JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем набор методов для изучения спонтанного поведения свободно плавающих слабо электрический рыбу в течение длительного периода времени, по синхронно измерения разряда электрический орган сроки животного, положение тела и осанку как точно и надежно в специально разработанной аквариума бака внутри сенсорной изоляция камеры.

Аннотация

Долгосрочный поведенческая слежения может захватить и количественно природные поведения животных, в том числе те, которые происходят нечасто. Поведения, такие как разведка и социальных взаимодействий может быть лучше всего изучать, наблюдая необузданные, свободно ведут себя животные. Слабо электрическая рыба (ВЭФ) дисплей легко наблюдать разведочных и социального поведения, испуская электрический разряд органа (ПС). Здесь мы описываем три эффективных методов, чтобы синхронно измеряют EOD, положение тела и позу в свободное плавание ВЭФ в течение продолжительного периода времени. Во-первых, мы опишем построение экспериментальной бака внутри камере изоляции, призванной заблокировать внешние источники сенсорных стимулов, таких как свет, звук, и вибрации. Аквариум распределяли для размещения четырех испытательных образцов, и автоматизированные ворота дистанционно контролировать доступ животных к центральной арене. Во-вторых, мы описываем точный и надежный метод измерения ПС времени в режиме реального времени от свободно плавающих ВЭФ. Сигнальные искажения, вызванные движениями тела животного исправляются пространственного усреднения и височной стадии обработки. В-третьих, мы описываем подводную установку ближнего инфракрасного изображений наблюдать невозмущенные ночные поведения животных. Инфракрасные световые импульсы использовались для синхронизации времени между видео и физиологического сигнала в течение периода записи в длину. Наша автоматизированная программа отслеживания измеряет положение тела животного и позы надежно в водной сцене. В сочетании, эти методы позволяют долгосрочные наблюдения спонтанного поведения свободно плавающих слабо электрический рыбу в надежной и точной манере. Мы считаем, что наш метод может быть так же применяется к изучению других водных животных, соотнося свои физиологические сигналы с поисковых или социального поведения.

Введение

История вопроса. Количественные эксперименты по поведению животных (например, вынужденный выбор, избегание шок, Т-лабиринт, и т.д..), Как правило, используются для расследования конкретных гипотез относительно навыков сенсорно-моторных, обучение и формирование памяти. Тем не менее, эти ограничительные эксперименты пропустить большую часть богатства естественного поведения животных и, вероятно, привести к упрощенным моделям основной нервной основе поведения. Опыты в более натуралистических условиях, следовательно, важным дополнением, по которому мы можем исследовать более полно вида поведения репертуар. Опыты с свободно движущихся животных, должны, однако, решения уникальных технических проблем, таких как движения, вызванной артефактов записи. В отличие от стимула, вызвали ответы, спонтанно происходит исследовательское поведение не может быть предсказано, таким образом испытуемые должны постоянно контролироваться и отслеживаться в течение длительного периода времени. Конкретные вопросы исследования чан, лучше всего осуществить с помощью тщательно отобранных организмов и доступных технических средств. Например, оптической записи и стимуляции методы, такие как генетически-кодированных датчиков кальция 1 и Optogenetics 2 были успешно применены свободно двигаться генетической модели организмов 3-5. Кроме того, миниатюрные нейронные системы телеметрии может записывать и стимулировать свободно перемещаться мелких животных 6,7.

Электрический рыбы. Виды ВЭФ генерировать разряды электрического органа (ЕСПЗ), которые позволяют им чувствовать свое непосредственное окружение или общаться на больших расстояниях. Временные закономерности ЕСПЗ отличаться в разных условиях, таких как самостоятельного движения 8,9, сенсорных стимулов 10,11 и социальных взаимодействий 12,13. Импульсного типа ВЭФ виды производят на поезд дискретных импульсов, в отличие видов махать типа, которые генерируют непрерывные квази-синусоидальной формы волны. В общем, пульс типа видов экспонат морэ переменная скорость ПС по сравнению с видами волна типа и EOD ставки животных точно отражать новизну содержимое своих сенсорных окрестностях 10,14. Видов импульсного типа можно сразу сократить интервал между импульса (IPI) в пределах одного цикла импульса в реагировать к новому сенсорной возмущения (новинка отклика 10,11,14). Продолжающийся электрический поведение этих рыб можно возмущается неконтролируемых сенсорных стимулов из внешних источников, и различные виды раздражителей, таких как вибрация, звук, свет, и свет, как известно запуска ответов новизны. Таким образом, особые меры предосторожности должны быть приняты, чтобы заблокировать или ослабить внешние сенсорные стимулы во время долгосрочного наблюдения свободное плавание ВЭФ. Таким образом, изменения в скорости EOD и траекторий движения может быть специально отнесены к стимулам, представленных экспериментатора.

Аквариум бак и изоляция камеры. Поэтому мы помещены несколько слоев Амортизирующая материалов уNDER большой аквариум бак (2,1 м х 2,1 м х 0,3 м), и окружили танк с изолированным корпусом блокировать внешние источники света, электрических помех, звук и теплового потока. ПС ставка зависит от температуры окружающей среды 15,16, при этом температура воды была жестко регулируется на тропический диапазоне (25 ± 1 ° С) для видов южноамериканских ВЭФ. Мы построили большой и мелкой (10 см глубина воды) бак для наблюдения пространственные разведочных поведения ВЭФ в основном ограничены в двух измерениях (рис. 1А). Танк был разделен на центральной арене, чтобы наблюдать пространственные поведения, и четырех угловых отсеков отдельно дом отдельных рыб (рис. 1В). Каждый отсек был построен водонепроницаемыми для предотвращения электрическую связь между физическими лицами. Доступ животных к центральной арене контролировалась извне четырех моторизованных ворот. Ворота были размещены между отсеками, и они стали водонепроницаемыми, когда закрываетсянейлоновыми крыла гаек. Нет металлические части были использованы подводные с ВЭФ чутко реагируют на металлы.

Запись ПС. ЕСПЗ генерируются в стереотипной манере активацией одного (в Mormyrids) или нескольких пространственно распределенных электрических органов (в Gymnotiforms) 17,18. Временные модуляции в скорости EOD может выявить нейронные деятельности более высокого уровня, так как мозговое кардиостимулятор получает прямые нервные сигналы от высших отделов головного мозга, таких как диэнцефального prepacemaker ядра, которое, в свою очередь получает аксональные прогнозы от переднего мозга 19. Однако сроки EOD должны быть тщательно экстрагируют из сырого сигнала записи, а не смещен движения искажений, вызванных животного. Электрическое поле порождается ВЭФ можно приблизить как диполь, поэтому EOD импульсные амплитуды на регистрирующих электродов зависят от относительных расстояний и направлений между животным и электродов 8,20. Самостоятельно MOVEM животногоЭнты изменить относительную геометрию между животным и электродами, при этом движения вызывают амплитуды EOD на различных электродов в изменяться с течением времени в летучем образом (см. фиг.2В в июне и соавт. 8). Кроме того, само-движения также изменить форму записанных EOD сигналов, потому что относительный вклад от другой набор электрических органов зависит от их расположения по длине тела и их местных кривизны введенной хвост изгиба. Искажения движения, вызванной в амплитуд и форм EOD может привести к неточных и ненадежных измерений временных EOD. Мы преодолели эти проблемы, пространственно среднем несколько сигналов EOD записанные в разных местах, и, добавив фильтр извлечения конверт точно определить время EOD из свободное плавание ВЭФ. Кроме того, наш метод также измеряет амплитуду EOD, которые указывают ли животное отдыхает или активно перемещения на основе изменения EODамплитуды с течением времени (см. рис 2E и 2F). Мы записали дифференциально усиленные сигналы от записи пар электродов для уменьшения синфазного шума. Поскольку импульсы EOD генерируются с нерегулярными интервалами времени, событие временных рядов ПС имеют переменную частоту дискретизации. EOD временные ряды могут быть преобразованы в постоянной частоты дискретизации посредством интерполяции, если этого требует аналитической инструмент выбора.

Запись видео. Хотя запись ПС может контролировать валовую двигательную активность животного, видеозапись позволяет прямые измерения положения тела животного и позы. Ближней инфракрасной области (БИК) освещение (λ = 800 ~ 900 нм) позволяет невозмущенную визуальное наблюдение свободно плавающих рыб 21,22, так как WEFs наиболее активны в темноте, и их глаза не чувствительны к NIR спектра 23,24. Большинство цифровых датчики изображения (например, CMOS или CCD) может захватить NIR спектр с wavelengtч Диапазон между 800-900 нм, после удаления Инфракрасный (ИК) блокирующий фильтр 25. Некоторые высокого класса потребительского класса веб-камеры предлагают высокой четкости, широкий угол обзора и хорошую низкой освещенности, который может производить качество изображения сравнимо с или выше профессионального уровня ИК камер, доступных на гораздо большие затраты. Кроме того, некоторые веб-камеры потребительского класса в комплекте с записи программного обеспечения, которое позволяет расширенную продолжительность записи путем сжатия видео без потери качества. Большинство профессионального уровня камеры предлагают времени синхронизации TTL импульсных выходов или TTL триггер импульсных входов 26 для выравнивания времени между видео с оцифрованных сигналов, но эта функция, как правило, отсутствует в потребительского класса веб-камер. Однако сроки между видеозаписи и сигнала цифровой преобразователь может быть точно подобраны по совместительству захвата периодически мигает ИК-подсветкой с камерой и сигнала цифрового преобразователя. Начальная и конечная сроки ИК импульса может использоватьсясек двух калибровочных время маркеры для преобразования числа видеокадров в единицу времени сигнал цифрового преобразователя и наоборот.

Освещение и фон. Захвата через воду изображение может быть технически сложным из-за отражения света на поверхности воды. Поверхность воды может действовать как зеркало, чтобы отразить визуальную сцену над водой, и темных визуальные особенности подводный, таким образом над водой сцена должна быть оказана невыразительный, чтобы предотвратить визуальный помех. Для того, чтобы изображение весь аквариум, камера должна быть размещены непосредственно над водой, и она должна быть скрыта за потолком над небольшим отверстием просмотра, чтобы предотвратить свое отражение на поверхности воды. Более того, поверхность воды может производить блики и неравномерного освещения, если источники света неправильно проецируется. Непрямое освещение может достичь равномерную яркость по всей аквариуме, нацеливая источники света к потолку, так что потолок и окружающая вальLs может отражать и рассеивают световые лучи, не достигнув поверхности воды. Выберите ИК-осветитель, который соответствует спектральной чувствительности камеры (например, 850 нм пик длины волны). Электрические помехи от источников света могут быть минимизированы с помощью светодиодов и размещения их источники питания постоянного тока за пределами клетки Фарадея. Поместите белый фон под баком, так как рыба контрастирует хорошо в белом фоне в ЧМР длин волн. Точно так же, использование матового белого цвета на внутренних поверхностях сурдокамере обеспечивает равномерное и яркое фоновую подсветку.

Отслеживания видео. После записи видео, автоматизированная алгоритм изображение слежения может измерять позиции и положения тела животного в течение долгого времени. Отслеживая видео может быть автоматически выполнена либо готового к использованию программного обеспечения (Точка зрения или Ethovision), или программируемой пользователем программного обеспечения (OpenCV или MATLAB Image Processing Toolbox). В качестве первого шага отслеживания изображения,действительный площадь слежения должна быть определена, рисуя геометрическую форму, чтобы исключить из нее часть снаружи (маскировки операцию). Далее, изображение животного должен быть изолирован от фона вычитанием фоновое изображение из изображения, содержащего животное. Вычитается изображение преобразуется в двоичном формате путем применения пороговой интенсивности, так что центр тяжести и осью ориентации может быть вычислена из бинарных морфологических операций. В Gymnotiforms 27-29 и Mormyrids 30-32, плотность electroreceptor является самым высоким вблизи области головы, поэтому положение головы в любой момент указывает местоположение самой высокой остроты слуха. Места головная и хвостовая может быть автоматически определяется путем применения операции поворот изображения и ограничительной рамки. Концы головы и хвоста можно было отличить друг от друга вручную определяя их в первом кадре, а также отслеживать их расположения от сравнения двух последовательных кадров.

протокол

Эта процедура отвечает требованиям университета Оттавы комитета по уходу за животными. Нет конфликта интересов не объявляется. Пожалуйста, обратитесь к Таблице материалов и реагентов для марок и моделей оборудования и материалов, перечисленных ниже. Пользовательские письменные Spike2 и MATLAB скрипты и выборочные данные предоставляются в Дополнительной файла.

1. Аквариум и изоляция палата установки

  1. Анти-V ibration этаж. Построить поверхность анти-вибрации (2,1 м х 2,1 м), складывая резиновые прокладки, акустическая пенополистирола, морской панель фанеры и пенополиуретана колодки от основания до вершины (рис. 1А). Положите четыре деревянных шпильки (5 см х 10 см) на фанерной панели для поддержки края баком аквариума.
  2. Этаж обогреватель. Положите электрически экранированный нагревательный элемент над термически градуированной пены (см. рис 1D дно). Накройте нагревательный элемент с металломLIC сетка для электрического экранирования.
  3. Пространственное бак. Построить широкий и неглубокий аквариум бак (1,8 м х 1,8 м х 30 см) с использованием 1,3 см толщиной Закаленное стекло, Г-образный алюминиевый каркас и аквариум силикон (см. рисунок 1А). Обложка с нижней стороны бака с большой лист белом фоне, чтобы обеспечить высокую контрастность изображений (см. протокол 3).
  4. Разделите аквариум в центральной арене (диаметр 1,5 м) и четырех угловых отделений (см. рисунок 1В), установив стен (22,5 см в высоту) из акриловые листы (Matte White, толстые 0,64 см).
    1. Бенд четыре акриловые листы (22,5 см х 102,7 см), применяя тепло, чтобы создать четыре криволинейных участков стены, и прикрепить их к днищу емкости с помощью силиконового затыкают, чтобы отделить центральную арену от четырех угловых отсеков. Оставьте 20 см пространство между криволинейных участков для установки затвора.
    2. Отдельные соседних угловых отсеков, установив четыре двойных стен Wiй пробелы 15 см, которые обеспечивают дополнительную электрическую изоляцию и места для подводных датчиков, таких как гидрофоном.
  5. Соберите четыре моторизованные ворота, и установить их между угловыми отсеков и центральной арене.
    1. Соберите четыре дверных рам, как показано на рисунке 1С. Создайте шесть скважин (0,64 см в глубину) на каждой дверной рамы, вставлять нейлон желудь гайки (0,64 см диаметр резьбы) и закрепите их с эпоксидной смолой.
    2. Отрежьте четыре дверных панелей из акрила и резиновых листов, и создать шесть отверстий (0,64 см диаметр) на акриловой и резиновых панелей для запирающего механизма. Присоединиться к акриловые и резиновые панели, используя силиконовую замазку.
    3. Установите акриловая петли присоединиться дверные панели с дверными коробками.
    4. Гора размахивая руками на сервомоторов, и установить их на верхней части дверных рам (см. рисунок 1С). Сделать петли с помощью кабельных стяжек для связывания размахивая руками, чтобы дверных панелях.
    5. Расположите ворота сборок на гапс создается между криволинейных участках стены, и закрепите их с помощью силикона конопачение.
    6. Подключите все серводвигатели к сервоконтроллера, и подключить его к источнику питания и компьютеру через активного расширения USB кабеля. Проверьте ворота с помощью управления программное обеспечение, поставляемое с сервопреобразователя.
    7. После того, как силикон затвердеет, проверить на герметичность, заблокировав все ворота с нейлоновыми винтами и заполнение один отсек за один раз.
  6. Изоляция камеры. Построить сурдокамере окружить аквариум и блокировать внешние источники света, звука и электрических помех (см. рисунок 1D).
    1. Сделайте три стеновых панелей (2 м х 2 м х 5 см) и четыре дверных панелей (1,9 м х 0,95 м х 5 см). Для каждой панели, присоединиться алюминиевые молдинги (5 см х 2,5 см), чтобы создать прямоугольную рамку, и клепать белый гофрированный пластиковую панель на алюминиевой раме. Заполните акустические сланцы стекловолокна в панелях и рядом с черным гофрированным пластиковой панели.
    2. Установите три стеновых панелей на антивибрационной этаже, и установить фортепиано петли присоединиться четыре дверных панелей на стеновых панелях.
    3. Окружите изоляции камеру с алюминиевыми ячейками, и земля сетки со всех сторон, чтобы создать клетку Фарадея.
  7. Контроль влажности. Установите малошумящий вытяжной вентилятор (рис. 1F вверху), чтобы удалить лишнюю влажность наращивание от отопления. Поместите вытяжной вентилятор не менее 2 м от места записи, и установить воздуховод между камерой изоляции и вытяжного вентилятора.
  8. Регулярно контролировать и поддерживать условия резервуар для воды и животных.
    1. Поддерживать постоянные условия воды в 10 см глубиной, 100 мкСм / см проводимости и рН 7,0 путем добавления воды или соли исходного раствора (см. Кнудсен 33 за рецепт). Добавить мешок измельченной кораллов, если рН падает ниже 6,5.
    2. Установите вертикальные аквариума фильтры, которые могут работать с мелкой воде для очистки иаэрации целей (Рисунок 1F внизу). Отключите фильтры и взял их из центральной арене во время записи сессий.
    3. Доставка живых Mealworms на дне резервуара путем присоединения их на присосками с резинками. Избегайте свободно плавающие охотится, таких как blackworms, чтобы предотвратить бесконтрольное кормление бездомных жертв во время записи.

2. ПС слежения

  1. Установка Электроды. Соберите восемь графитовых электродов и пространство их пропорционально на изогнутой стене центрального арене.
    1. Получить чертеж провода (15 см в длину; Марс углерода 2 мм Тип HB) и сбрить внешнее покрытие из главных ролей.
    2. Вырезать восемь 10 см сегменты коаксиального кабеля (RG-174), оберните сердцевину кабеля вокруг одного конца графитовых стержнях, и применять термоусадочные трубки над ними для сильной и стабильной электрического соединения. Прикрепите BNC разъемы джек на противоположных концах (рис. 2А слева).
    3. Расположите электроды на стене, записывая на пленку, и применять тонкие полосы клейкой лентой на поверхности электродов для защиты от силикона. Нанести силиконовый конопачение постоянно держать электроды, и удалить все ленту, прежде силиконовых затвердевает (рис. 2 справа).
  2. Построить восемь кабельные сборки путем измерения расстояния от каждого электрода к усилителю, и резки коаксиальных кабелей (RG-54) в длину. Прикрепите подключаемые разъемы BNC на обоих концах кабеля.
  3. Используйте кабельные сборки для подключения все электроды к усилителю. Дифференциально усилить путем спаривания два 90 ° ориентированные электроды (см. рисунок 2В), и на первом все коаксиальные защитные провода, подключив их к клетке Фарадея.
  4. Установка усиления усилителя ниже предела насыщения сигнала, а также применять полосовой фильтр (200 Гц-5 кГц), чтобы удалить шум. Оцифровка четыре записи электродных пар при 40 KS / сек.
  5. Онлайнобработки сигналов. В инструкции написаны для программного обеспечения Spike2, и настройки параметров оптимизированы для Gymnotus зр. (См. рисунок 2С для резюме).
    1. Добавить постоянного удаления процесс (τ = 0,1 сек) для всех каналов записи.
    2. Добавить исправить процесс все записи каналов.
    3. Создание виртуального канала путем суммирования всех четырех каналов записи.
    4. Выписка одномодальное конверт за EOD импульса, добавив RMS (среднеквадратичное-квадрат, figure-protocol-7878 ) Процесса (τ = 0,25 мс) в виртуальном канале, для генерирования один пик за EOD цикла однозначно определить время импульса.
    5. Создать realmark канал из виртуального канала и запишите время и значения амплитуд пиков, после установки соответствующего порога, чтобы захватить все EOD импульсов шства без отсутствует пульс, избегая при этом ложных срабатываний.
    6. Монитор мгновенную скорость УВБ в реальном времени с помощью установки опции отображения канала в realmark канала с режимом мгновенной частоты.
    7. Контролировать движение рыб в реальном времени с помощью дублирования realmark канал, и установить опцию отображения в режиме сигнала.
    8. Количественная уровень активности от СКЗ амплитуды склоне EOD путем создания виртуального канала из realmark канала (0,01 сек периодом выборки), и добавить наклон (τ = 0,25 мс) и RMS (τ = 0,5 мс) процессы.
    9. Экспорт realmark канал в программном обеспечении Spike2 в формате MATLAB.

3. Синхронное Отслеживание Видео

  1. Создайте фон сцены.
    1. Скрыть любой объект, который бросает отражение на поверхности воды, покрывая с матовой белой столешницы фильма.
    2. Установите Matte Whiteгофрированная пластиковая панель 15 см ниже потолка, чтобы скрыть камеру и вентиляционное отверстие.
    3. Печать моделей сетки на большом листе белой бумаги для калибровки камеры, и положить его под танк, чтобы обеспечить высокую контрастность фона.
  2. Установите источники света.
    1. Получить ИК светодиод и, удалить встроенные вентиляторы для снижения уровня шума. Драйв светодиод с текущим регулированием источника питания постоянного тока, помещенных вне клетки Фарадея.
    2. Установить ИК светодиодная подсветка для съемки в темноте, и белые светодиодные фонари для вождения суточный световой цикл в тестовом рыбы. Прямые все источники света к потолку, чтобы достичь косвенное и равномерное освещение (рис. 3А).
    3. Регулировать суточный световой цикл при движении белый светодиод с таймером управлением (например, 12 ч on/12 час выключено).
  3. Установите камеру непосредственно над аквариумом.
    1. Получить НИР-чувствительная камера, или удалить блокирующий Filte ИКR разбивая тонкий лист тонированного стекла на задней стороне линз. Убедитесь, что угол обзора достаточно широк, чтобы изображение вся центральная арена.
    2. Сделайте небольшое отверстие просмотра в середине потолочной панели, и поместите камеру непосредственно над отверстием.
    3. Установите белый кольцо на страже вокруг объектива, если источники света генерировать блики.
  4. Сделать времени синхронизируются видеозапись.
    1. Разместить ИК-подсветкой в ​​одном из четырех танковых углах генерировать импульсы синхронизации времени (1 Продолжительность мс, 10 сек периода). Добавить нагрузки ограничения резистор (1 кОм) в серии, и управлять ИК-светодиод с цифровой выходной порт дигитайзер оборудования.
    2. Используйте записи видео программное обеспечение в комплекте с камерой, если таковой имеется. Выберите самое высокое качество записи (например, сжатия без потерь) и самые высокие разрешения, поддерживаемые.
    3. Запустите видеозапись непосредственно перед началом записи УВБ и остановить запись видео непосредже после записи EOD.
    4. После записи преобразования номера кадров изображений на единицу времени дигитайзер по линейной интерполяции между первой и последней световых импульсов, захваченных дигитайзера сигнала и видеозаписи.
  5. Автоматизированная отслеживания изображения
    Инструкции написаны для MATLAB обработки изображения инструментов, и использовать его функций. Сценарий пользовательских MATLAB снабжен этого представления для автоматизированного отслеживания изображения.
    1. Импорт видео. Импортировать файл записи видео непосредственно в рабочем пространстве MATLAB, используя "Videoreader. Читать" функцию.
    2. Создание составного фоновое изображение путем объединения двух кадров изображения. Замените область изображения, занимаемое животного с пустующего образу и подобию аналогичного области от другого кадра (см. рисунок 3B).
    3. Укажите область изображения для отслеживания, опираясь круговую маску вокруг центральной арене, чтобы исключить AREA пределами (рис. 3В внизу), и умножить на константу (г десятичного) установить минимальный порог для разности интенсивности. Например, установка RINT = 0,85 будет подавлять флуктуаций интенсивности 15% = (1 - R INT) ниже фоновом режиме.
    4. Вычитание изображения. Вычесть изображения кадра (= IM к) от фонового изображения (IM = 0), чтобы получить разностное изображение (= ΔIM К). Используйте целое без знака точность вычислений для хранения значений интенсивности изображения в качестве неотрицательных целых чисел.
    5. Сегмент разница изображение путем применения пороговой интенсивности определяется из функции graythresh. Очистите бинарное изображение с помощью функции bwmorph и выберите самый большой каплю, соответствующий животного после расчета всех областей больших двоичных объектов с помощью функции regionprops.
    6. Определите центр тяжести и основную ориентациюXis из крупнейших каплей, применяя функцию regionprops, и повернуть изображение, чтобы выровнять большую ось с осью х. Разделите изображение на головной и хвостовой частей в центре тяжести (рис. 3D вверху).
    7. Определите основную ось головной части, и вращать все изображение, чтобы выровнять с ось х (рис. 3D внизу слева). Установите ограничивающие-боксы вокруг головы и хвоста части параллельно их основных осей с помощью функции regionprops.
    8. Определить средние у-координаты капля на левой, центральной и правой вертикальных ребер ограничивающих прямоугольников (зеленые точки на рисунке 3D нижней), и назначить их на пять очков объектов (руководитель-наконечник, в середине головы, середины тела , средне-хвост, хвост-наконечник).
    9. Процесс последовательных кадров после обрезки кадра изображения с центром в центре тяжести животного определяется из его предыдущего кадра.
    10. Вручную назначить ориентацию головы для первого кадра, и использовать Betwe скалярного произведенияан ориентационных векторов из двух последовательных кадров для автоматического определения ориентации головы. Проверьте результат, и вручную переворачивать ориентацию головы, если неправильно назначены.
  6. Участок траектории животных путем присоединения штаб-советы, и гладкой с помощью средней и средней фильтры (п = 3), если она имеет нервный вид. Наложение траекторию с фоновым изображением, и интерполировать рыбы средних линий с использованием пять очков функций (см. рис 2E).
  7. Вычислить среднюю скорость УВБ в каждый момент времени захвата изображения передискретизации мгновенную скорость EOD (100 частоту дискретизации Гц) и в среднем (временное окно 0,0625 сек). Участок траекторию в псевдо-цветов, определенных по времени соответствием EOD скорости, и наложить с фоновым изображением (см. рисунок 2F).

Результаты

EOD отслеживания результатов

Записанные EOD сигналы из разных пар электродов варьировалась в амплитуды и формы, как и ожидалось от их уникальных позиций и ориентаций (Рисунок 2C лучших). Использование нескольких пар электродов обеспечивается сильный прием сигнала ?...

Обсуждение

Значение наших методов. Таким образом, мы впервые описал строительство большого аквариума бака и сурдокамере наблюдать спонтанные разведочных поведения произведенные ВЭФ. Далее, мы продемонстрировали технику записи и отслеживания скорости УВБ и государства движение от безудер?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была щедро поддерживается естественным наукам и инженерным исследовательского совета Канады (NSERC) и Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Aquarium Construction
Electrically shielded floor heaterThermoSoft Corp., IL, USAThermoTilewww.thermosoft.com
Tempered glass panelgeneric0.5 in thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade siliconegeneric 
Acrylic sheetgeneric0.25 in thick, matte white
Natural rubber sheetgeneric0.25 in thick
ServomotorHTECHRCD Inc., KoreaHS-325HB, 180deg rotationwww.servocity.com
Servomotor arm mountHITECHRCD Inc., Korea56362 Large Splinewww.servocity.com
Servomotor controller (6 channels)SparkfunROB-09664Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cableC2G3899012 m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fanNutoneILFK120www.homedepot.com
Vertical aquarium filterTetra, GermanyWhisper Internal Power Filter - 40i 
Crushed coralUsed to increase the pH of the tank water
EOD Recording Setup
Graphite ElectrodesStaedtler, GermanyMars Carbon 2-mm type HBShave the outer coating
Physiological Amplifier/FilterIntronix, Canada2015F 
Coaxial CablegenericRG174For electrodes assembly
Coaxial CablegenericRG54For wiring use
BNC jack connector for RG-174Amphenol Connex112160For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54Amphenol Connex112116For wiring use
Signal digitizer hardwareCambridge Electronic Design, UKPower MKII 1401 
Signal digitizer softwareCambridge Electronic Design, UKSpike 2. ver 7 
Visual Tracking Setup
White LED lightIKEA, SwedenDIODER 201.194.18www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm)Scene Electronics, ChinaS8100-60-B/C-IRRemove built-in fan
USB webcamLogitech Inc., CA, USAC910Remove Infrared blocking filter
Motorized cameraLogitech Inc., CA, USAQuickcam OrbitRemove Infrared blocking filter
Video recording softwareLogitech Inc., CA, USALogitech Quickcam SoftwareDownload from www.logitech.com
MATLABMathworks, MA, USA2012aImage processing toolbox

Ссылки

  1. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  4. Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nat. Neurosci. 13 (4), 513-520 (2010).
  5. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  6. Mavoori, J., Millard, B., Longnion, J., Daniel, T., Diorio, C. A miniature implantable computer for functional electrical stimulation and recording of neuromuscular activity. In IEEE international workshop on biomedical circuits and systems (BioCAS) 2004; Session: Functional Electrical Stimulators and Related Sensing Techniques. , (2004).
  7. Harrison, R. R., Fotowat, H., Chan, R., Kier, R. J., Olberg, R., Leonardo, A., Gabbiani, F. Wireless neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE TBioCAS. 5 (2), 103-111 (2011).
  8. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Precision measurement of electric organ discharge timing from freely moving weakly electric fish. J. Neurophys. 107 (7), 1996-2007 (2012).
  9. Forlim, C. G., Pinto, R. D. Noninvasive Realistic Stimulation/Recording of Freely Swimming Weakly Electric Fish: Movement Detection and Discharge Entropy to Infer Fish Behavior. , (2012).
  10. Caputi, A. A., Aguilera, P. A., Castelló, M. E. Probability and amplitude of novelty responses as a function of the change in contrast of the reafferent image in G. carapo. J. Exp. Biol. 206 (6), 999-1010 (2003).
  11. Pluta, S. R., Kawasaki, M. Multisensory enhancement of electromotor responses to a single moving object. J. Exp. Biol. 211 (18), 2919-2930 (2008).
  12. Heiligenberg, W. Electrolocation and jamming avoidance in a Hypopygus (Rhamphichthyidae, Gymnotoidei), an electric fish with pulse-type discharges. J. Comp. Phys. A. 91 (3), 223-240 (1974).
  13. Capurro, A., Malta, C. P. Noise autocorrelation and jamming avoidance performance in pulse type electric fish. Bull. Math. Biol. 66 (4), 885-905 (2004).
  14. Post, N., von der Emde, G. The "novelty response" in an electric fish: response properties and habituation. Phys. Behav. 68 (1), 115-128 (1999).
  15. Toerring, M. J., Serrier, J. Influence of water temperature on the electric organ discharge (EOD) of the weakly electric fish Marcusenius cyprinoides (Mormyridae). J. Exp. Biol. 74 (1), 133-150 (1978).
  16. Ardanaz, J. L., Silva, A., Macadar, O. Temperature sensitivity of the electric organ discharge waveform in Gymnotus carapo. J. Comp. Phys. A. 187 (11), 853-864 (2001).
  17. Rodríguez-Cattaneo, A., Pereira, A. C., Aguilera, P. A., Crampton, W. G., Caputi, A. A. Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS One. 3 (5), (2008).
  18. Bennett, M. V. L., Hoar, W. S., Randall, D. J. . Fish physiology. , 493-574 (1971).
  19. Wong, C. J. Afferent and efferent connections of the diencephalic prepacemaker nucleus in the weakly electric fish, Eigenmannia virescens: interactions between the electromotor system and the neuroendocrine axis. J. Comp. Neurol. 383 (1), 18-41 (1997).
  20. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Real-time localization of moving dipole sources for tracking multiple free-swimming weakly electric fish. PLoS One. 8 (6), (2013).
  21. Rasnow, B., Assad, C., Hartmann, M. J., Bower, J. M. Applications of multimedia computers and video mixing to neuroethology. J. Neuro. Methods. 76 (1), 83-91 (1997).
  22. MacIver, M. A., Nelson, M. E. Body modeling and model-based tracking for neuroethology. J. Neuro. Methods. 95 (2), 133-143 (2000).
  23. Douglas, R. H., Hawryshyn, C. W., Douglas, R., Djamgoz, M. . Behavioral studies of fish vision: an analysis of visual capabilities. In The Visual System of Fish. , 373-418 (1990).
  24. Ciali, S., Gordon, J., Moller, P. Spectral sensitivity of the weakly discharging electric fish Gnathonemus petersi using its electric organ discharges as the response measure. J. Fish Biol. 50 (5), 1074-1087 (1997).
  25. Ratledge, D. An Introduction to Webcam Imaging. Digital Astrophotography: The State of the Art. , 31-44 (2005).
  26. Hofmann, V., Sanguinetti-Scheck, J. I., Gómez-Sena, L., Engelmann, J. From static electric images to electric flow: Towards dynamic perceptual cues in active electroreception. J. Phys. Paris. 107, 95-106 (2013).
  27. Castelló, M. E., Aguilera, P. A., Trujillo-Cenóz, O., Caputi, A. A. Electroreception in Gymnotus carapo: pre-receptor processing and the distribution of electroreceptor types. J. Exp. Biol. 203 (21), 3279-3287 (2000).
  28. Caputi, A. A., Castelló, M. E., Aguilera, P., Trujillo-Cenóz, O. Electrolocation and electrocommunication in pulse gymnotids: signal carriers, pre-receptor mechanisms and the electrosensory mosaic. J. Phys. 96 (5), 493-505 (2002).
  29. Pusch, R., et al. Active sensing in a mormyrid fish: electric images and peripheral modifications of the signal carrier. J. Exp. Biol. 211 (6), 921-934 (2008).
  30. Harder, W. Die beziehungen zwischen elektrorezeptoren, elektrischem organ, seitenlinienorganen und nervensystem bei den Mormyridae (Teleostei, Pisces). Z. Vgl. Physiol. 59 (3), 272-318 (1968).
  31. Bacelo, J., Engelmann, J., Hollmann, M., Gvonder Emde, ., Grant, K. Functional foveae in an electrosensory system. J. Comp. Neurol. 511 (3), 342-359 (2008).
  32. Hollmann, M., Engelmann, J., Von Der Emde, G. Distribution, density and morphology of electroreceptor organs in mormyrid weakly electric fish: anatomical investigations of a receptor mosaic. J. Zool. 276 (2), 1469-7998 (2008).
  33. Knudsen, E. I. Spatial aspects of electric fields generated by weakly electric fish. J. Comp. Phys. 99 (2), 103-118 (1975).
  34. Kramer, B. Spontaneous discharge rhythms and social signalling in the weakly electric fish Pollimyrus isidori (Cuvier et Valenciennes) (Mormyridae, Teleostei). Behav. Ecol. Sociobiol. 4 (1), 66-74 (1978).
  35. Stoddard, P. K., Markham, M. R., Salazar, V. L., Allee, S. Circadian rhythms in electric waveform structure and rate in the electric fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Physiol. Behav. 90 (1), 11-20 (2007).
  36. Canfield, J. G. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
  37. Chen, L., House, J. L., Krahe, R., Nelson, M. E. Modeling signal and background components of electrosensory scenes. J. Comp. Physiol. A. 191 (4), 331-345 (2005).
  38. Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp. (20), (2008).
  39. Windsor, S. P., Tan, D., Montgomery, J. C. Swimming kinematics and hydrodynamic imaging in the blind Mexican cave fish (Astyanax fasciatus). J. Exp. Biol. 211 (18), 2950-2959 (2008).
  40. Shapiro, L. G., Stockman, G. C. . Computer vision. , 367-368 (2001).
  41. Hedrick, T. L. Software techniques for two- and three-dimensional kinematic measurements of biological and biomimetic systems. Bioinsp. Biomim. 3 (3), 034001 (2001).
  42. Babineau, D., Lewis, J. E., Longtin, A. Spatial acuity and prey detection in weakly electric fish. PLoS Comp. Biol. 3 (3), (2007).
  43. Sanguinetti-Scheck, J. I., Pedraja, E. F., Cilleruelo, E., Migliaro, A., Aguilera, P., Caputi, A. A., Budelli, R. Fish geometry and electric organ discharge determine functional organization of the electrosensory epithelium. PLoS One. 6 (11), (2011).
  44. Castello, M. E., Caputi, A., Trujillo‐Cenóz, O. Structural and functional aspects of the fast electrosensory pathway in the electrosensory lateral line lobe of the pulse fish Gymnotus carapo. J. Comp. Neurol. 401 (4), 549-563 (1998).
  45. Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Y. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1), 127-134 (2004).
  46. Pereira, A. C., Centurión, V., Caputi, A. A. Contextual effects of small environments on the electric images of objects and their brain evoked responses in weakly electric fish. J. Exp. Biol. 208 (5), 961-972 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

85

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены