непрерывно в течение последних 2 сек белого шума. После 90 секунд, спаривание слуховой кия с Footshock уделяется субъектов снова. Презентация CS-US повторяется три раза за сессию (120, 240 и 360 сек после начала кондиционирования) (рис. 2В). После заключительного Footshock мышей выдерживают в покое в камерах в течение 90 сек.
2. Перед началом кондиционирования сессия, запустите программу ImageFZ прикладного программного обеспечения, выберите плагин меню "ФЗ Кондиционер и ФЗ Online (4 камеры) ', и установить значения параметров шаг за шагом, как следует.
   1. Шаг 1: Номер проекта. Укажите папку, где вы хотите хранить свои файлы данных.
   2. Шаг 2: Имя сеанса. Введите любые слова, например, экспериментальной даты, в поле "сессии" и выберите эталонный текстовый файл, в котором время начала и продолжительность белого шума и Footshock написаны, в поле "Ссылка". Текстовый файл образец показано на видео.
   3. Шаг 3: Настройка параметров. Введите значения параметров в каждой коробке следующим образом.
      1. Тариф (кадр / сек): частота кадров получения изображения, например, 1 кадр / сек.
      2. Продолжительность (сек): в случае кондиционирования, общая продолжительность составляет 480 сек.
      3. Бен продолжительность (сек): например, 60 сек; данные анализируются в каждом блоке60 сек.
      4. Тема размер - мин (пиксели): ImageFZ обнаруживает мышь и шума, как черных частиц (некоторые массовых пикселей) в белом фоне в каждом изображении. Когда площадь черной частицы (пикселей) меньше, чем 'Subject размере - за минуту (пикселей)' значение (например, 100 пикселей), частицы рассматриваются как шум и исключены из анализа изображений.
      5. Тема размер - макс (пиксели): когда размеры черных частиц более размера 'Subject размера - макс (пикселей)' значение, частицы исключены из анализа.
      6. Размер рамы - ширина / высота (см): камера измерение, т.е. широкий 33 см и высотой 25 см.
      7. Замораживание критерий (пикселей): например, 30 пикселей, см. подробности в Протоколе 6.
      8. Продолжительность Замораживание - мин (сек): например, 2 сек, а когда нет движения мыши не обнаружено лишь менее 2 сек, то его поведение не считается "замораживание";.
      9. Скорость удара (кадров / с): см. подробности в Протоколе 6.
   4. Шаг 4: Тема ID. Введите идентификацию предмета.
   5. Шаг 5: Настройки камеры. Регулирует яркость и контрастность снимка.
   6. Шаг 6: Установка порогов. Отрегулируйте пороговые значения для обнаружения черную мышь в виде черных точек в белом фоне в каждом изображении и судить поведение мыши как «замораживание» или «незамерзающей» (см. подробности в Протоколе 6). Для анализа альбиноса мыши, нажмите на флажок "инвертный режиме ', а также настроить пороговые значения соответствующим образом.
   7. Шаг 7: Набор Кейдж поле. Укажите поле каждой камеры, которую вы хотите захватить. После нажатия на кнопку прямоугольник в панели инструментов, нарисуйте прямоугольник вокруг полу камеры в окне живого изображения. Далее, выберите номер камеры и нажмите кнопку "Установить". Наконец, нажмите кнопку "Завершить".
<литий> После настройки параметров установлены, подготовительный тест следует уделять помощью практики мышей (мышей, не используемые в качестве предметов) до первого испытания дня, чтобы определить, является ли работать система анализа изображений и белый шум / ударные генераторы без проблем.
3. Перемещение дома клетку, содержащую практические мышей в звуконепроницаемой комнату тестирования с соседней комнате ожидания, и поместить каждую мышь в испытательной камере. Сразу после размещения мышей в камере, нажмите кнопку запуска из ImageFZ. Прикладное программное обеспечение представит слуховые сигналы и / или электрические footshocks мышам в порядке, который указан в справочной файла.
4. После 480 секунд прошло, вернуться мышей в родную клетку и вернуть клетку к полке в комнате для задержанных.
5. Тщательно очистите камер. Затем нажмите кнопку "Далее анализ», и повторите шаги 3.2.4-3.6 для тестируемых мышах.
6. ImageFZ магазины жить и проследить изображения в формате TIFF. Программа позволяетнам выполнить автономную анализ повторно проанализировать изображения с использованием модифицированных значений параметров. Если вы провести автономный анализ, выбрать плагин меню 'Страх Кондиционер и ФЗ в автономном режиме "и выберите папку данных, который необходимо повторно проанализировать. После ввода значения параметров снова, и нажмите кнопку "Завершить".

4. Контекст Тест

1. После кондиционирования сеанс был завершен, мыши возвращаются в той же камере кондиционирования и оценивают поведение замораживания измерить контекстуально условный страх (тестовый контекст). Интервал задержки между кондиционирования и испытания контекстного был обычно устанавливается в 24 часов. В этом протоколе, оценить недавнее память и удаленной памяти (измеряется с помощью теста 1 день и более 28 дней после кондиционирования, соответственно) ^25, мышей подвергают испытанию контекстного приблизительно 24 ч и 30 дней после кондиционирования сессии. Мышей помещали в кондitioning камеру, и им разрешается свободно исследовать камеру за 300 сек без CS и США презентаций (рис. 2в).
2. Запустите программу ImageFZ программного обеспечения и установить значения параметров прикладного программного обеспечения в том же порядке, что и в кондиционировании (см. раздел 3.2.3), однако, изменить время продолжительности этого теста до 300 сек и выберите текстовый файл справки теста контекстного . После изменения настройки, подготовительный тест следует уделять помощью практики мышей, чтобы проверить систему ImageFZ.
3. Место каждого мышь в испытательной камере и нажмите кнопку запуска. После 300 сек истекло, вернуть мышей в клетках, где их и покинуть эту клетку в покое, пока не начнется подают реплики тест.
4. Очистите камеры. Затем нажмите кнопку "Далее анализ», и повторите шаги 4.3-4.4 в тестируемых мышах.

5. Cued Тест

1. Cued тест проводится в тот же день теста контекстного или на следующий день.В этом тесте мышей помещают в другой испытательной камере с очень разными свойствами, обеспечивая новый контекст, который не имеет отношения к испытательной камере в течение 3 мин. В конце первой 3 мин, слуховой сигнал, который представлен в момент кондиционирования отдается мышей в течение 3 мин в нового контекста среды. В этом протоколе подают реплики тест выполняется несколько часов после испытания контекста. Мышей позволили исследовать треугольную камеру на 360 сек. В первом 3 мин, ни CS ни США представлены, и после этого, CS (дБ белый шум 55) представлен в последний 3 мин.
2. Запустите программу ImageFZ программного обеспечения и установите значения параметров, так же, как и в системах кондиционирования, кроме изменения времени продолжительность испытания до 360 сек и выберите текстовый файл справки в лузу теста. После корректировки настроек, подготовительный тест следует уделять помощью практики мышей, чтобы проверить систему ImageFZ.
3. Место каждого мышь в треугольной камеры и нажмите стартКнопка. После 360 секунд прошло, вернуться мышей в родную клетку и вернуть клетку к шельфе комнате для задержанных.
4. Очистите камеры. Затем нажмите кнопку "Далее анализ» и повторите шаги 5.3-5.4 в тестируемых мышах.
5. Для дальнейшей проверки удаленной памяти, повторите Протоколы 4-5 примерно через 30 дней после кондиционирования сессии (рис. 2А).

6. Анализ изображений

1. Выполните сбора и анализа данных автоматически с помощью ImageFZ. Эта программа программное обеспечение базируется на программе, являющейся общественным достоянием ImageJ (разработанной Уэйн Расбанд на Национальных Институтов Здоровья и доступны на http://rsb.info.nih.gov/ij/), модифицированного Tsuyoshi Миякава (ImageFZ прикладного программного обеспечения , доступна для свободного скачивания, см. Таблицу материалов / реагентов).
2. Для всех экспериментов, захват изображений при данной частоте кадров (например, 1 кадров в секунду) с ImageFZ с помощью устройства USB видеозахвата, в том числевидеокамера. Для измерения расстояния, пройденного от последовательных изображений, отрегулируйте значение "пороговых Минь программы (например, 80 пикселей), который установлен на сегменте изображений в черную частицы (мыши) и белом фоне. Пройденное расстояние вычисляется из расстояния между каждым набором ху координаты центра тяжести частицы в последовательных изображений.
3. Для измерения Замирание от последовательных изображений, то следует изменить «порог мин (XOR) 'стоимость программы (например, 160 пикселей), который установлен на сегменте изображений в черную частицы (мыши) и фона, а затем рассчитать количество области (пикселей) непересекающихся областей между частиц каждой пары последовательных изображений. Установите значение с помощью ползунка порогового инструмента, пока черный частиц в каждом изображении не совпадает с формой всего тела мыши учета хвоста. Если площадь nonoverlaPping область ниже значения 'критерий замораживание "(например, 30 пикселей), поведение считается" замораживание "(рис. 3), которая обычно определяется как полное отсутствие какого-либо движения для дыхания и сердцебиения, кроме. Когда площадь превышает это значение, поведение считается «не замораживание" (рис. 3). Решение должно быть принято на основании определения замораживания. Мыши иногда проявляют тонкие движения и мгновенное неподвижность, которые не могут быть рассмотрены в качестве замерзания поведения, которая отражает страх. Неподвижность, которая длится в течение короткого времени (например, менее 2 сек), что, вероятно отличается от проявления страха, могут быть исключены из анализа, установив порог времени замерзания. Чтобы установить пороговое время, ввод 'продолжительность Замораживание - мин (сек)' значение (например, 2 сек).
4. Программа ImageFZ автоматически CalculТочные пройденное расстояние (см) и процент замерзания. Результаты сохраняются в текстовых файлах, а жить и проследить изображения сохраняются в формате TIFF. Для измерения пройденного расстояния (см) в качестве показателя электрической чувствительности Footshock, программа ImageFZ также получает изображения с высокой частотой кадров (например, 4 кадров в секунду) в течение 6 сек, не измеряется от 2 сек до поставки 2 сек Footshock до 2 сек после Footshock во время онлайн-анализа. Чтобы установить частоту кадров для захвата изображения до, во время и после Footshock, введите значение в "Оценить Шок (кадр / сек) 'поле. После онлайн-анализа, выполнять автономный анализ, выбрав плагин меню 'ФЗ Shock в автономном режиме ", чтобы получить данные для расстояния, пройденного.
5. Значения параметров программы ImageFZ должны быть оптимизированы для получения результатов, аналогичных получен наблюдателями в подготовительных тестов. Для ручной скоринга, морозильная поведение постоянно измеряется с помощью Stopwatcч и программа событий записи или мгновенно процедура времени выборки каждый 3-10 сек, во время анализа с использованием ImageFZ программного обеспечения. Два наблюдателя обычно проводят наблюдения за поведением. Для регулировки значения параметров программы ImageFZ для того, чтобы результаты анализа изображения соответствует той, человеческих наблюдателей, выполнить автономную анализ программы ImageFZ, изменив 'пороговое мин (XOR)' и ценности "критерий замораживания ' . Для выполнения автономного анализа, выбора плагина меню 'ФЗ Оффлайн "и введите любые значения параметров.

7. Поиск неисправностей

1. Как программа ImageFZ можно получить и установить?
   Программа ImageFZ доступен для свободного скачивания с нашего сайта (см. Таблицу материалов / реагентов), и работает на компьютере Windows. Скачать папку почтовый для ImageFZ и установить программное обеспечение на вашем компьютере. См. файл 'readme.txt' для УСТАНОВКАна деталях и следуйте шаг за шагом инструкции.
2. Почему отображается сообщение об ошибке "Ошибка установки устройства захвата»?
   Проверьте подключение кабеля камеры и установку драйвера устройства захвата USB изображения. Если нет никаких проблем с настройками, то программное обеспечение ImageFZ может не работать с устройством захвата изображения. См. файл 'readme.txt' относительно соответствующее устройство для использования с ImageFZ программного обеспечения.
3. ImageFZ не может обнаружить все тело мыши как частица.
   Установите значение "порога мин" и / или "порог мин (XOR) 'ниже текущей стоимости. Если ImageFZ не может обнаружить мышь в определенном месте, например на углу испытательной камере, то недостаточные условия тестирования, такие как равномерно освещенной полу или слегка контрастной разницы между мышью и фоном, может существовать. Чтобы решить эту проблему, установите значения параметров (например, яркость и контрастность передаваемого изображения и пороговых значений) ImageFZ, контролировать количество и расположение огней, или использовать белый фон для черной мыши.
4. Захват изображения при высокой частоте кадров замедляет работу компьютера во время онлайн-анализа.
   Установите частоту кадров до значения ниже, чем по текущему курсу, а также выполнять оперативный анализ. Анализ ImageFZ, путем приобретения изображений на 1 кадр, достаточно для точного измерения замораживание, как показано на результаты раздела представительства.
5. Результаты анализа ImageFZ не согласен с теми, человеческого скоринга.
   Изучите сохраненное изображение и суд файлы результатов. Если ImageFZ переоценивает замораживания, установить 'замораживание критерий' на значение ниже, чем текущее значение, а также выполнять автономный анализ. Если ImageFZ недооценивает замораживание, установить 'замораживание критерий' на значение выше, чем текущее значение.
6. В optogenetical и в естественных условиях электрофизиологических еxperiments, оптический кабель прилагается к голове мыши вмешивается в решение от замерзания.
   Пальто кабели в белый для черной мыши, и изменить положение и угол камеры, пока кабели не выявляются.
7. Что необходимо для автономного анализа?
   Создайте папку с именем 'Image_FZ' в корневом каталоге программы ImageFZ. В этой папке создать вложенные папки "Images 'и' заседаний. Переместить 8 бит серо-белое изображение в папку "Images ', и создать текстовый файл, в котором имя файла изображения записывается в папке' Sessions '. После этого запустить автономный анализ ImageFZ и следуйте инструкциям программы.

Результаты

В тесте на страх кондиционирования, человека экспериментаторы использовали для количественной оценки замерзания поведение с помощью трудоемкого непосредственного наблюдения ^26-29, но в последнее время photobeam основе измерений компьютер (например, "Заморозка монитор" система) и изображений анализаторы были использованы для автоматического измерить замерзания поведение ^26,30-32. ImageFZ представляет собой автоматизированную систему изображений анализ, который дает результаты, сопоставимые с данными, полученными из человеческих наблюдений, как описано ниже. Здесь мы сравнили результаты наблюдения человеком с тех анализа ImageFZ при различных параметрах: 'Тариф (кадр / сек) »и« Замораживание критерий (пикселей).' В этом эксперименте, пять самцов мышей C57BL/6J (средний вес тела ± стандартное отклонение (г), 31,4 ± 3,55, средний размер тела ± SD (пикселей), 351,6 ± 62,2) были использованы на 15-27 недельного возраста. Человеком наблюдение было сделано с помощью программы событий записи (программа, Macintosh Mac OS 9); ключевым прессования событие, которое по-прежнемуг на 2 сек или более, когда мышь отображается приступ не движения считался 'замораживание'. Процент замораживания была рассчитана каждые 60 сек в каждом тесте и используется для корреляционного анализа. Процент замораживание забитый 2 наблюдателей (надежности оценки, для кондиционирования, R = 0,879; для контекста теста, R = 0,957; для теста подают реплики, г = 0,866, для всех случаев, г = 0,888) было усреднено для генерации человека забить. Корреляция между процентными замораживания, измеряемого в ImageFZ с каждым частотой кадров (т.е. 1, 2, и 4 кадров в секунду) и данными, полученными из человеческих наблюдений были рассмотрены. Как показано на рисунке 4, проценты замораживания рассчитанные через ImageFZ (1, 2, и 4 кадров в секунду) были тесно связаны со средним значением, полученным из измерений 2 наблюдателей. Примечательно, что съемки изображений с более высокой частотой кадров не всегда дает наилучшее соотношение. Анализ изображений на 1 кадр генерируется результатов аналогичных тем, которые получены от людей-наблюдателей в еАх тест. Корреляция между процентными замораживания измеренных через человеческие наблюдений и использованием ImageFZ под каждым состояния "Замораживание критерий (пикселей)" (т.е. 20, 30 и 40 пикселей) были рассмотрены. Проценты замораживания, рассчитанные по ImageFZ на "замораживание критерий (пикселей) 'от 20, 30 и 40 пикселей были, во всех случаях, сильно коррелируют с данными, полученными человека наблюдений (рис. 5). Как показано на рисунке 5D, когда критерий замерзания установлен в низкой стоимости, неуловимым движением мыши, которая считается "замораживание" на человека наблюдателей, будут считаться «незамерзающая 'с помощью ImageFZ. И наоборот, если критерий устанавливается на высокое значение, движение мыши, забил как "незамерзающей" человеческими наблюдателей, будет рассмотрен "замораживание" с помощью ImageFZ (Цифры 5C, 5F и 5I). Таким образом, для получения наиболее достоверных результатов, каждый параметр программы ImageFZ должен быть откалиброван намING данные, забитые через человеческие наблюдений в каждой среде тестирования.

Кроме того, мы сравнили результаты, полученные с помощью человека-наблюдателя, используя систему photobeam основе измерения компьютер (система контроля замерзания), с результатами, полученными с помощью ImageFZ (см. рисунок 6). Человек-наблюдатель был ослеплен в группе лечения и результатов ImageFZ скоринга. Для настройки параметров системы контроля замерзания, мы использовали 3 меры процент замораживания из ранее утвержденной системы ^30. Кратко, количество 10-секундными интервалами в котором животные требуется более 1 или 2 секунд, чтобы пересечь первый новый луч интервале (1 сек 10сек и 2 сек 10сек, соответственно) и латентность между началом каждого интервала 5 сек и Третий новый прерывание луча в пределах этого интервала (Latency3) были измерены. Процент интервалов, в течение которого мышь замерзания или процент от общего количества времени тequired сломать третий photobeam были рассчитаны.

Процент замораживания, измеренные в каждой системе показаны на рисунке 6. Группы сравнивали с помощью двусторонней повторными измерениями ANOVA с последующим т-тестов (см. таблицу 1). Проценты замораживания измеренные с помощью ImageFZ (Рисунок 6B) были более похожи на те, забил через человеческого наблюдения (Рисунок 6A), чем полученных с помощью системы photobeam основе (Цифры 6C-E) данных. Проценты замораживания измеренные с помощью программы ImageFZ в каждом тесте были тесно связаны с теми, забил через человеческого наблюдения (кондиционирование, г = 0,947; тест контекст, г = 0,970; подают реплики тест, г = 0,934), в то время как корреляции между процентным замораживания измеряется с использованием системы измерения компьютер photobeam основе (1 сек 10 сек, 2 сек 10 сек, или Latency3) и человек-наблюдатель были ниже (кондиционирование, г = 0,503, 0,593 и 0,761; контекст тEst, г = 0,772, 0,819 и 0,912) по сравнению с корреляций между процентах замораживания измеренных с помощью ImageFZ и человеческое наблюдение (рис. 7а и 7b). Кроме того, Рисунок 7 показывает, что различия между процентах замораживания, полученных с помощью человеческого наблюдения и использованием ImageFZ в каждой мыши были самые незначительные перепады. Эти результаты показали, что процент замораживания, измеренные с помощью ImageFZ были аналогичны тем, которые получены путем наблюдения человеком и что ImageFZ является высокой точностью при измерении количества замерзания.

Рисунок 1. Аппараты для контекстного и подают реплики тест кондиционирования страх. (А) акриловая площадь камеры для испытания кондиционирования и контекста ( B) металлические сетки на белой пластиковой этаже для черных, агути, или разбавить коричневых мышей (вверху) и electrifiable черный металлических сеток на черном пластиковом полу для белых мышей (внизу); увеличенные изображения сеток приведены в правой Панель, (С) белый шум генератора / тон и шок генератор, (D) звуконепроницаемой комнате, и (Е) акриловый треугольной камера с плоским полом для подают реплики испытания. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2. Схематическое изображение протокола. (А) Обзор контекстной и подают реплики тест кондиционирования страх, (В), кондиционер, (С) сКОНТЕКСТ тест, и (D) подают реплики тест. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3. Анализ изображений с помощью программы ImageFZ программного обеспечения. Для каждой пары последовательных изображений, количество области (пиксели), через которое мышь перемещается рассчитывается путем ImageFZ. Когда эта область ниже определенного порога (например, 30 пикселей), поведение, как считается, быть "замораживание". Когда количество области равна или превышает порог, поведение считается «без образования льда. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 4. Сравнение полученных процентах замораживания рассчитанных из образов на разных частотах кадров с использованием ImageFZ с теми, измеряется с помощью человеческого наблюдения. Испытания кондиционирования страх проводились с использованием самцов мышей C57BL/6J (п = 5). В ходе испытаний, два наблюдателя забил морозильной поведение. Одновременно, живые изображения были захвачены в 4 кадров в секунду с помощью программы ImageFZ. Файлы, захваченные в 4 кадров в секунду были уменьшены после извлечения кадры, чтобы соответствовать изображений, полученных в 1 кадров в секунду или 2 кадра в секунду. Значения параметров 'Оцените (кадр / сек)' были установлены в 1, 2, или 4 кадров в секунду, и проценты замораживания в каждом 60-сек бен были рассчитаны из файлов изображений с помощью ImageFZ автономного анализа. Каждая точка представляет собой процент замерзания каждой 60-сек мусорное ведро. Были рассчитаны коэффициенты корреляции Пирсона между полученных из человеческой наблюдения и анализа ImageFZ данных.Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 5. Проценты замораживания, рассчитанные из изображений при различных значениях критерия замораживания, используя ImageFZ и измеренных через человеческие наблюдений были сопоставлены. Испытания кондиционирования страх были проведены с использованием самцов мышей C57BL/6J (N = 5). В ходе испытаний, две наблюдатели зафиксировали морозильной поведение, и живые изображения были получены с помощью программы ImageFZ. Проценты замораживания в каждом 60 сек бен были рассчитаны из изображений (1 кадр / сек) через ImageFZ автономного анализа, установив значения параметров «Замораживание критерий (пикселей) 'до 20, 30 или 40 пикселей. Каждая точка представляет собой процент замерзания каждой 60-сек мусорное ведро. Корреляция со Пирсонакоэффициенты между полученными из человеческих наблюдений и анализа ImageFZ данных были рассчитаны в каждом тесте. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 6. Процент замораживания были измерены с помощью автоматизированных систем и человеческого наблюдение в безусловных и условных групп мужчин мышей C57BL/6J (п = 5, каждой группе). (А) Человек наблюдение, (B) ImageFZ, (C) Заморозка системы Monitor 1 (1 сек 10 сек), (D) Заморозка системы Monitor 2 (2 сек 10 сек), и (Е) Заморозка системы Monitor 3 (Latency3). Сравнения в группах проводились с использованием двусторонней повторными измерениями ANOVA с последующим т-тестов (жуткоnditioned группа против кондиционером группа, *, Р <0,05; †, р <0,01). Полученные с помощью ImageFZ были аналогичны забил через человеческого наблюдения данных. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 7. Корреляция и частотное распределение различий между процентами замораживания, измеренных с помощью автоматизированных систем и человеческого наблюдения. (АВ) Scatter участков и коэффициентов корреляции Пирсона между процентах замораживания забил с помощью автоматизированных систем и человеческого наблюдения показаны. Проценты заморозки, рассчитанные по ImageFZ, сильно коррелировали с данными, полученными человеческого наблюдения. (CF) Проявления менее чем в 10% дифинтерференции между процентах замораживания, полученных из автоматизированных систем против человеческого наблюдения были самыми высокими, когда данные анализируются с помощью ImageFZ сравнивались с проанализированы с помощью человеческого наблюдения. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

	ANOVAs
	Состояние	Время	Состояние х Время
День 1 (кондиционирование)
Человек	F (1,8) = 28,53, р = 0,0007	F (7,56) = 20,79, р <0,0001	F (7,56) = 16,58, р <0,0001
ImageFZ	F (1,8) = 13,97, р = 0,0057	F (7,56) = 21,40, р <0,0001	F (7,56) = 11,69, р <0,0001
Мораторий монитор (1sec10sec)	F (1,8) = 5,16, р = 0,0528	F (7,56) = 2,39, р = 0,0329	F (7,56) = 0,72, р = 0,6572
Мораторий монитор (2sec10sec)	F (1,8) = 4,07, р = 0,0782	F (7,56) = 3,44, р = 0,0039	F (7,56) = 1,52, р = 0,1803
Мораторий монитор (Latency3)	F (1,8) = 4,44, р = 0,0682	F (7,56) = 9.94, р <0,0001	F (7,56) = 4.33, р = 0,0007
День 2 (контекст)
Человек	F (1,8) = 42,94, р = 0,0002	F (4,32) = 1,91, р = 0,1336	F (4,32) = 1,48, р = 0,2302
ImageFZ	F (1,8) = 49,61, р = 0,0001	F (4,32) = 2,06, р = 0,1087	F (4,32) = 0,83, р = 0,5174
Мораторий монитор (1sec10sec)	F (1,8) = 20,28, р = 0,002	F (4,32) = 1,63, р = 0,1918	F (4,32) = 0,55, р = 0,6997
Мораторий монитор (2sec10sec)	F (1,8) = 40,20, р = 0,0002	F (4,32) = 2.66, р = 0,0504	F (4,32) = 1,20, р = 0,3306
Мораторий монитор (Latency3)	F (1,8) = 35,30, р = 0,0003	F (4,32) = 2.49, р = 0,0626	F (4,32) = 1,09, р = 0,3793

Таблица 1. Сравнения статистики.

Обсуждение

Тест контекстная и подают реплики страх кондиционирования является одним из наиболее широко используемых парадигм для оценки обучения и памяти. Этот тест является одной из форм павловской кондиционирования, в котором ассоциация между контексте и / или условного раздражителя (слуховые CUE) и отвращение раздражитель (электрический Footshock). После даже одного спаривания в контекстном / слуховой кия и Footshock, мыши обнаруживают длительное замораживание, когда сталкиваются с обеих контексте или кия. В этом тесте поведение замораживание используется в качестве индекса страха памяти. Фармакологические и поражения исследования показали, что формирование памяти, консолидация и извлечения регулируется несколькими областях мозга, таких как миндалина, гиппокамп, и префронтальной коре ^3,33-35. Кроме того, молекулярная генетика исследования продемонстрировали роль определенных генов и молекул, участвующих в процессах обучения и памяти в этих регионах головного мозга с использованием генной инженерии мышей ^36. Таким образом, этот тест Simplе и полезным для изучения нейробиологические основы основной обучение страх и память. В этом фильме статье мы представили наш протокол для обеспечения экспериментаторов с подробной информацией, чтобы понять и легко выполнить тест.

Замирание количественно путем прямого наблюдения человеческими экспериментаторов. Хорошо обученный экспериментатор будет производить надежные, стабильные результаты по наблюдениям. Тем не менее, этот метод предполагает потенциальные проблемы, такие, как различия в метода наблюдений, предубеждений наблюдателей, и простых количественного ошибок, что делает его трудно напрямую сравнить результаты от независимых экспериментаторов и разных лабораториях. Автоматизированная система измерения компьютер photobeam основе также используется ^26,30-32. Тем не менее, эта система также представляет потенциальные проблемы в измерении поведения замораживания. Из-за сенсорного устройства, эта система может быть не в состоянии обнаружить небольшие движения головы, что бы TypicaLLY забито как "активный" через человеческого наблюдения. Кроме того, дрожа при замораживании может рассматриваться в качестве незамерзающих потому что, когда зависает животных, периодически перерывы в photobeam наблюдаются как следствие трепетом. В качестве альтернативного способа, автоматизированные изображение-и видео-анализаторы были разработаны ^17-20,37,38. Anagnostaras др.. ³⁷ описано несколько систем с программного обеспечения для анализа изображений программы, которые имеют хорошую юридическую силу и оценка замораживания хорошо ^17,20,37-38. Однако, большинство из этих систем и программ анализа должны быть получены от коммерческих поставщиков и, как правило, дороже. Мы разработали программу ImageFZ программного обеспечения для анализа поведения замерзания, и эта программа распространяется в виде программы свободного программного обеспечения. ImageFZ обнаруживает мышь как орган пикселей (частиц) и дискриминирует тонкие движения мыши, как "замораживание" или "незамерзающей" в зависимости от количестваплощадь неперекрывающихся участках между частицами каждой парой последовательных изображений. Как показано на репрезентативных результатов измерений с помощью программы ImageFZ соответствуют или более точными, чем полученные с использованием других методов. Таким образом, программа ImageFZ автоматически измеряет поведение, что человеческие наблюдатели судить, как замораживание с помощью определенных критериев. Кроме того, программа вычисляет ImageFZ пройденное расстояние (см) до, во время и после воздействия Footshock, что облегчает оценку чувствительности ударной и анализа замерзания поведения.

Существуют методологические различия между лабораториями. Эти различия могут привести к трудности в сравнении данных среди лабораториях и в репликации результатов в разных лабораториях. Для получения более точных и сопоставимых данных, необходимо стандартизировать протокола испытаний как можно больше. Система анализа с ImageFZ приводит к автоматизации процедур испытаний, которые могут внести свой вклад встандартизация протоколов используется во лабораториях.

Несколько поведенческие реакции необходимо учитывать при анализе поведения замерзания. Во-первых, когда животные сталкиваются страшный ситуацию, они могут бежать вместо замораживания ^39. Спасаясь является одним из реакции страха, и его появление приведет к недооценке страх память. Во-вторых, замораживание может зависеть от общего уровня активности, и уровень активности в экспериментальных и контрольных мышей необходимо изучить. Например, хотя мыши, лишенные мускариновые рецепторы М1 ацетилхолина показали сниженные уровни замораживания по сравнению с мышами дикого типа, различные поведенческие тесты показали, что результаты могут быть отнесены к их гиперактивности фенотипа вместо их ухудшение памяти ^18. ImageFZ вычисляет расстояние (см), пройденное субъектов. Данные доступны для изучения или не существует различия в общих уровней активности между субъектами. Если существует разница группа впройденное расстояние, один из возможных подходов к проблеме заключается в рассмотрении расстояние, пройденное в течение первого 2 мин обучения как базового деятельности и использовать соотношение подавления (коэффициент подавления = (активность во время тестирования) / (активность во время базовой линии + активности в течение тестирование)) в качестве вторичного индекса страха ^17,40. Наконец, разница в чувствительности боли, вызывая изменения в реакционной к электрической Footshock, если таковые имеются, может привести к изменениям в поведении замерзания. ImageFZ также вычисляет расстояние (см) подробно от 2 сек до выдержкой 2 сек Footshock до 2 секунд после его выдержки в течение 6 (с), который может быть использован в качестве индекса чувствительности Footshock.

Видео-анализаторы были разработаны для измерения замерзания поведение альбиноса, черный, агути, и разбавить коричневые мышей. ImageFZ используется лоток черный пол и черные сетки для изучения белых мышей (см. рисунок 1В). Черные сетки выполнены из SPECI союзник обработке металлов с покрытием черной краской и имеют электрическую проводимость, аналогичную из непокрытыми металлическими сетками, которые обычно используются для черных мышей. ImageFZ также анализирует Замирание у крыс и других грызунов через настройках параметров программы. В текущей версии ImageFZ, поведение субъекта записывается на видеокамеру от верхней стенки для анализа замерзания. ImageFZ также могут быть использованы в настройке, где изображения захватываются со стороны камеры. Кроме того, ImageFZ контролирует максимум 4 аппаратов. Эта функция позволяет исследователю одновременно изучить 4 мышей, экономя время и снижая потенциальные влияния от различия во времени выполнения каждого субъекта и тестирования того, на поведение. Таким образом, ImageFZ упрощает процедуру тестирования и анализа поведения замерзания, и эта программа облегчает тестирование при меньших затратах труда и без какой-либо подготовки для поведенческих экспериментов.

e_content "> В лаборатории Миякава, мы оценили более 110 штаммов генетически модифицированных мышей и контрольных мышей дикого типа в тесте кондиционирования контекстного и подают реплики страха с использованием системы видео для анализа и выяснения последствий данного гена на обучение и память ^41-42 Мы получили большой набор исходных данных для более чем 5000 мышей необработанные данные, которые были использованы для опубликованных научных статей ^4-16 включены в 'Мышь фенотипа базы данных »как общественного базы данных (URL:.. Http: / / www.mouse-phenotype.org/). Настоящий фильм статье приводится подробная информация о деталях нашей экспериментальной процедуры и способствует пониманию ситуации тестирования.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageFZ program	Developed by Tsuyoshi Miyakawa		This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7.
Conditioning chamber	O’Hara & Co., Japan	CL-3002L	For mouse.
Cued test chamber	O’Hara & Co., Japan	CLT-3002L	For mouse.
Interface	O’Hara & Co., Japan	CL-1040	The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program.
Scrambled shock generator	O’Hara & Co., Japan	SGA-2040	The shock generator can be controlled by ImageFZ program.
Shock grid tester (ammeter)	O’Hara & Co., Japan	SG-T
USB video capture device	XLR8	USB2IVOSX
Quad image splitter	Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan	400AS
Soundproof room	O’Hara & Co., Japan	CL-4210
Freeze Monitor	San Diego Instruments, Inc., CA, USA		16 x 16 photbeam array  ( 2.5 cm spacing)