Маркировка сотовый и впрыска в развивающихся эмбриональных сердце мыши

Резюме

Мы описываем ряд методов, чтобы ввести красители, векторы ДНК, вирусы, и клетки с целью мониторинга как судьбу клеток и фенотип эндогенных и трансплантированных клеток, полученных из эмбриональных или плюрипотентных клеток в эмбрионы мышей в эмбриональный день (E) 9.5 и более поздних этапах развития.

Аннотация

Тестирование судьбу эмбриональных или плюрипотентных стволовых клеток-производных в протоколах в пробирке привело к спорным результатам, которые не обязательно отражают их в естественных условиях потенциал. Предпочтительно, эти клетки должны быть размещены в надлежащем эмбриональной среды, чтобы приобрести их определенный фенотип. Кроме того, сотовый линия трассировки исследования в мыши после мечения клеток с красителями или ретровирусных векторов осталась в основном ограничивается ранних мышиных эмбрионов сцене с еще слабо развитой органов. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали стандартные и ультразвуковые опосредованного протоколы микроинъекции для нагнетания различных агентов в целевых регионах сердца у эмбрионов мышей на E9.5 и поздних стадиях развития. Эмбриональные эксплант или эмбрионы затем культивировали или влево для дальнейшего развития в утробе матери. Эти средства включают флуоресцентные красители, вирусы, shRNAs или стволовые клетки-предшественники клеток, полученных. Наши подходы позволяют сохранения фуnction органа при мониторинге миграции и судьбу меченых и / или вводили клетки. Эти технологии могут быть распространены на другие органы и будет очень полезно для решения ключевых биологические вопросы в биологии развития.

Введение

Более десяти лет назад, человеческие эмбриональные стволовые клетки (HuESCs) были получены из человеческих бластоцист ^1. С тех пор, эти клетки стали предметом одной из важных областей исследований в котором рассматриваются неудовлетворенные вопросы в биологии человека развития. HuESCs бы, кроме того, при условии, надежды в регенеративной медицине. В последние годы человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) были получены от конкретного пациента соматических клеток, обеспечивая моделей генетических заболеваний ^2. Многие в протоколах пробирке для дифференцировки эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к различным клеточных линий, в том числе сердца линий ^3, не поступало. Дифференцированные клетки часто phenotyped путем анализа РНК и экспрессии белка, иммунным окрашиванием, и / или в пробирке функциональных тестов. Тем не менее, плюрипотентные производные стволовых клеток должен быть установлен в соответствующем эмбриональной среды, чтобы проверить полностью ли они приобретают CELл судьба их эмбрионального коллегой и резюмировать ли они подлинную естественных условиях функцию в в ответ на региональные подсказки. В то время как тканевая инженерия является перспективным, то это еще не обеспечивают все известные и неизвестные сигналы от собственно в естественных условиях развивающимся эмбриональных тканей ^4,5.

Сотовый маркировка с красителями или ретровирусных векторов у эмбрионов, в том числе эмбрионов мыши, принесли важную информацию в отношении эмбрионального происхождения клеточных линий во время развития сердца ^6. Например, краситель инъекции в перикардиальной пространстве мышиных эмбрионов экс виво, после чего культуры в пробирке изолированных сердцах, был использован для обозначения эпикардиальные клеток и их потомков ^7. Тем не менее, краситель и ретровирусная мечения клеток были в основном применяется для ранних мышиных эмбрионов с еще слабо развитой органов или куриных эмбрионах, которые более легко доступны ^8. Исключением является мозг, который легче цели в еmbryos ^9,10. Такой подход еще не применяется к биению эмбрионального сердца мыши.

В дополнение к прямой маркировки с красителями или вирусом и выполнять происхождение трассировки в более продвинутые мышиные эмбрионы сцене и взрослых мышей, подход мечения клеток была в сочетании с анализом трансгенных мышей с использованием технологии Cre / Lox. Подход Cre / Жидкий кислород ^11, однако имеет некоторые ограничения, связанные с пространственно-временной специфики геномных регуляторных областей, используемых для управления экспрессией рекомбиназы и эффективности Cre / Lox рекомбинации ^12. Кроме того, этот подход не полностью учитывать конкретные вопросы миграции клеток приводом приобретения судьбы клеток, как это может только знак предшественника после активации регуляторной области, используемой для управления экспрессией Cre. Он также не может применяться к человеческих эмбрионов по понятным этическим вопросам.

Учитывая эти ограничения, мы разработали ряд новых рrotocols вводить разнообразные маркировки клеток агентов, таких как флуоресцентные красители, вирусов, экспрессии генов модуляторов, таких как shRNAs и на основе ДНК маркировки клеток векторами, или клеток в эмбрионе мыши на E9.5 и поздних стадиях развития в целевых регионах сердце.

DNA / сотовые инъекции использовать стереомикроскопа и простой микроинъекции устройство в сочетании с экс естественных культуры эмбриона до 48 часов, или изолированного сердца или эмбрионального эксплантата культуры в течение 48-72 часов. Мы также сообщаем протокол микроинъекции ультразвуковое опосредованного в мышиных эмбриональных сердца в период внутриутробного развития. Эта методика позволяет следить за развитием эмбрионов ¹³ и позволяет для долгосрочного наблюдения из injectates и / или меченых клеток.

Мы обнаружили, что эти подходы сохранить функцию органа и обеспечить более представительный среды, чем испытания в пробирке потенциала стволовых клеток. Он также предоставляет возможность следить миграциимеченых и / или вводят клетки для контроля за их судьбу. В конечном счете, это должно дать более глубокое понимание регионального паттерна тканей и основных биологических процессов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка

Процедуры животных

Получить одобрение от животного этическим комитетом и следуйте институциональные рекомендации по работе с вирусом, HuESC и / или IPSC (если применимо), а также обращение с мышь, получения эмбрионов мышей, и выполнение операции мыши. Для временных вязки, в день пробки считается эмбриональных день (E) 0,5 / 0,5 дней после коитуса.

1. Микроинъекция иглы:
   Для экс маточно микроинъекции, потяните стеклянные пипетки (1.2 мм внешний диаметр боросиликатного капиллярных трубок) с помощью пипетки съемник / Кромкорез получить 1 или 10 мкм внутренний диаметр наконечника и резкий и коническую форму вершин впрыснуть ДНК или клетки, соответственно. Для ультразвуковых опосредованного инъекций, использование настроены стерильные иглы, которые имеют внешний / внутренний диаметр (OD / ID) 1,14 mm/0.53 мм, с 50/35 мкм OD / ID-ым советом.
2. Кремний-заполненные чашки Петри:
   Подготовка кремний, как описано в руководстве. ЗаполнятьДиаметр чистое стекло 60 мм чашки Петри с слой эластомера ~ 1 см. Избегайте воздушных пузырьков.
3. Инструменты:
   Храните все хирургические инструменты стерильные до и во время процедуры.
4. Подготовка ДНК:
   Добавить 3 мкг ДНК и 12 мкл Opti-MEM в одной пробирке. Добавить 3 мкл Lipofectamine 2000 и 12 мкл OPTI-MEM в другую пробирку. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре и смешать оба раствора. Используйте немедленно.
5. Подготовка сотовый:
   Приготовьте суспензию 10 ⁶ клеток / мл DMEM (Дульбекко среду Игла с высоким содержанием глюкозы и 50% сыворотки крыс). 50 мкл клеточной суспензии окончательного достаточно в течение 8-10 эмбрионов.
6. Краска подготовку:
   Используйте зеленый флуоресцентный CDCFDA-SE при 25 мг / мл ДМСО. Подготовка 20 мкл аликвоты и хранить при температуре -20 ° С. Развести 1:100 / 1:200 в стерильном физиологическом растворе или PBS перед использованием.
7. Подготовка Вирус:
   Используйте коммерческий поколения ^3-й ПГК-GFP-экспрессирующих лентивирус с титром ~ 10 ⁹ -10 ¹⁰ траnsducing единиц / мл DMEM. Для приготовления лентивирус см. Tiscornia др.. ¹⁴ Использовать средства индивидуальной защиты и безопасно пользоваться и распоряжаться вируса.

2. Сбор E9.5 и E10.5 эмбрионов для Ex естественных инъекций

1. Усыпить беременную мышь на эмбриональный день 9,5 или 10,5.
2. Стерилизовать грудь и живот мыши с 70% этанола.
3. Сделайте вентральной средней линии разрез, чтобы открыть живот, и получения рог матки при комнатной температуре в PBS и передачи его после двух стирок PBS в силиконовой заполненные чашки Петри с M16 среды.
4. Pin рога матки с контактами насекомых силиконового слоя таким образом, что сторона васкуляризации матки в нижней части.
5. Разрежьте поверхность матки с тонким пинцетом, и крышку децидуальной на 1 мм ниже поверхности.
6. Аккуратно извлечь эмбрион в желточного мешка, распространяя из стены децидуальной.
7. Храните эмбрионов при 37 °, С в M16 среду перед инъекции клеток. Для инъекций, каждый эмбрион переносится на силиконовой тарелки, заполненной средой M16 предварительно нагретого до 37 ° С.

3. ДНК или сотовый впрыска под стереомикроскопом

1. Заполните стеклянную пипетку с задней с помощью шприца Гамильтона и встряхните пипетку, чтобы удалить пузырьки на кончике.
2. Установите пипетки на держателе микроинъекции; установить давление удержания до 50 (ДНК) или 30 (клеток) гПа, и давление впрыска до 150 (ДНК) до 300 (клеток) гПа. Установите время впрыска до 0,2 сек (ДНК) или 0,5 сек (ячеек). Эти параметры могут незначительно отличаться в зависимости от типа microinjector и пипетки.
3. Pin эмбрион к силиконовой нижней через желточного мешка, не касаясь собственно эмбриона. Смотреть область сердца и открыть мешок чуть выше этой области.
4. Добавить 4 флажки вокруг эмбриона для предупреждения каких-либо движение во время инъекции клеток.
5. Использование микроманипулятора (в ручной режим), slowlу позиции наконечник пипетки под углом 45 ° над перикарда, чуть выше области сердца, которая должна быть введена (рис. 1).
6. Перемещение пипетки в интересующей области и вызвать инъекцию. Выньте пипетку как можно быстрее. Убедитесь, что сердце правильно бить после инъекции ДНК / клетки.

4. Эмбрион, изолированного сердца, и эксплантата Культура

1. Культура эмбрионы E9.5 в 25% M2 среды и 75% крысиной сыворотки, с добавлением пенициллина / стрептомицина, предварительно нагревают при 37 ° С и кислородом с 40% O _2.
2. Добавить 2 мл культуральной среды в стеклянной трубке 25 мл, осторожно добавить эмбрион, и кислородсодержащих с 40% O ₂ до завинчивания крышки на трубку. Инкубируют до 36 ч при 37 ° С при вращении или встряхивании (30 об / мин).
3. В нужном момент времени (например, 24 ч), рассекать сердца тщательно с тонким пинцетом, не касаясь сердца, по первой деcapitating эмбрионов; сердце легко акциза, потянув его с помощью дистального тракт оттока.
4. Культура изолированных сердце еще 36-48 ч в DMEM с 50% FCS на Матригель покрытием вставить набор в 12-луночный планшет. Смотреть Дайер & Patterson (2013) в улучшенном протокола сердца культуры ^15.
5. Сделать любой эксплантов из интересующей области. В качестве примера, рассекают атрио-вентрикулярной канал (AVC) и культуру его в течение 48 часов на коллагена типа 1 гель ^16.

Ультразвуковая руководствуясь впрыска в сердце я н внутриутробно 5.

1. Настройка машины ультразвука и microinjector:
   1. Используйте ультразвуковую систему высокого разрешения с датчиком 40 МГц и настройки микроинъекции на железной дороге.
   2. Установите объем впрыска на microinjector на 69 нл на инъекцию. Смотреть микроинъекции руководство изготовителя для программирования microinjector.
2. Подготовка microiНастройка njection и впрыска:
   1. Поместите стеклянную микропипетки в microinjector. Для обеспечения эффективного инъекций, первый слой с внутренней стороны пипетки с минеральным маслом путем аспирации до максимального объема. После этого удалите масло снова, оставляя 1-2 мм нефти внутри иглы.
   2. Аспирируйте инъектата пока максимальный объем не будет достигнут. Будьте осторожны, не прикасайтесь к поверхности с кончика иглы, так как это тупой кончик и сделать инъекции сложнее.
   3. Для стабилизации рог матки, содержащий эмбрионов во время инъекции, использовать модифицированную чашку Петри с отверстием в середине (2,5 см в диаметре), покрытый тонким силиконовой мембраны с малым разрезом сократить в центре, и расположите его над разреза . Стабилизировать чашку Петри на столе обработки мыши, поместив 3-4 комки глины под краям блюда.
3. Процедура для инъекций:
   1. Бритье живот беременной мыши (в нужной зачаточном состоянии) до anestheSIA для удаления волос. Лечить живот с удаления химического агента волос для удаления остатков волос и стерилизовать 70% этанолом.
   2. Обезболить беременную мышь с кислородом / изофлураном через маску. Использование 3-5% изофлуран в 100% кислорода в течение вводного наркоза, а затем на 1-1,5% в течение остальной части процедуры. Убедитесь, что мышь адекватно наркозом, осторожно сжимая свои лапы и / или хвост.
   3. Поместите лежа на спине мыши на таблицу обработки мыши (набор для нагревания при 37 ° С) и покрывают глаза смазкой, чтобы предотвратить дегидратацию роговицы.
   4. Применить электрода гель на электродах и ленты лапы к электродам контролировать частоту сердечных сокращений, частоту дыхания и ЭКГ. Расположите ректальное термометр для контроля температуры тела.
   5. Убедитесь сначала, что мышь беременна, визуализируя и подсчета эмбрионов с помощью ультразвука. Применить ультразвуковой гель на животе и расположите голову сканирования выше мочевого пузыря. Для согласованности, визуализировать пузырь во-первых,и считать эмбрионов в левой и правой рога матки, начиная с позиции мочевого пузыря. Убедитесь, что эмбриональные сердца бьются в обычном режиме.
   6. Если мышь беременна, поместите чашку Петри над будущего сайта разреза с глиной. Нажмите на блюдо слегка брюшной полости, так что антенна находится в прямом контакте.
   7. Снимите блюдо и стерилизовать живот снова. Сделайте 1,5-2 см вентральной средней линии разрез, примерно 0,75-1 см над лоном, чтобы открыть живот и брюшину. Избегайте травм внутренних органов.
   8. Экстериоризироваться левый или правый рог матки щипцами, осторожно потяните его через кремниевую мембрану блюдо, и стабилизировать блюдо на глине снова. Предотвратить обширная потянув или манипуляции, так как это может вызвать кровотечение из сосудов матки и преждевременной смерти самки и / или эмбрионов.
   9. Всего эмбрионов еще раз, чтобы предоставление необходимой отчетности из которых эмбрионы вводят.
   10. Применить ультразвуковой гель на Uterine рога на изображение сердца и, чтобы предотвратить обезвоживание.
   11. Изображение первый эмбрион, который будет введен. Проверьте нормальное биение эмбрионального сердца и вести учет краниально-каудальном и лево-правой ориентации эмбриона. Если необходимо, переместите рог матки слегка, чтобы обеспечить правильную ориентацию. Если это окажется трудным, перейдем к следующему эмбриона.
   12. Прокол матку осторожно микроинъекции иглы позиционировать иглу под углом в 45 ° над эмбриона, немного за пределами перикарда (рис. 3). Для маркировки эпикардиальных клеток, изображение сердца в связи с четырьмя камеры и расположите иглу так, чтобы она к предсердно-желудочковой паз (рис. 3). Если угол нуждается в корректировке, вытащить иглу, и переместить. Не отрегулировать угол с иглой внутри матки, так как это может нарушить иглу. Избегайте прокалывания другие ткани, такие как конечности или плаценты.
   13. Перемещение иглына перикарда стене и проколоть его с нежным, но быстрым движением. В общем, будет некоторое сопротивление, но слишком быстрое перемещение иглы может привести кончик иглы для прокола самого сердца. Наконечник должен в конечном итоге в перикарда пространстве атрио-вентрикулярной паз. В случае перикарда кровотечения, клетки крови будут видны в виде белого снега, как шаблон. Если это так, стоп инъекционных эмбрион и перейти на другую эмбриона.
   14. Введите инъектата. Введите максимально 700 Нл в перикарда пространства, чтобы предотвратить негативное влияние на развитие сердца. Монитор надлежащего инъекции по небольшим, временной отек перикард.
   15. После инъекции, вытащите иглу и убедитесь, что инъектата еще можно извлечь для того, чтобы игла не были забиты фрагментов ткани.
   16. Измените таблицу обработки на изображение и придать следующий эмбрион. Сведите количество введенных эмбрионов максимально 3-4 (в одном роге матки), чтобы предотвратитьрасширенный анестезии, чтобы обеспечить контрольных эмбрионов в противоположном рога матки, а также обеспечить, чтобы процедура не беспокоить эмбрионального развития.
   17. После введения необходимое количество эмбрионов, удалить избыток ультразвуковой гель и осторожно поместить рог матки обратно в брюшную полость в его правильном положении.
   18. Закройте материнской живота с помощью одного слоя шва на брюшину и мышцы живота, а второй слой шва для кожи.
   19. Введите мышь с первой дозы обезболивающего. С помощью одной инъекции 0,05-0,1 мг / кг бупренорфина 15 мин до прекращения анестезии и три дополнительных инъекций с интервалом 12 ч.
   20. Прекратите анестезии и мониторинга мышь для адекватного выхода из процедуры. Дом беременная мышь в индивидуальную клетку для нужного продолжительности наблюдения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Использование протоколов инъекций описанные выше, клетки могут быть помечены и / или вводят в эмбриональном сердце мыши. Как доказательство концепции, несколько примеров приведены в котором протокол впрыска и экс естественных AVC эксплант, изолированных сердца, или целая культура ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Бывшие естественных условиях протоколы внутри сердца инъекции, описанные выше, предназначены для сохранения функции миокарда, по крайней мере 48 часов в середине стадии (E9.5-E11.5) эмбрионов мыши. Эти подходы позволяют инъекций пространственно целевой инъекции ДНК или клеток. Несколь...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Setups/Hardware
40 MHz Transducer	VisualSonics	MS550S
Microinjector	VisualSonics
Microinjector	Eppendorf	5242
Micromanipulator	Eppendorf	5171
Nitrogen			required to pressurize the injector
Rail system	VisualSonics
rotator			to rotate glass tube with embryos inside the incubator
Standard incubator			5% CO2, 37 °C
stereomicroscope	Zeiss	Discovery. V8
Vevo 2100	VisualSonics
Microinjection
Borosilicate capillary tubes	World Precision Instrument	KTW-120-6	1.2-μm external diameter
Pipette puller	Sutter	Model P87
Microinjection needles	Origio-Humagen	C060609	OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip
Hamilton syringes
Petri dishes			10-cm diameter
Mineral oil	Sigma	M8410
Silicon membrane	Visualsonics		4.3 x 4.3 cm
Play-Doh
Isoflurane	Vet One
hair removal agent	Nair
Eye lubricant	Optixcare	31779
Electrode gel (Signa)	Parker
Suture	Sofsilk 5-0	S1173
Ultrasound gel	Aquasonic
Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-1	0.05-0.1 mg/kg in saline
Other
Silicone Elastomer	Dow Corning	Sylgard 184
Glass petridishes	Fine Science Tools		60-mm diameter
Insect pins	Fine Science Tools	26002-20
Media and culture reagents
Optimem medium	Life Technologies	51985026
M2 medium	Sigma	M7167
Dulbecco’s Eagle Medium	Lonza	BE12-640F	high glucose and 50% rat serum
M16 medium	Sigma	M7292
Rat serum	Janvier	ODI 7158
Pennicilin/streptomycin	Life Technologies	15140-12
oxygen 40%	Air liquid		required to oxygenate the embryo culture medium
Fetal calf serum	Fisher	RVJ35882
Matrigel	BD	356230
Collagen type I	BD	354236	to coat culture dishes for explant culture
Culture dishes	Dutcher /Orange	131020
Injectates
CDCFDA-SE	Invitrogen/Molecular Probes	C1165	25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use.
PGK-GFP-expressing lentivirus			~8E9 transducing units/ml DMEM
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019