Наладка<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Модель крысы гематоэнцефалического барьера (ГЭБ): Фокус на BBB Герметичность и рецептор-опосредованного транспорта

Резюме

Цель настоящего исследования состояла в проверке воспроизводимости в пробирке BBB модели с участием крыс сингенной совместное культивирование эндотелиальных клеток и астроцитов. Эндотелиальных клеток монослоя представлены высокую TEER и низкую проницаемость LY. Экспрессия специфических белков TJ, функциональные ответы на воспаление и функциональность транспортеров и рецепторов были оценены.

Аннотация

Гематоэнцефалический барьер (BBB), специально регулирует молекулярную и клеточную потока между кровью и нервной ткани. Наша цель заключалась в разработке и характеризуют хорошо воспроизводимый крысы сингенной в модели пробирке ГЭБ, используя совместно культур первичных мозга крысы эндотелиальных клеток (РБЕС) и астроциты изучать рецепторы, участвующие в трансцитозом через эндотелия монослоя клеток. Астроциты выделяли механической вскрытия следующие трипсина пищеварения и были заморожены для последующего совместного культивирования. РБЕС были выделены из 5-недельных крыс коры. Головной мозг очищается от мозговых оболочек и белого вещества, и механически диссоциируют следующие ферментативного расщепления. После этого ткань Гомогенат центрифугировали в бычьего сывороточного альбумина, чтобы отделить фрагменты сосудов из нервной ткани. Фрагменты сосудов прошел второй ферментативного пищеварения освободить эндотелиальных клеток от их внеклеточного матрикса. Остальные загрязняющие клетки, такие как перицитов были Further устранены путем посева фрагменты микрососудов в пуромицина среде, содержащей. Затем они были пассируют на фильтров для совместного культивирования с астроцитов, выращенных на дне лунки. РБЕС выразил высокие уровни плотного контакта (TJ) белки, такие как occludin, Claudin-5 и ZO-1 с типичной локализации в клеточных границ. Трансэндотелиальный электрическое сопротивление (TEER) головного мозга эндотелиальных монослоев, что указывает на герметичность ТТ достиг 300 Ом · см ² в среднем. Эти коэффициенты по проницаемости эндотелия (PE) для Люцифера желтого (LY) был очень воспроизводимые в среднем 0,26 ± 0,11 × 10 ^-3 см / мин. Эндотелиальных клетках головного мозга, организованные в монослоев выразил отток транспортера Р-гликопротеина (P-GP), показали, поляризованный транспорт родамином 123, лиганда для P-GP, и показал конкретную перевозку трансферрина-Cy3 и DiILDL через эндотелия монослоя клеток. В заключение, мы предоставляем протокол для создания в пробиркеBBB модель, которая является очень воспроизводимые из-за методов обеспечения качества, и который подходит для исследований в области BBB перевозчиков и рецепторов.

Введение

Многие препараты, разработанные для лечения центральной нервной системы (ЦНС), не могут прийти к паренхимы мозга в терапевтически значимых концентрациях. BBB защищает нервную ткань головного мозга от флуктуации состава плазмы, от патогенных агентов, а также поддерживает гомеостаз паренхимы мозга, ограничивая неспецифический поток ионов, пептидов, белков и даже клеток в и из мозга ^1.

BBB характеристики индуцированных и поддерживается интимной близости и перекрестных помех между специализированная класса мозг микрососудов эндотелиальных клеток и соседних элементов нейро-глии-сосудистой блока (NGVU), таких как нейроны, глиальные клетки (точнее астроцитов конечным футов), и перициты ensheathed в базальной мембране, которая состоит в основном из коллагена типа IV, фибронектин, ламинин и протеогликанов ^2,3. Перициты покрывают примерно 22 - 32% от эндотелия на уровне капиллярного и играют важную роль вроль в регулировании пролиферации эндотелия, ангиогенеза и воспалительных процессов. Эндотелиальные клетки образуют непрерывный лист, покрывающий внутреннюю поверхность капилляров. Они соединены друг с ТТ, которые образуют структуру ленты, как в апикальной области и которые способствуют поляризации клеток. Астроциты регулировать свойства BBB и являются источниками важных регуляторных факторов, таких как TGF-β, GDNF, оФРФ и IL-6. Астроциты дефицитные по GFAP с неполной функциональностью не в состоянии регулировать BBB свойства ^4. Нейроны непосредственно не вовлечены в структурно формирования BBB но также регулировать важные аспекты экспрессии белка и BBB функций ^5.

В целях дальнейшего изучения структуры, физиологию и патологию BBB, модели в пробирке из ГЭБ были разработаны в качестве исследовательских инструментов. Эндотелиальных клетках головного мозга были извлечены из различных видов осуществить в пробирке моделей на основе BBBна низких проходных первичных культур из бычьего ^6,7, свиней ^8,9, крысы ^10,11,12, мыши ^13, а также человеческой ^14,15. Эти модели известны, чтобы имитировать в естественных условиях BBB, особенно при совместном культивировании с глиальных клеток от крысы или мыши и / или перицитов ^16,12 и / или нейронных клеток-предшественников, полученных астроцитов ¹⁷ и / или ¹⁸ нейронов. Модели "в лаборатории" часто производятся от грызунов, поскольку они позволяют в пробирке естественных условиях экспериментов / в и сравнений и / или изучения мозга эндотелиальных клеток, полученных из трансгенных моделей ^19.

Недавно разработанный в пробирке моделей BBB также был разработан, чтобы помочь предсказать поглощение мозга потенциальных кандидатов наркотиков ЦНС до исследования на живом ^{15,20,21,3,6,22,11,23.} В пробирке модели BBB обычно используется для сравнения транспортировка наркотиков с: I), известного проникновения в ЦНС или с лвл проницаемость через ВВВ и никаких центральных эффектов, и б) очевидны Pe из тех же препаратов, измеренных в моделях на животных того же вида. Препараты, которые легко проходить через ГЭБ в основном липофильным и пересекают мембраны эндотелиальных клеток головного мозга путем опосредованного липидами свободной диффузии (кофеин, карбамазепин и т.д.). Отрицательно транспортируемые препараты, такие как дигоксин, верапамил или циклоспорина А активно экструдируют на мозг эндотелиальных эффлюкса транспортеров, такие как п-GP. Тем не менее, многие из недавно разработанных терапевтических молекул биофармацевтических, такие как рекомбинантные белки, киРНК или моноклональных антител. Большинство из них не проникает через ГЭБ за счет: I) отсутствие конкретных перевозчиков, и II) плотно набитый слой эндотелиальных клеток, которые препятствуют высокомолекулярных молекул от прохождения парацеллюлярного проход. С этих пределах, "троянского коня" стратегии были реализованы с использованием векторов (антитела, пептиды) против известных рецепторов на BBB, участвующих ян рецептор опосредованного транспорта или трансцитоз (RMT), такие как трансферрин (T) рецепторов (TfR), рецептора инсулина (ИК), или членов рецептора ЛПНП (LDLR), связанных рецепторов семью (LDLR, LRP1). Такие рецепторы были обнаружены на отдельных капилляров головного мозга и в BBB в естественных ^24,25. Транскрипционные профили для этих рецепторов, в частности к семейству LDLR, были проанализированы и сравнены между эндотелиальных клетках головного мозга и эндотелиальных клетках головного мозга совместно культивировали с астроцитов или в капилляров головного мозга непосредственно после их извлечения из мозга ^26. Pardridge ²⁴ открыт поле с антителом OX-26 против рецептора трансферрина (TfR), а затем антител против рецептора инсулина и фактора роста инсулина рецептора ^27,28. С помощью этих векторов антител основе, ArmaGen Технологии разработала технологию лошадь платформы ВВВ молекулярную Trojan для доставки лекарств, в том числе белков, через ГЭБ ^29.литература богата данных, свидетельствующих LRP1 выражение в эндотелиальных клетках головного мозга и его роль в качестве мощного эндоцитотический / мусорщика рецептора. Вестерн-блот анализ предположил, что LRP1 определяется в долях, обогащенных капилляров головного мозга крысы и в капиллярных эндотелиальных клетках головного мозга ^30. Такие компании, как Angiochem целевой LRP1 с пептидных векторов, полученных из апротинином, которые способствуют эффективной приток наркотиков через ГЭБ ^31. Тем не менее, LRP1 также участвует в активном транспорте Ар и его оттока / оформление от паренхимы мозга с кровью ^32. Такие данные включают в LRP1 двунаправленного транспорта через ВВВ в зависимости от его лигандов. biOasis развивает технологию Transcend с использованием белка melanotransferrin для перевозки биопрепаратов, таких как лизосомальных ферментов и антител через ГЭБ ^{33, одновременно} VECT-HORUS развивается пептидные векторы, которые ударят по LDLR ^34. Там данные о том, что LRP и LDLR может быть использован для транспортировки РазницаМолекулы, такие как отлична лизосомальных ферментов ^35,36 наночастиц или комплексов через ВВВ ^37.

Наша сфера интересов находится доставки лекарств в ЦНС с использованием векторной молекулы и векторизованные наркотиков-кандидатов для лечения заболеваний ЦНС. В частности, для доставки лекарственных через ГЭБ должен быть рассмотрен в контексте Neuroinflammation, процесс, который могут быть в своей степени, но это, вероятно, общим для всех поражений ЦНС и болезней, в том числе энцефалит, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера и т.д. Neuroinflammation связано с BBB воспаления и потенциально с изменениями в BBB физиологии и проницаемости, учитывая, что парацеллюлярная и трансцеллюлярного транспорт может быть усилен при патологических состояниях ^{38,39,40,41,42,43.} Например, TNF-α, настроить и другие цитокины модулируют воспаление, и эксперименты с в пробирке моделей BBB показали, что они могут изменить трансклеточном свойства гое монослой эндотелиальных клеток ^38,39,40 и что TNF-α также приводит к увеличению трансцеллюлярного транспорта LDL ^{41, 42} holotransferrin и лактоферрин ^43.

Наша цель заключается в разработке и охарактеризовать оптимизированы и высокую воспроизводимость крыса сингенными BBB модель с использованием совместно культур первичных эндотелиальных клетках головного мозга и астроцитов. Мы использовали 5 недельных и неонатальных крыс линии Вистар для производства мозг эндотелиальных клеток и производства астроцитов соответственно. Одна из проблем в том, чтобы создать протокол, позволяющий производство "еженедельно воспроизводимых" моделей BBB. Для достижения этой цели, каждый шаг протокола производства была выполнена на определенные дни недели, начиная с производства мозг микрососудов в среду первой недели. Вскрытия проводились почти каждую неделю в течение последних 3 лет. Для дальнейшего улучшения воспроизводимости культур, была создана система обеспечения качества. Все ReageNц и химические вещества были ссылки в базе данных (дата вступления, фондовом, срок годности, и т.д.).

Модель характеризуется после ряда критериев, таких как организации эндотелиальных клеток и чистоты, TEER, LY проницаемость, ответ на провоспалительных агентов, качественного и количественного выражения TJ белков, функциональности эффлюкса перевозчиков, таких как P-GP, и рецепторов участие в трансцитозом через эндотелия монослоя клеток, таких как TfR или LDLR.

протокол

1. Производство Rat астроциты

Для каждого препарата использовать 10 новорожденных крыс линии Вистар обоего пола.

1. Жертвоприношение крыс на режущих головок с ножницами и передавать их сразу в сухом чашку Петри под ламинаре. Удалить мозги из черепа без мозжечка и передавать их непосредственно в чашку Петри, содержащую холодного буфера рассечение: HBSS с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (низкий уровень эндотоксина BSA), пенициллин 100 ед / мл стрептомицина и 100 мкг / мл.
2. Отрежьте голову пополам, отделить 2 полушария головного мозга и передавать их в чистую чашку Петри с рассечение буфера на льду. Разрежьте зрительный нерв и удалить мозговые оболочки под стереомикроскопом.
3. Вымойте корковых куски широко в 50 мл холодного буфера рассечение.
4. Поместите корковых части от 3 мозгов в 15 мл трубки Сокол и отделить с помощью пипетки вверх и вниз переворотаLe раз с 10 мл пипеткой, снабженной наконечником синего в 6 мл 0,05% трипсина - 0,02% ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С
5. Добавить 24 мл DMEM с добавлением 10% FBS и следующие антибиотики, пенициллин 100 ед / мл и стрептомицин 100 мкг / мл, медиа имени глиальных клеток информации (ГКМ) и центрифуге при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. FBS партии были отобраны и проверены для роста и выживания астроцитов cutures.
6. Ресуспендируют гранул, содержащий разложенных клеток в 10 мл GCM и пластины в 75 см ² Т-колбы (T75). Измените среду на следующий день, чтобы удалить остатки клеток и ДНК. Замените питательных сред два раза в неделю.
7. Через 1 неделю пролиферации, осторожно встряхните глиальных клеток с круговой качалке при 60 оборотах в минуту в течение 24 часов при температуре 37 ° С в ГКМ. Если T75 не могут быть помещены в инкубатор с 5% CO _2/95% воздуха при 37 ° C увлажненной атмосфере, дополнить носитель с 5 мМ HEPES. Вымойте клетки дважды галить неадгезивные клеток микроглии.
8. Через три недели после посева, промыть клетки дважды DPBS без кальция и магния. Добавить 3 мл теплой 0,05% трипсина-ЭДТА 0,02%, инкубировать при 37 ° С и ждать, пока слой клеток не рассеивается (обычно 5 мин). Блокировка активности трипсина путем добавления 10 мл ГКМ, передача клеточной суспензии в 15 мл сокола трубки и центрифуге при 120 х г в течение 8 мин.
9. Ресуспендируют осадок в астроцитов 90% FBS - 10% DMSO, передать их в криопробирки (2 х 10 ⁶ клеток на криопробирку) и хранятся в жидком азоте.

2. Выделение мозга крыс микрососудов

Наши экспериментальные процедуры утверждаются Комитета по этике медицинского факультета Марселя на и соответствовать национальным и европейским нормам (Директива ЕС № 86/609). Все усилия были приложены к минимуму страданий животных и уменьшить количество животных, используемых.

1. Для каждого препарата и в течение одного experimenteг, использовать 3 пять недельных крыс линии Вистар.
2. Понедельник первой недели, готовить 2 колбах Т75 путем нанесения коллагена типа IV и фибронектина, как на 1 мкг / см ² в стерильной культуральной водой (10 мл на одно T75). Разрешить не придерживаться при 37 ° С до тех пор, микрососудов посева.
3. В среду утром в первую неделю, усыпить крыс под увеличением потока СО _2, чтобы вызвать сонливость, потеря осанки и дыхания перерыва, затем следуют смещения шейных позвонков. Спрей головы с 70% этанола. Отрежьте голову с ножницами и передавать их в сухую чашку Петри под ламинаре.
4. Удалить мозги из черепа без мозжечка и зрительных нервов, затем передать их в чашку Петри охлаждали на льду и наполнен холодной рассечение буфера (HBSS с добавлением 1% BSA, пенициллин 100 ед / мл стрептомицина и 100 мкг / мл) .
5. Отрежьте голову пополам, чтобы отделить 2 полушария головного мозга и отдельный средний мозг из заebrain. Трансфер переднего мозга в чистую чашку Петри на льду с рассечение буфера.
6. Возьмите пару полушарий в новом чашку Петри с холодной рассечение буфера тщательно удалить мозговые оболочки из переднего мозга под стереомикроскопом с N ° 5 пинцетов. Затем очистите внутреннюю часть мозга, чтобы удалить одеяло миелина и получить оболочку мозга. Эти шаги не должны принимать более 2 час для сохранения тканей и выживаемости клеток.
7. Диссоциируют в кору от 3 мозгов в 6 мл холодного буфера рассечение в 7 мл Dounce гомогенизатор на 10 вверх и вниз ударов с каждого из 2 пестики различных зазоров, 71 мкм с последующим 20 мкм.
8. Разделить суспензии, чтобы получить эквивалент 1 коры в 1 мл 50 мл сокола трубки и центрифуге при 1000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант.
9. Дайджест подвеску с 1 коры с 1 мл ферментативного раствора, содержащего смесь коллагеназ / диспазы (60 мкг / мл R11; 0,3 ед / мл), тип ДНКазы I (35 мкг / мл - 20 K единиц / мл) и гентамицин (50 мкг / мл) в шейкере в течение 30 мин при 37 ° С
10. Смешайте 1 мл переваривают с 1 коры с 10 мл 25% BSA / HBSS 1X и отдельный от плотности зависимой центрифугированием при 3600 х г в течение 15 мин при комнатной температуре. Тщательно передачи верхний диск (миелин и мозг паренхимы) и супернатант в чистую 50 мл сокола трубки и повторить центрифугирование. Хранить Полученный осадок, содержащий микрососудов мозга при 4 ° С.
11. Осторожно отбросить верхний диск и супернатант. Ресуспендируют обе полученные гранулы, содержащие микрососудов мозга с 1 мл холодного HBSS 1X и передачи в чистом 50 мл сокола трубки.
12. Промыть микрососудов добавлением 20 мл холодной HBSS 1X и центрифуге при 1000 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант.
13. Кроме того переварить микрососудов мозга от 1 с 1 мл того же раствора ферментного как описано в стадии 2,9 в течение 1 ч при 37 ° С в шAker.
14. Затем смешать переваренных микрососудов от каждой из 3 коры в одну пробирку и далее разделить на две 50 мл пробирки Фалкон получить микрососудов, извлеченные из эквивалент полутора (1,5) коры на пробирку. Добавить 30 мл буфера холодной рассечение и центрифуге при 1000 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре.
15. Ресуспендируют осадок микрососудов в 10 мл DMEM/F12, дополненной 20% бычьей плазмы, обедненной тромбоцитами, полученной сыворотке, основной фактор роста фибробластов (оФРФ, 2 нг / мл), гепарина (100 мкг / мл), гентамицин (50 мкг / мл) и HEPES (2,5 мМ), названный эндотелиальных клеток медиа (ECM) с добавлением пуромицин на 4 мкг / мл.
16. Возьмите 2 покрытые колбах Т75 из инкубатора, аспирации избыток покрытия и пластины микрососудов от каждой трубы в одном T75 колбу (микрососудов, извлеченные из 1,5 коры на T75 колбу).

3. Очистка и размножение РБЕС Primocultures

1. Очистка: со среды по пятницу, добавить puromycin на 4 мкг / мл в культуральной среде. Изменение среды на четверг. В пятницу, не мыть клетки и добавить пуромицина на 2 мкг / мл до понедельника.
2. Распространение: в понедельник второй недели, промыть клетки и добавить инсулин, трансферрин и дополнения селенит натрия в культуральной среде до культуры не достигают 90% слияния в среду второй недели.

. 4 Дифференциация: Настройка Модель Экстракорпоральное ВВВ

1. Понедельник второй недели, подготовить фильтры (полиэтилен, 12 лунок, размер пор 1,0 мкм) путем нанесения смеси коллагена типа IV и фибронектина как на 0.5μg/cm ² в стерильной культуры воде (500 мкл смеси в верхнем отделении и 1,5 мл стерильной культуральной воды в нижнем отделении). Разрешить не придерживаться при 37 ° С до тех пор, РБЕС посева.
2. Понедельник второй недели, за пять дней до установления совместного культивирования, промойте астроциты от криопробирки при 37 ° С и передачив 15 мл сокола с 10 мл ГКМ. Центрифугируют суспензию с 120 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре.
3. Ресуспендируют осадок в астроцитов ГКМ и пластины с плотностью 30 х 10 ³ клеток на см ² в 12-луночных планшетах.
4. Среде на второй неделе, как раз перед диссоциации трипсином РБЕС, мыть два раза фильтр предварительно покрытую среде DMEM/F12. Предварительно заполнить камеры с ECM: 1,5 мл в нижнем отделении и 0,5 мл в верхний отсек.
5. Среда второй недели, мыть два раза РБЕС с DPBS без кальция и магния. Добавить 4 мл теплой трипсина 0,05% - ЭДТА 0,02% раствора при 37 ° С в T75 колбу во время 30 сек точно. Затем снять 3,5 мл раствора трипсина и наблюдать под микроскопом. Когда слой клеток начинает отделяться от матрицы, помочь им, осторожно нажав на край T75 колбу, пока все клетки не плавают.
6. Добавить 9 мл ECM на T75 колбу и передать в 15 мл трубки Сокол. Очень аккуратно отделить ячейкуподвеска помощью пипетки вверх и вниз 4 раза с 10 мл пипетки, снабженной наконечником желтого (производство избежать пузырьков в растворе). Граф клеток в суспензии (примерно 3 х 10 ⁶ cells/T75) и сразу же пластины на предварительно покрытых и предварительно заполненных фильтров с высокой плотностью (160 х 10 ³ клеток / фильтра, следовательно, около 18 filters/T75) (рис. 8 ). На следующий день (четверг), изменить два раза среду верхний отсек для удаления остатков клеток.
7. Четверг второй недели, за день до установления совместного культивирования, замените астроцитов питательных сред на 1,5 мл среде для дифференцировки (ECM гидрокортизоном при 500 нМ), которые могут быть дополнены с 1/3 кондиционированной среды от базальной отсеке предыдущего совместное культивирование (3 дня контакта между эндотелиальных клеток и астроцитов).
8. Пятница второй недели определяется как день 0 дифференциации; заменить питательные среды от Конта фильтровining в РБЕС с дифференцировки. Перенесите РБЕС фильтры в лунки, содержащие астроциты. В этих условиях, модели в пробирке дифференцировать и выразить распределительные связанных белков в течение 3 дней.
9. Модели держать их оптимальную дифференциацию в течение более 3 дней, с понедельника по среду третьей недели.

Результаты

Протокол Производство
Протокол можно разделить на 3 этапа, соответствующих серьезных изменений в медиа состава культуры: (а) очистки эндотелиальных клеток из микрососудов, (б) распространения, и (в) дифференциации на фильтрах (полиэтиленовые пластины 12-а с пористостью 1 мкм) в совместной культуре с астроцитов. Были назначены Различные этапы протокола производства в определенные дни недели с целью повышения воспроизводимости первичных клеточных культур (рис. 1). В среду первой недели, следовательно, 9 дней до создания системы сокультуры, микрососудов были выделены (рис. 2а). Для очистки эндотелиальных клеток, культуры были сохранены в присутствии уменьшением концентрации пуромицин течение 5 дней. Большинство загрязняющих клетки (в основном перицитов) были устранены и рост эндотелиальных клеток были ниже, без изменения их фенотипа. Шпиндель-ыhaped клетки растут из капиллярных фрагментов, выделенных из мозга крысы серого вещества (рис. 2В). В понедельник второй недели, крысы астроциты высевали на нижней части 12-луночных планшетах. Среда, РБЕС были добавлены к просвета отсеке фильтров. Высокая плотность посева на 160 х 10 ³ клеток / см ² (фиг. 2С) помогает избежать разрывов на периферии фильтра (фиг. 2D) и генерирует однородную дифференцировку эндотелиальных монослоя клеток. Клетки показывают типичную удлиненную веретенообразную морфологию, выровнять в продольном направлении, и образуют единую монослой. Четверг, астроцитов питательная среда была изменена для дифференциации среды, кондиционированной с предыдущим сокультуры информации (Рисунок 2E). Среда, РБЕС на фильтрах выращивали в культуральной среде, содержащей 500 нМ гидрокортизона и фильтры были переданы в 12-луночные планшеты, содержащие астроцитов. На третьей неделе, эксперименты сопрежде чем выполняется с понедельника по среду.

РБЕС Характеристика и определения элементов монослоя проницаемости
РБЕС характеризовались иммунным окрашиванием эндотелиальных и BBB маркеров, а также измерений, TEER проницаемости LY и функциональности эффлюкса транспортеров, такие как п-GP.

РБЕС получены методом очистки пуромицину (рис. 1 и 2) вырос в непересекающихся непрерывных монослоев, что выставлены ингибирование роста при стечении и отображается плотно соединенный веретеновидно и шпинделя формы морфологию. РБЕС культуры выразил типичные маркеры эндотелиальных клеток: они показали положительный иммуноокрашивания для тромбоцитов эндотелия молекулы клеточной адгезии (рис. 3А; CD31/PECAM) и экспрессии фактора фон Виллебранда (рис. 3В). Без лечения пуромицина, RBECs быстро вторглись перицитами обнаруженных десмин immunosTaining (рис. 3C). Глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP), выраженный астроцитов (фиг. 3D) является важным маркера дифференцировки астроцитов. С числа Высоковольтный проезд, астроциты теряют способность индуцировать дифференцировку эндотелиальных клеток. По этой причине, астроцитов культуры были стандартизированы для своего времени культуры и только прошли одно место.

Культивирование РБЕС с среде с гидрокортизоном, а затем совместного культивирования с астроцитов и с кондиционированной среды от нижнего отсека предыдущих совместных культурах привело к сильной индукции межэндотелиальных ТТ по сравнению с РБЕС культивируют в покое. Клетки выражена Claudin-5, ZO-1 и occludin белки, которые были локализованы в межклеточных соединений, как показано с помощью иммунофлуоресценции (Фиг.4В-D) и, обнаруженные вестерн-блот анализа для ZO-1 и occludin белков (рис. 4E ). Морфологическое распределение в точке слокоть-клетка контакты в конфигурации застежки-молнии, как отражает (а) плотность монослоя, (б) головного происхождение из клеток эндотелия капилляров, и (с) характерна очень дифференцированных эндотелиальных клеток головного мозга. Парацеллюлярной проницаемость эндотелиального слоя контролировали путем измерения TEER и скорость притока LY (457 Да) от верхней до нижней отсеке фильтров. TEER измеряли с использованием ENDOHM-12 для 12 мм чашках культуры, соединенных с EVOM voltohmmeter. TEER головного мозга эндотелиальных монослоев, что указывает на герметичность ТТ достиг 300 Ом · см ² в среднем (фильтры 12-луночные планшеты, данные не показаны). Пе для LY (Пе _(LY), используется в качестве контроля целостности барьера и совместно инкубировали с тестируемых соединений) достигла в среднем 0,26 ± 0,11 × 10 ^-3 см / мин (рис. 4F) над период 1 год.

Для того, чтобы вызвать воспаление РБЕС мы использовали пр.о-воспалительный цитокин TNF-α в 5 нг / мл в течение 24 ч, а затем и воспалительную реакцию путем измерения CCL2 (MCP-1) секрецию РБЕС в верхнем отсеке системе культуры, которые в два раза от 120 нг / мл (не Обработанный контроль) до 250 нг / мл (фиг.5А). TNF-α в лечение 5 нг / мл или 50 нг / мл в течение 24 ч также открыли BBB как показали Pe _(LY) измерения (фиг. 5В).

P-GP визуализировали в дифференцированной РБЕС по иммуноцитохимия (рис. 6А). Локализация P-GP, как известно, сильно поляризован и выражали по существу в апикальной мембране эндотелиальных клеток ^44, а транспортер Глутамат-1 (GLT-1) в основном в базолатеральной фракции ^45. Чтобы оценить степень поляризации нашего культурного РБЕС, вершинные и базолатеральных белки отделить от плазмы мембранных препаратов с использованием сахарозы градиенты плотности ^46. Вестерн-блот анализ былДля оценки уровней экспрессии P-GP и GLT-1 в плазме, апикального и базального мембранные препараты. Микрососуды недавно извлеченные из мозга крысы были использованы в качестве ближайших положительного контроля в распределении в естественных условиях этих белков (рис. 6б). В обоих микрососудов и дифференцированных РБЕС мембранных препаратов, была выражена P-GP как группа 170 кДа, в основном локализуется в F1 апикальной мембранной фракции (рис. 6В, C). GLT-1 выражение действительно выражается в F3 базальной мембранной фракции микрососудов в виде полосы 65-70 кДа, но не был обнаружен в культуральном РБЕС.

В параллельных экспериментах, функциональная активность P-GP в эндотелиальных монослоя клеток тестировали с использованием родамин 123 (R123) в качестве лиганда. Abluminal к просвета (B к A) оттока R123 в 1,7 раза выше, чем в противоположном направлении (рис. 6D). Чтобы доказать P-GP участие, мы использовали специфические ингибиторы P-GP, verapamiл (25 мкМ, 30 мин) и инкубация циклоспорин А (1 мкМ, 30 мин предварительной инкубации). С верапамилом и лечения циклоспорином, накопление R123 в РБЕС была увеличена 1,6 раза и в 2 раза соответственно, по сравнению с необработанным контролем (фиг. 6E).

Рецепторы, участвующие в рецептора опосредованного трансцитоза (RMT) Механизмы
Эта модель была дополнительно характеризуется для экспрессии различных рецепторов, потенциально участвующих в механизмах трансцитоза на BBB, таких как LRP1, LDLR или TfR (фиг. 7А).

Функциональные транспортные исследования проводились с лигандами для TfR и LDLR. Текущие РБЕС инкубировали с трансферрином крысы, меченное Cy3 (TF-Cy3) в течение 180 мин при 37 ° С (фиг.7В, С). Количественная оценка поглощения Т-Cy3 и транспорта у крыс в пробирке модель BBB показали, что наклон кривых незначительно снизился за 2400 пкмольс (рис. 7B), предполагая, что связывание / поглощение было насыщаемым. Кроме того, насыщение связывания / поглощения коррелирует с накоплением Tf в нижнем отделении. Чтобы подтвердить это наблюдение, Т-Су3 инкубировали при 1200 пикомолей (восходящей части кривой) с избытком нефлуоресцентного Tf в 4800 пикомолей (плато / насыщенность) (рис. 7C). Эти эксперименты показали снижение накопления Т-Cy3 в нижнем отделении и подтвердил насыщающегося механизм типичный взаимодействия лиганд-рецептор в нашей в пробирке BBB модели.

Точно так же, функциональность LDLR была продемонстрирована поглощения и перевозке его лиганда DiILDL через эндотелиальных клеток монослоя (рис. 7D, E). Живая РБЕС инкубировали с DiILDL в течение 30 мин при 37 ° С Связывание / поглощение не коррелировало с накоплением DiILDL в нижнем отделении (рис. 7D). Количественная оценка DIILDL транспорта показал, что наклон кривых снизилась за 2 мкг, предполагая, что транспорт был насыщаемым и рецепторов, связанных в нашей модели. Азид натрия добавляли 0,05%, за 15 мин до DiILDL инкубации (рис. 7д). Отсутствие токсичности азида натрия инкубации в 0,05% оценивали с помощью РЕ _(LY) измерения (данные не показаны). Эти эксперименты показали, уменьшилось накопление DiILDL в нижнем отделении. В целом, наши результаты показывают, RMT для DiILDL в нашей в пробирке BBB модели.

Другие модели Экстракорпоральное BBB, основанные на эндотелиальных клеток из спинного мозга крысы или мозга мыши
Переваривание ферментом со смесью коллагеназы / диспазы является одним из важнейших параметров для управления с точки зрения жизнеспособности клеток и производственной выходом мозговых микрососудов. Концентрация фермента и что более важно соотношение между количеством фермента по отношению к ткани, нГКПЗ быть откалиброван точно между мозга крысы, спинного мозга крысы и мыши мозга. Микрососудов плотность посева и количество эндотелиальных клеток, чтобы достичь 90% слияния (9 дней после микрососудов посев) были связаны между собой и являются важными параметрами для улучшения роста клеток, ограничивающие количество удвоение населения и качества моделей. Крысы спинного мозга микрососудов были произведены с тем же протоколом, описанному в настоящем документе для микрососудов головного мозга крыс (в плане количества ткани, 2 спинного мозга, соответствующих примерно 1 мозга), чтобы получить такое же количество клеток на колбу Т75 в том же временном масштабе . Мозговых оболочек из 5-недельных C57BL6 мышей мозга были трудно устранить, потому что они придерживаются коры. Краткое лечение головного мозга с диспазы появляется, чтобы облегчить удаление мозговых оболочек. Важными параметрами, которые способствуют производстве воспроизводимых эндотелиальных клеток монослоев из головного мозга крысы, спинного мозга крысы и мыши мозга выделены и суммированы вРисунок 8.

Рисунок 1. Блок-схема, суммирующий основные этапы в пробирке BBB подготовки модели. Были назначены Различные этапы протокола производства в определенные дни недели с целью повышения воспроизводимости первичных культурах эндотелиальных клеток. Протокол начинается в среду первой недели, с производством микрососудов от 5-недельных крыс Вистар.

Рисунок 2. Фазового контраста микрофотографии РБЕС, астроциты и системы сокультуры. (A) 5-недельных Вистар фрагменты крыса микрососудов на момент покрытие из.(B) Три дневных культур РБЕС обработанные в течение 2 дней с P-GP подложки пуромицин при 4 мкг / мл. (С) Чистые сливные эндотелиальные монослои на 1 день после посева на фильтрах Millipore в 12-луночный планшет, покрытый коллагеном типа IV и фибронектина. (D) Однородность клеточного монослоя на периферии фильтра вставки. (Е) Сливной астроцитов культура в день создания совместного культивирования показывая охарактеризованный сотовую морфологию. (F) Схема, представляющая совместное культуры Система с локализацией микрофотографий в C, D и E.

Рисунок 3. Характеристика РБЕС культур иммунофлуоресценцией микроскопии. (А) эндотелиальных клетках головного мозга выразить тромбоцитов эндотелиальных клетокPECAM/CD31 молекула адгезии на границе ячейки, (B) фактор Виллебранда (VWF) показывает относительно точечный окрашивание, ярче и собраны в некоторых клетках, чем другие, и концентрируют в околоядерной зоны. (C) Без пуромицин лечения РБЕС культуры, перициты обнаруживаются с положительным иммуноокрашивания для десмина (в зеленом) и имеют характерные небольшие круглые ядра. (D) Астроциты выразить глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Иммуноцитохимическая характеристика крысы в пробирке модель BBB и трансклеточном проницаемостиLY через эндотелия монослоя. Клеточный монослой иммуноокрашиванию с (А) виментина выявить сливающийся монослой мозга эндотелиальных клеток с неперекрывающихся морфологии и шпиндель формы клеток с эндотелиальной морфологии и экспрессии труднодоступных белков соединительных (В) Claudin-5 , (C) ZO-1 и (D) occludin, также обнаружены помощью вестерн-блоттинга для ZO-1 и occludin белков (Е). (F) монослоя герметичности в модели 12-луночный BBB оценивали измерением перенос Lucifer желтый (LY-СН, дилитиевая соль), небольшой гидрофильные молекулы (МВт 457 Da), как известно, остается у BBB. Вкратце, LY инкубировали в верхнем отсеке системе культуры в контакте с эндотелиальными клетками головного мозга в течение 60 мин при 37 ° С По истечении этого времени, среда нижнего отсека собирали и флуоресценции количественно с помощью люминесцентного анализа с spectrofluorimetэ с возбуждением при 430 нм, и излучения на 535 нм. Результаты выражены в проницаемости или Pe в 10 ^-3 см / мин. Барьер считается проницаемым или открытым, когда Pe из LY выше 0.6x10 ^-3 см / мин. В каждом эксперименте 1 ч, средний объем очищен наносили на график в зависимости от времени и наклон оценивается линейного регрессионного анализа. Наклон кривой зазора для контроля фильтров с коллагена типа IV-фибронектин покрытием был обозначен PSF и наклон кривой зазора для фильтров с мозга эндотелиальных клеток монослоев был обозначен PST. Значение PS для эндотелия монослоя (PSE) рассчитывали из: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Значения PSE были разделены на площадь ПорOUs мембрана (1,1 см ² для фильтров Millipore 12-луночных планшетах) и результат был коэффициент проницаемости (Ре) в среднем 0,26 ± 0,11 × 10 ^-3 см / мин. Результаты представлены вертикальной рассеяния представления участка для п = 90 анализов (среднее значение из п = 3 в N = 6 монослоев в анализе).

Рисунок 5. В пробирке BBB модель ответ на лечение с провоспалительного агента TNF-α. Культуральные среды из системы культуры был заменен непосредственно перед TNF-α в лечении 5 нг / мл в верхнем отсеке в течение 6 часов, 12 часа и 24 часа в сутки. CCL2 релиз РБЕС количественно в верхнем отсеке иммуноферментным методом анализа в сравнении с необработанным контролем. Следует отметить, что МСР-1 немного увеличить уровни как функции времени, Даже в не-обработанных скважин. Целостность эндотелиальный клеточный барьер, измеренной эндотелиальной Pe для LY Pe _(ют) показал увеличение проницаемости монослоя на 24 ч лечения TNF-α в 5 нг / мл или 50 нг / мл в диапазоне от 0,62 ± 0,02 х 10 ^{- 3} см / мин и 0,7 ± 0,01 × 10 ^-3 см / мин соответственно, по сравнению с контролем на 0,33 ± 0,03 × 10 ^-3 см / мин (т-критерий Стьюдента, р <0,05).

Рисунок 6. Функциональные возможности P-GP оттока транспортера и РБЕС поляризации. Выражение оттока транспортера Р-GP в эндотелиальных клетках головного мозга совместно культивируемых с астроцитов по иммуноцитохимии (А) и вестерн-блот (B & C). Клеточная мембрана белки экстрагировали с клеточный белок фракционированияТион комплект. Плазменные мембраны были получены гипотоническим лизисом и дифференциальных центрифугирования устранить органелл и ядра. Разделение апикальной и базолатеральной белков из плазматических мембран были получены градиентом плотности сахарозы. P-GP в основном локализованы в апикальной фракции (F1) в то время как глутамат транспортер-1 (GLT-1) в основном локализованы в базолатеральной фракции (F3). Очищенные микрососудов До покрытием были использованы в качестве контроля для локализации в естественных условиях этих белков. Активность P-GP определяли путем измерения транспортного полярность R123, п-GP лиганда. Поток 1 мкМ R123 измеряли в течение 1 часа при 37 ° С в просвета-на-abluminal (от А до В) и в противоположных abluminal к просвета (B к A) направлениях. Такой же эксперимент был реализован без РБЕС оценить пассивной диффузии через фильтр вставки и данные были нормализованы относительно этого значения для Пе _(R123) расчета (см. рисунок 5 легенда для Пе метода расчета). Содержание R123 в обоих отсеках измеряли с помощью спектрофлуориметре (длина волны возбуждения на 485 нм, длина волны эмиссии при 535 нм). Данные представлены в виде 100% от транспорта просвета-на-abluminal на основе PE _(R123) (А в пункт Б). Верапамил (25 мкМ, 30 мин инкубация) и циклоспорин A (1 мкМ, 30 мин инкубация) были использованы в качестве Р-GP ингибиторов опорных. Накопление R123 в РБЕС измеряли после 2 часов с или без предварительной инкубации с ингибиторами Р-GP (т-критерий Стьюдента, р <0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7. Характеристика рецепторов, участвующих в опосредованных рецептором Траnscytosis (RMT). (A) дифференцированный РБЕС монослой иммунному окрашиванию с антителами против плотности, связанные липопротеинов низкой рецептора 1 (LRP1) и липопротеинов низкой плотности рецепторов (LDLR). Конфокальной изображение РБЕС исследовали для поглощения DiILDL, флуоресцентного лиганда LDLR и для поглощения крыс трансферрином, Cy3 флуоресцентного лиганда СКР шоу точечного окрашивания на поверхности клетки, с некоторой кластеризации в околоядерной области. (B) Крыса Tf-Cy3 был добавлен в верхнем отделении, содержащей дифференцированные РБЕС монослой на 75, 150, 300, 600, 1200, 2400 и 4800 пмоль / вставить в течение 180 мин при 37 ° С (200 мкл в верхнем отсеке и 1200 мкл в Нижний отсек). По истечении этого времени флуоресценции количественно Cy3 в клеточного лизата (200 мкл ЗФР 0,1% Triton X100) и в нижнем отделении от люминесцентного анализа с спектрофлуориметре с возбуждением при 550 нм и эмиссии при 570 нм. Флуоресценции блоки были преобразованы в пмоль с использованием линейного рабочего диапазона. (С) в течение экспериментах по насыщению, крыса Tf-Cy3 был добавлен в верхнем отделении, содержащей дифференцированные РБЕС монослой на 1200 пмоль / вставить в течение 180 мин при 37 ° С с добавлением или без 15 мин предварительной инкубации с 4800 пикомолях / вставки нефлуоресцентного Tf. Транспорт в нижнем отделении количественно как в (В) (т-критерий Стьюдента, р <0,05). (D) DiILDL был добавлен в верхнем отделении, содержащей дифференцированные РБЕС монослой на 1, 2, 4 и 8 мкг / вставки фильтров в течение 30 мин при 37 ° С (200 мкл в верхний отсек и 1200 мкл в нижнем отделении). По истечении этого времени флуоресценции количественно DiI в клеточного лизата (200 мкл ФБР 0,1% Triton X100) и в нижнем отделении от люминесцентного анализа с спектрофлуориметре с возбуждением при 554 нм и эмиссией при 571 нм. Флуоресценциилюминесценции блоки были преобразованы в мкг с использованием линейного рабочего диапазона. (E) Для транспортировки блокирующего эксперименты, азид натрия добавляли 0,05% за 15 мин до инкубации при DiILDL 2 мкг / вставка в течение 30 мин при 37 ° С Транспорт в нижнем отделении количественно, как в (D) (т-критерий Стьюдента, р <0,05). Отсутствие токсичности азида натрия инкубации при 0,05% оценивали по Пе _(LY) измерения (данные не представлены). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8. В пробирке моделей BBB от спинного мозга крысы эндотелиальных клеток или от мозга мыши. Таблица высокойосвещает важные параметры для извлечения микрососудов из мозга крысы, спинного мозга крысы и мыши мозга. Микрофотографии показывают, иммунное окрашивание для ZO1 и occludin в эндотелиальных клеток монослоев, полученных из мозга крысы, спинного мозга крысы и мыши мозга.

Обсуждение

Мы описываем реализацию еженедельной воспроизводимой протокола для изоляции и обмуровки микрососудов головного мозга, после очистки и культуры РБЕС и далее наладка сокультурах с первичными астроцитов крысы для создания в пробирке ВВВ модель с характерными свойствами BBB.

Успешно установления стандартизированы в пробирке культур BBB требуется оптимальные условия в многочисленных последовательных этапов процесса. Модель была (а) оптимизированы для достижения наименьшей парацеллюлярного проницаемость, которая остается "Святой Грааль" в пробирке моделей BBB, и (б) утвержденный для оттока и RMT механизмов.

Производство, Очистка и размножение РБЕС

Самой большой проблемой при выращивании РБЕС является достижение воспроизводимости между различными культурами. Стандартизация протокола требуется высокое качество инструментов для расраздел, высокое качество реагентов и уважение реагентов сроков годности. Экспериментатор должен иметь навыки в микро-рассечение под стереомикроскопа для быстрого удаления мозговых оболочек и крупных сосудов от поверхности коры. После того, как мозг изолированы и механически диссоциируют, одна из главных проблем является оптимальным ферментативное расщепление из свежеизолированных микрососудов мозга. Тип и качество используемых ферментов имеет решающее значение. Использовали смесь коллагеназы типа I и II и диспазы при высокой концентрации с низкой изменчивости между партиями. Также важны продолжительность ферментативного расщепления и соотношение между весом концентрация фермента / ткани / объем пищеварения. Лучший выход продукции мозг микрососудов был получен с эквивалентом коре головного мозга от 1 в 1 мл коллагеназы / диспаза смешивать в 60 мкг / мл в течение обоих расщеплений, соответственно 30 мин и 1 час.

Также важным является устранение загрязнения ячейкус (астроциты и в основном Перициты). Эти клетки размножаются при более высокой ставке, чем эндотелиальных клеток и не устанавливают плотные соединения с последним, тем самым предотвращая создание однородной монослоя клеток с хорошим парацеллюлярной ограничений. Учитывая, что мозг эндотелиальные клетки экспрессируют гораздо более высокие уровни эффлюкса насосов, особенно P-GP, по сравнению с другими типами клеток, найденных в микрососудов, они лучше переносят в противном случае токсических концентраций P-GP лиганд препаратов, в то время как не-эндотелиальные клетки устранены. Лечение Пуромицин на 4 мкг / мл в течение первых двух дней последовали еще два дня на 2 мкг / мл, чтобы получить хорошую чистоту эндотелиальных клеток. Этот выбор также может способствовать капиллярные эндотелиальные клетки по сравнению с теми из венул, предварительно капиллярных артериол или более крупных микрососудов, и привести к ужесточению монослоев. Кроме того, использование низкого основе плазмы бычьей сыворотки является обязательным, чтобы получить чистые культуры эндотелиальных клеток ^47,48. Плазма-дерченная сыворотка не хватает тромбоцитарный фактор роста (PDGF), который является митогенная для фибробластов, для клеток гладких мышц и, следовательно, для перицитов.

Мы наблюдали, что лечение пластика и фильтров с соединением коллагена типа IV от мышей и человеческого фибронектина дает значительное преимущество, с 2-кратным увеличением доходности пролиферации по сравнению с традиционно рекомендуемой коллагена типа I из хвоста крысы. Важные сигналы для пролиферации клеток обеспечиваются внеклеточного матрикса, таких как интегрином и фактор роста (оФРФ) активации ^49. Концентрация буфера и рН культуральной среды, были описаны положительное влияние на герметичность парацеллюлярной ⁵⁰ и мы наблюдали лучшую воспроизводимость между культурами с добавлением HEPES буфере при 5 мМ.

Дифференциация РБЕС: Сотрудничество культура созидания на Insert Фильтры

После того, как мозг эндотелиальные клетки бееп очищен и получили широкое распространение в течение 6 дней, они могут быть покрыты на фильтрах. Сотовый покрытие при высокой плотности имеет решающее значение для получения идеального монослой. Посев плотность 160x10 ³ клеток на 12-луночные фильтров пластинчатых было необходимо и достаточно, чтобы получить сливающийся монослой через 24 часа после посева. Тем не менее, выделение первичных эндотелия капилляров головного мозга клеток из окружающей их среды парадокс в строительстве BBB модели ин витро, так как известно, что первичные элементы, и в частности эндотелия капилляров головного мозга клетки, сильно регулируется их среды и индуктивные факторов, продуцируемых различные окружающие типы клеток. Мозг капиллярные эндотелиальные клетки культивировали в одиночку быстро исключении из дифференцировать и потерять некоторые конкретные мозг эндотелиальные маркеры. Таким образом, первичные эндотелиальные клетки должны быть использованы при низкой прохода (Р1) и вновь подключен, по крайней мере частично, с их окружающей средой путем совместного культивирования с астроцитов или среды, кондиционированной астроцитов ^47,51. Это справедливоверно для астроцитов дифференциации как мозг эндотелиальных клеток и астроцитов участвуют в двусторонней индукции. Культивирование РБЕС с астроцитов, привел к резкому индукции межэндотелиальных TJ ^52,23. Молекулярные механизмы реиндукции остаются в значительной степени неизвестными, и исследования продолжаются в нескольких лабораториях для выявления конкретных факторов модулирующих выделяемые астроцитов, которые могли бы способствовать оптимальной эндотелия дифференцировку клеток ^53,54. Факторы, выделяемые эндотелиальных клетках головного мозга, включая фактор ингибирования лейкоза (LIF), как было показано, чтобы вызвать астроцитов дифференциацию ^55,56. Перед созданием сокультуры, астроциты были подвержены дифференцировки среде, содержащей глюкокортикоидной рецепторной агонистической гидрокортизон, а совместное культивирование кондиционированной среды. Гидрокортизон, как известно, повысить герметичность эндотелиальных клетках головного мозга и используется в моделях BBB особенно от крысы и мыши ^{57 58,59} эндотелиальных клеток. Кондиционером медицинскиемкм собирают из нижнего отсека эндотелиальных клеток / астроцитов системе сокультуры после 3 дней и замораживали для дальнейшего использования. Использование совместно культуры кондиционированной среды сократить время эндотелиальной клеточной дифференцировки до 3 дней с оптимальным парацеллюлярной проницаемостью для более 2 дней, а также улучшения воспроизводимости между культурами.

В целом, протокол мы описываем дает воспроизводимый TEER над 300 Ом · см ² и средний коэффициент парацеллюлярная проницаемость Пе _(LY) 0,26 ± 0,11 × 10 ^-3 см / мин, как и лучших первичных моделей на основе клеток BBB ^{22, 12.} Протокол описаны в настоящем рукописи с предлагаемым модуляции микрососудов ферментативного расщепления может быть расширена с эндотелиальными клетками из спинного мозга крысы ⁶⁰ и от мышей мозга.

Молекулярная и функциональная характеристика

В дополнениек индукции TJ, астроциты также способствуют экспрессии эффлюкса транспортеров, такие как п-GP в эндотелиальных клетках головного мозга ^61. Мы действительно показать экспрессию оттока транспортера Р-GP в модели BBB и мы демонстрируем полярность локализации отток насоса Р-GP с помощью биохимических подходов, и P-GP деятельности с использованием функционального анализа. GLT-1 выражение было обнаружено в базальном мембранной фракции микрососудов, но не был обнаружен в культуре РБЕС. Мы предполагаем, что GLT-1 был подавлен в нашей РБЕС культуры по сравнению с естественных условиях обстановки в и, следовательно, не определяется по западной блот-анализа. Избыток глутамата нейротоксичен и в естественных условиях, GLT-1 отвечает за глутамата из базальных отсека (паренхимы) в апикальной отсека (кровообращения). В астроцитов культур, GLT-1 выражение остается очень низким и индуцируется путем добавления глутамата в среде ^62,63.

Мы также конфIRM выражение притока перевозчиков на апикальной мембране таких как LRP1, LDLR и TfR. Функциональность TfR и LDLR была продемонстрирована с связывания и транспортировки эксперименты Tf-Cy3 и DiLDL от просвета к abluminal стороне монослоя, как ранее показано с крупного рогатого скота в пробирке BBB модели ^64. Интересно, было показано, что требование липидов из астроцитов увеличивает экспрессию LDLR на мозг клеток эндотелия капилляров далее ^65,66, подтверждающие физиологическую перекрестных помех между астроцитов и эндотелиальных клетках головного мозга, в том числе в пробирке. Мы выбрали примером транспорт флуоресцентными красителями, такие как Су3 и DiI учитывая, что spectrofluorimetric анализ доступен в большинстве лабораторий, и может оказаться полезным для проверки в пробирке моделей BBB. Тем не менее, количественное определение флуоресценции гораздо менее чувствительны, чем радиоактивности и требует увеличения количества экспериментов, чтобы получить значимые данные.В идеале, Т и ЛПНП, как правило, радиоактивно (Йод 125) для таких связывания / поглощения и транспортных экспериментов.

Показано также, что дифференцированный эндотелия монослой клеток получены с предлагаемого протокола отвечает на воспаление, индуцированное ФНО-α, как показали CCL2 выпуска и открытия BBB. CCL2 (МСР-1) и его рецептор CCR2 вовлечены в ЦНС патологий, таких как рассеянный склероз, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) ^67, ЦНС травмы ⁶⁸ и известны как медиаторов миграции лейкоцитов в ЦНС в условиях нейровоспалительных ^69,70. С тестируемой протокола, мы не можем заключить на поляризованной секреции CCL2 потому открытие BBB позволяет концентрация CCL2 для уравновешивания между двумя верхними (верхушечные) и нижних (базальных) отсеков. Следовательно, мы четко недооценивают количество CCL2 производится по РБЕС в апикальной отсеке 24 часов (рис. 5А).

Общий обзор и Ограничения BBB в пробирке моделей: я н Vivo против Экстракорпоральное и грызунов по сравнению с человека Сравнения

Многие перспективные препараты ЦНС, которые оказались эффективными в BBB прохода в пробирке удалось в клинических испытаниях из-за отсутствия предсказуемости от в пробирке моделей BBB часто основаны на клетки, выделенные из других видов, чем человека. Насколько нам известно, пробирке модели в BBB, вероятно, более интеллектуального, когда дело доходит до изучения механистические аспекты белковых сетей, передачи сигнала, перевозчиков и рецепторов. Каждый механизм, путь или цель должны быть изучены в пробирке должен быть охарактеризованы для его регулирования дополнительными сигналами окружающей среды (другие типы клеток, химические вещества, белки) и объединены, чтобы в исследованиях на места с одних и тех же видов животныхИ, когда это возможно, с микрососудов и эндотелиальных клеток, выделенных из человека, с ограничениями и осторожностью вызывали ниже.

В пробирке модели BBB должны рассматриваться как автономных систем, выделенных из регулирования тела, но по-прежнему наделен основных естественных условиях свойств в и потенциалом для регулирования сигналами окружающей среды. Нет "идеального" в пробирке BBB модель была предложена еще ^71,72,73, потому что эндотелиальные монослои клеток не хватает ряда важных составляющих нейро-глии сосудистой блока (NGVU) и изолированы от крови и регулирования тела. Отсутствие перицитами ^74,16 или нейронов ^17,18 или различных компонентов внеклеточного матрикса, используемого для пластиковым покрытием или культуральной среды и сыворотки, используемой для роста клеток в наиболее распространенных и "простой, сделанных" пробирке моделей в BBB на основе эндотелиальной клетки, дифференцированные с астроцитов может модулировать белка выражение, которое ян сравнение с ситуацией в естественных условиях ^75. Эти модели могут выразить много транспортеры, отображаемые в естественных условиях, но не все. В некоторых случаях, транспортные параметры были впервые проверены в изолированных микрососудов (ближайших к естественных ситуации в), а затем учился в системах клеточных культур ^76,61.

Молекулярная биология исследование позволило характеристика генов и белков экспрессии в изолированных микрососудов и проход культур эндотелиальных клеток низких из тех же видов, а также между различными видами, чаще всего из небольших животных, таких как грызуны (мыши и крысы), или от коровы и свиньи в Сравнение для человека ^77,78,75,15. Транскриптомных сравнение между ин виво и ин витро мозг микрососудистых эндотелиальных клеток показали многочисленные генных транскриптов, которые были дифференциально экспрессирующихся и наиболее часто значительно подавляется в пробирке. Стенограммы кодирующие приток транспортеры, такие как TfR и пр.oteins причастны к торговле людьми пузырьков в основном подавляется в культивируемых эндотелиальных клетках головного мозга, что свидетельствует о общее снижение эндоцитоза и везикулярного транспорта в таких клетках. Манипуляции Культура с точки зрения чистоты (лечение пуромицину) и лечения с гидрокортизон может помочь восстановить более "в естественных условиях, как" профиль экспрессии генов ^77. Транскриптомных исследования также показали существенные различия между видами, которые еще ​​больше осложнить прогнозы на поглощение наркотиков в организме человека на основе грызуна в пробирке моделей BBB ^75. В пробирке модели BBB с участием со-культуру эндотелиальных клетках человека и астроцитов были описаны ^15. Хотя уместно, эти модели являются более трудно реализовать на регулярной основе, поскольку они требуют регулируется доступ к посмертной ткани человека и есть неоднородность качества / свойств человеческого мозга эндотелиальных клеток в зависимости от возраста, болезней, и, возможно, медицинское ЛЕЧЕНИИт доноров. Усилия должны быть сделаны для разработки моделей новых в пробирке, что лучше воспроизводят физиологические, анатомические и функциональные характеристики в естественных условиях BBB. Со-культуры с участием типы три-клеток являются весьма ограничительный характер и появляются трудно осуществить в установленном порядке. На сегодняшний день самые сложные пробирке модели в BBB являются модели динамические в пробирке (DIV-BBB), которые включают судно-как организацию с астроцитов и включают в себя поток среды, который имитирует кровоток ^{75,79,80,81,82, 83,84,85.} Когда эндотелиальные клетки головного мозга подвергаются воздействию потока, генерируемого напряжения сдвига активирует mechanotransducers на клеточной поверхности, которые модулируют экспрессию различных генов, вовлеченных в эндотелиальных физиологии клеток, таких как деление клеток, дифференцировки, миграции и апоптоза ^80. В естественных условиях, напряжение сдвига порожденный кровотока отвечает за митотического ареста на мобильный контакта, что позволяет созданиеэндотелия монослой клеток в кровеносных сосудах ^80. Геномики и протеомики анализ нормальных человеческий мозг эндотелиальные клетки микрососудов показал воздействие напряжения сдвига в BBB эндотелия физиологии ^84. Напряжение сдвига отвечает за выживание клеток, более высокой степенью адгезии эндотелиальных клеток, индукции оттока насоса и лучше поляризации транспортеров ^75, регуляции метаболизма глюкозы ^75,86, окисление при посредничестве ферментов CYP450 ⁷⁵ и регулирование парацеллюлярной проницаемости за счет увеличения экспрессии из генов, кодирующих межклеточных соединительных элементов, таких как occludin и ZO-1 ^87,75,80 и, следовательно, высокой TEER около 1500 - 2000 Ом · см ^2, ближе всего к известным в естественных параметров ^79,80

В биотехнологии и фармацевтической промышленности, рутинный скрининг наркотиков или даже высокопроизводительного скрининга (HTS) и усилия по снижению экспериментов на животных, во главек разработке различных клеточных линий, которые будут использоваться в замене первичной культуры эндотелиальных клеток головного мозга, которые остаются более трудным для настройки обычно. В большинстве случаев первичные культуры эндотелиальных клеток головного мозга были трансдуцированных гена иммортализующими (SV40 или вируса полиомы большой Т-антиген или аденовирус Е1А), либо путем трансфекции плазмидной ДНК или инфекцией с использованием ретровирусных векторов ^88,89,75. Несколько эндотелиальные клеточные линии мозгового происхождения были разработаны такие как RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBS или rBCEC4 линий крыс клеточных ^88,75, клеточной линии b.End3 мыши ^90,75, PBMEC/C1 - 2 свиньи клеточная линия ^87,75, а hCMEC/D3 клеток человека линии ^89,75. Другие модели основаны на клетках не-мозгового происхождения, таких как Madin-Дарби почки собаки (MDCK) или Caco2 клеточных линий ^12,75. Среди различных мозговых эндотелиальных клеток человека, hCMEC/D3 широко цитируютг и улучшение в качестве модели BBB с момента ее создания в 2005 году ^91,92. Как первичные культур, клеточных линий, присутствующих преимущества и ограничения. Они легче, чем первичных культурах, имеют расширенный срок службы, хорошо охарактеризованы и позволяют воспроизводимость между крупномасштабных экспериментов. Однако клеточные линии могут потерять тканеспецифические функции, теряют экологического регулирования и приобретать молекулярную фенотип совершенно отличное от клеток в естественных условиях ^{75, 89.} В частности, монослоя, полученные от клеточных линий присутствует снижается герметичность, низкая Тир и вариации шоу транспортер профиль ^75,89. Таким образом животных эксперименты или исследования в первичных клеток часто предпочитают, несмотря на их дополнительную сложность.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA fraction V low endotoxin	PAA	K45-011-500g	4 °C
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122	-20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-054	-20 °C
DMEM high glucose	Invitrogen	61965-026	4 °C
Fetal bovine serum	Invitrogen	10270-098	-20 °C / 1 year
T75 flasks	Becton Dickinson Falcon	353135
HEPES buffer (1 M)	Invitrogen	15630-056	4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg)	Becton Dickinson	356233	-20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg)	Becton Dickinson	356008	-20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm)	Fine Science Tools	91500-09
Scissors, straight (9 cm)	Fine Science Tools	14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm)	Fine Science Tools	11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm	Fine Science Tools	11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm	Fine Science Tools	11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg)	Roche Diagnostics	05 401 054 001	-20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg)	Sigma Aldrich	DN25-100 mg	-20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml)	Invitrogen	15710-049	4 °C / 1 year
DMEM/F12	Invitrogen	31331-028	4 °C
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml)	Clinisciences	BT-214-100	-20 °C / 1 year
bFGF (10 µg)	Invitrogen	13256-029	-20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I	Sigma Aldrich	H3149-100KU	4 °C / 1 year
Puromycin	Sigma Aldrich	P8833-10 mg	-20 °C / 6 months
ITSX	Invitrogen	51500-056	4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates	Millipore	PIRP15R48	Porosity: 1 µm Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0888-1 g	-20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM	Chemicon	MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)	1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand	Chemicon	AB7356	1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine	Chemicon	MAB3430	1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine	Invitrogen, Zymed	08-0052 clone V9, (58 µg/ml)	1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5	Invitrogen, Zymed	35-2500, (500 µg/ml)	1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1	Invitrogen, Zymed	61-7300 (250 µg/ml)	1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine	Invitrogen, Zymed	71-1500 (250 µg/ml)	1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies	Invitrogen		1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt	Sigma Aldrich	L0259	-20 °C
TNF-alpha human	PeproTech	300-01A	-20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit	PeproTech	900-K59	4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein	Covance, Eurogentec	SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)	1/400 - fixation PFA 4% 1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1	Abcam	ab41621	1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123	Sigma Aldrich	83702	4 °C
Verapamil hydrochloride	Sigma Aldrich	V4629	4 °C
Cyclosporine A	Sigma Aldrich	30024	4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat	American Diagnostica	3501 (100 µg/ml)	1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR	R&D systems	AF2255 (200 µg/ml)	1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3	Gentaur	JOR160050	4 °C
DiILDL	Invitrogen	L-3482	4 °C