JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Стабильный изотоп маркировка пептидов восстановительным Диметилирование (Реди маркировки) является быстрым, недорогим стратегия для точных масс-спектрометрии на основе количественных протеомики. Здесь мы показываем, надежный метод для подготовки и анализа белковых смесей, используя подход Реди, который может быть применен к почти любого типа образца.

Аннотация

Стабильный изотоп маркировка пептидов путем восстановительного Диметилирование (Реди маркировки) является методом для точного количественного различия экспрессии белка между образцами с использованием масс-спектрометрии. Реди маркировка выполняется с помощью либо обычный (свет) или дейтерированных (тяжелые) формы формальдегида и натрия цианоборогидрида добавить две метильные группы к каждому свободного амина. Здесь мы показываем, надежный протокол для Реди маркировки и количественного сравнения сложных белковых смесей. Образцы белка для сравнения перевариваются в пептиды, маркированные нести легком и тяжелом теги метил, смешиваются и совместно анализировали LC-MS/MS. Относительные распространенности белка количественно путем сравнения ион хроматограмме пиков тяжелых и легких меченых вариантов составного пептида, извлеченной из полного MS спектров. Описанный здесь метод включает пробоподготовки обращенно-фазовой экстракции твердой фазы, в колонку Реди маркировки пептидов, пептидов фракционирование по щелочного рН оборотовersed-фаза (BPRP) хроматографии и StageTip очистка пептида. Мы обсуждаем преимущества и ограничения Реди маркировки в отношении других методов стабильных изотопов регистрации. Мы подчеркиваем новых приложений с использованием Реди маркировке быстрой, недорогой и точный метод для сравнения белковых распространенность в почти любого типа образца.

Введение

Измерение различия концентрации многих белков между сложных образцов является главной задачей, в протеомики. Все чаще это делается путем маркировки белков в каждом образце с разными тегами изотопных, сочетая образцы, и с помощью масс-спектрометрии для количественного различия концентрации. Существует несколько способов для стабильного изотопного мечения белков и пептидов. 15 N маркировка 1 и 2 SILAC ввести изотопные метки метаболически в естественных условиях, в то время как ICAT 3, iTRAQ 4, и снижение Диметилирование 5 добавить стабильных изотопов метки после экстракции белка и пищеварения. Среди этих методов, восстановительное Диметилирование (Реди маркировка) набирает популярность как недорогой, воспроизводимый метод для количественного различия концентрации белка в почти любого типа образца.

Реди маркировки включает взаимодействие пептидов с формальдегидом с образованием основани Шиффа, которое затем восстанавливаютцианоборогидрид. Эта реакция dimethylates свободные аминогруппы на N-концах и лизин боковых цепей и monomethylates N-концевых пролинов. Протокол, описанный здесь метилирует пептиды в образце 1 с «легкой» этикетки с использованием реагентов с атомами водорода в их естественной распределения изотопного и образца 2 с «тяжелой» этикетки с использованием дейтерированных формальдегид и цианоборгидрид (рис. 1). Каждый диметилированный аминогруппу на пептида, приводит к разнице масс 6,0377 Da между легкой и тяжелой формы, который используется, чтобы различать между двумя формами с помощью масс-спектрометра. В частности, относительное содержание пептида количественно как отношение MS1, выделенных областей ионных хроматограмм (MS1 отношение площади пика) легкой и тяжелой версии для каждой пары пептид ионов. Относительное содержание белка определяется как отношение средней MS1 площади пика среди всех пептидов в белке. В этом докладе мы описываем надежную протокол для проведенияING Реди маркировки эксперименты по LC-MS/MS что включает в себя пептид твердофазного добычу обращенной фазой, на-колонке Реди маркировку, пептидный фракционирования по щелочного рН обращенной фазой (BPRP) хроматографии и очистка пептидных смесей с помощью StageTips (рис. 2) . Мы обсудим возможности и ограничения использования Реди маркировку для количественных протеомики.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был ранее описан 12.

1. Белок Изоляция

Подготовка 1 мг клеточного белка путем лизиса клеток, предпочтительно с помощью физических методов, таких как французский пресс, кромочная биения, или ультразвуком. Избегать лизоцима-опосредованного лизиса клеток, потому что фермент будет смешивать измерения масс-спектрометрии.

2. TCA Осадки белков

Добавить 1 объем трихлоруксусной кислоты (ТСА) в 4-х томах белка и охладить на льду в течение 10 мин с осаждением белков. Центрифуга при 12000 х г в течение 5 мин при 4 ° С и удалить супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл охлажденного льдом ацетона и центрифуге при 12000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и инвертировать трубку на скамейке, чтобы высушить осадок в течение 15 мин. Белковые магазин гранулы при температуре -80 ° С.

3. Денатурации белков и уменьшить дисульфидных связей

Реприостанавливать белки до ~ 2 мг / мл в 500 мкл буфера денатурации и сокращению (либо 4 М мочевины или 3% SDS в 50 мМ HEPES рН 8,5, 5 мМ DTT). По желанию, включают ингибитор протеазы в буфере. Инкубируют протеины течение 30 мин при 56 ° С, а затем 10 мин при комнатной температуре.

4. Aklylate свободные сульфгидрильные группы необратимо сорвать образование дисульфидной связи

Подготовьте свежий 0,3 M иодацетамидом в воде. ВНИМАНИЕ! Йодацетамид высоко токсичен. Добавить 25 мкл 0,3 М иодацетамида (15 мм конечная концентрация) в 500 мкл белка и инкубировать в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре. Гасят добавлением иодацетамида 10 мкл 300 мМ ДТТ (5 мМ DTT конечная концентрация). Храните алкилированные белки при -80 ° С

5. Белок Пищеварение

TCA осадок белки (как описано в шаге 2) и ресуспендируют в 1 мл 50 мМ HEPES (рН 8,2), 1 М мочевины. Подготовка исходного раствора лизил endoproteinASE (Lys-C) в воде при концентрации 2 мкг / мкл и добавить 5 мкл к раствору белка. Выдержите смесь в течение 16 ч при комнатной температуре. Убедитесь, что конечная концентрация Lys-C 10 нг / мкл, а соотношение белок-к-LysC (вес / вес) 1/50 до 1/200. Ресуспендируют 20 мкг трипсина секвенирования класса в 40 мкл 50 мМ уксусной кислоты, добавляют 5 мкл (10 мкг трипсина) с Lys-C дайджеста, и инкубируют в течение 6 часов при 37 ° С. Используйте ту же концентрацию протеазы и протеазы-на-белка отношения для Lys-C, который используется для трипсина.

6. Обращенно-фазовая Пептид Добыча

  1. Подкисляют пептиды добавлением трифторуксусной кислоты (ТФУ) до конечной концентрации 0,5% (рН ≈ 2). Прикрепление колонки С18 в экстракционную коллектора. Используйте максимально возможную скорость потока для всех шагов, кроме погрузки и элюирования пептидов.
  2. Влажный колонка с 6 мл ацетонитрила (ACN). Промыть колонку с 6 мл 80% ACN, 0,1% трифторуксусной кислоты, затем уравновешивают 6 мл 0,1% TFA. Не допускайтеколонка всухую между шагами.
  3. Стоп давление вакуума и загрузить 500 мкг пептидов на колонку при скорости потока приблизительно 1 мл / мин. После того, как пептиды, связанный с колонки, перезагрузка вакууме и промывают 6 мл 0,1% TFA, а затем 3 мл буфера лимонной кислоты (0,09 М лимонной кислоты, 0,23 М Na 2 HPO 4, рН 5,5).
    Примечание: Более высокие количества пептидов могут быть помечены но колонка C18 связывающей способности должно быть по крайней мере в два раза выше, чем количество пептида, чтобы избежать потери образца.

7. На-колонке Пептид маркировки восстановительным Диметилирование (Реди Маркировка)

Выполните этот шаг под химической капотом, как цианистый водород выделяется в низкой концентрации в процессе маркировки.

  1. Подготовка 12 мл «легких» и «тяжелых» Реди буферов метилировать пептид свободные амины. Свет буфер Реди состоит из 0,8% формальдегида и 0,12 М натрийцианборгидрида балансовой атомов водорода в гоОДП природные распределения изотопные в буфер лимонной кислоты. Тяжелая буфер Реди состоит из 0,8% дейтерированном формальдегида и 0,12 М дейтерированном цианоборгидрида натрия в буфере лимонной кислоты.
  2. Столбец, содержащий пептиды Выдержите, добавив 10 мл либо легкие или тяжелые буферных Реди в пептидных содержащих колонны на скорости потока 1 мл / мин и повторить, чтобы обеспечить полное маркировку. Wash колонка 6 мл 0,1% TFA, а затем 1 мл 0,5% уксусной кислоты.
  3. Стоп вакуум и элюируют сначала меченых пептидов с 1 мл 40% ACN, 0,5% уксусной кислоты, затем 1 мл 80% ACN, 0,5% уксусной кислоты при скорости потока приблизительно 0,5 мл / мин. При желании, измерения эффективности маркировки отдельных образцов методом масс-спектрометрии перед смешиванием тяжелые и легкие образцы (см. "Представитель результаты"). Смешайте 1:01 тяжелые и легкие меченных проб пептидные быть количественно с помощью масс-спектрометрии.

8. Отдельный смеси пептидов по Базовая рН обращенной фазой (BPRP) хроматографии

Основные рН обращенной фазой (BPRP) хроматографии для разделения смеси пептидов на несколько фракций, которые независимо проанализированных LC-MS/MS увеличить охват протеома.

  1. Фракционирования смеси пептидов на колонке C18-ВЭЖХ с применением градиента возрастающей концентрации ACN в 10 мМ бикарбоната аммони (рН 8). Начнем с 5% (объем / объем) ACN в течение 5 мин, увеличится до 35% ACN в 60 мин, а затем до 90% ACN в течение 1 мин. Сохранить 90% ACN в течение 4 мин до снижения ACN до 5%, чтобы повторно уравновесить колонку в течение 9 мин. Сбор фракций 96 равным объемом в 96-луночный планшет (A1, чтобы H12). Монитор фракционирование с помощью УФ-детектора при 220 нм в то время как пептиды элюируя из колонки (10-70 мин для условий, описанных здесь).
  2. Объедините фракции из колодцев A1, C1, E1, и G1 (фракция А1), из лунки B1, D1, F1, и H1 (фракция B1), из скважин А2, С2, E2 и G2 (фракция А2) и, соответственно, для Остальные фракции. Снимите solvenт с использованием вакуумной центрифуге. Ресуспендируют пептиды из фракций A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, В8, A9, B10, A11, B12 и в 130 мкл 1 М urea/0.5% TFA и очищают с помощью StageTips, как описано в шаге 9. Магазин фракции В1, А2, В3, A4, B5, A6, В7, А8, В9, А10, В11 и А12 при -20 ° С.

9. Purify Пептиды по остановиться и пойти Добыча (StageTips)

Подготовка С18-StageTip 7 Микроколонки по упаковке 200 советов мкл пипетки с двух С18 дисков с внутренним диаметром (ID) 1,07 мм. Положите Stage Советы в пробирки Эппендорф. Использование микроцентрифуге мыть советы с 130 мкл метанола, затем 130 мкл 80% ACN, 0,5% уксусной кислоты. Равновесие StageTips с 130 мкл 0,1% TFA. Передача пептидную смесь до StageTips и промывают 130 мкл 0,1% TFA, а затем 40 мкл 0,1% TFA, а затем 40 мкл 0,5% уксусной кислоты. Элюции пептиды сначала с 20 мкл 40% ACN, 0,5% уксусной кислоты, затем 20 мкл 80% ACN, 0,5% уксусной кислоты. Комбинат элюатый сухой вакуумной фильтрацией.

10. Микрокапиллярной ЖХ-МС/МС

  1. Растворить пептиды в 1-5 мкл 5%-ной муравьиной кислоты, 5% ACN в концентрации приблизительно 1 мкг / мкл. Разрешать ~ 1 мкг пептидов на 100 мкм × 20 см C18-обращенно-фазовой колонки ВЭЖХ с градиентом 6-22% ACN в 0,125% муравьиной кислоты, применяемые в течение 75 или 100 мин при скорости потока ~ 300 Нл / мин.
  2. Определить пептиды с помощью LTQ Orbitrap Velos 12 или аналогичный жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии платформу с масс-спектрометр обеспечить высокое разрешение и высокую точность массовое. Используйте масс-спектрометра в режиме данных зависит от с полным МС сканирования (разрешение 60000) приобретенной в анализаторе Orbitrap. Создать линейного захвата ионов MS / MS спектры для 20 наиболее распространенных ионов, обнаруженных в полном спектре MS. Установите автоматическую регулировку усиления (АРУ) Цели 1 х 10 6 для полного МС и 2000 для MS / MS. Установить максимальное время накопления ионов до 1000 мсдля РС и 150 мсек для MS / MS. Исключить фрагментированные ионы пептид прекурсоров из дальнейшего отбора от MS / MS для 20-60 сек.

11. MS / MS сбора данных

Идентификации пептидов путем сравнения MS / MS спектры RAW файлов в теоретической базы данных с помощью алгоритма, такого как SEQUEST 8 с использованием этих параметров (табл. 1).

Таблица 1. Пептид базы данных по Параметры поиска.

Общие параметры полностью триптического пищеварения с до 2 пропустил раскол
25 частей на миллион предшественником толерантность ионный
1.0 Da фрагмент толерантность ионный
Статические Модификации 57,02146 Da на цистеин, carboxyamidomethylation
28,03130 Da на лизин и пептидной N-концом, свет этикетки Диметилирование
Динамические Модификации 15,99491 Da на метионина, окисление
6,03766 Da на лизин и пептидной N-концом, тяжелой этикетке Диметилирование
  1. Фильтровать пептиды до 1% ложных открытий с таким методом, в качестве целевого-приманка 9 стратегии, используя базу данных открытых рамок считывания в фактических и обратной ориентации.

12. Пептид Количественное

Рассчитать области тяжелой и легкой пар MS1 извлечены ионные хроматограммы (пиков MS1) и сигнальный пептид-шум (S / N) отношения 10. Включите пептидные пар только тогда, когда их средняя сигнал-НойСоотношение себе выше пяти. Количественная относительное обилие пептида в двух образцах, как отношение MS1 пиков тяжелых и легких версий одного и того же пептида (MS1 соотношении площадь пика). Рассчитать относительные белка распространенность в виде среднего коэффициента MS1 площади пика для всех пептидов в белке.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы оценили точность, точность и воспроизводимость Реди маркировки с помощью Saccharomyces CEREVISIAE и Clostridium phytofermentans Клеточные лизаты. Мы сначала количественно Реди эффективность маркировки смеси С. phytofermentans белковых лизатов из целлюлозы (тяжелый помечены, H) и глюкозы (светло этик...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Несколько точек сделать стабильным изотопом маркировки пептидов с использованием привлекательным методом для количественных протеомики восстановительное Диметилирование (Реди маркировки): недорогие реагенты маркировки (реагенты стоить менее $ 1 на образец), высокая скорость реакци?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов или другие конфликты интересов.

Благодарности

We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d'excellence to ACT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Trichloroacetic acidSigma-AldrichT9159protein precipitation
AcetoneSigma-Aldrich650501protein precipitation
Sodium dodecyl sulfateSigma-Aldrich71736denature, reduce protein
Sodium hydroxideSigma-AldrichS8045denature, reduce protein
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43816denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini CocktailRoche4693124001denature, reduce protein
IodoacetamideSigma-AldrichI6125alkylate protein
HEPESSigma-AldrichH7523resuspend, extract, label protein
Calcium chlorideSigma-AldrichC5670resuspend protein
Lysyl EndoproteaseWako Chemicals129-02541protein digestion
Sequencing grade trypsinPromegaV5111protein digestion
Acetic acidSigma-Aldrich320099protein digestion
Trifluoroacetic acidSigma-Aldrich299537Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridgesWatersWAT054960Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifoldWatersWAT200609Reversed-phase peptide extraction
AcetonitrileSigma-Aldrich14261various
FormaldehydeSigma-Aldrich252549“light” peptide labeling
CyanoborohydrideSigma-Aldrich71435“light” peptide labeling
Deuterated formaldehydeSigma-Aldrich492620“heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuterideCDN isotopesD-1797“heavy” peptide labeling
MESSigma-AldrichM3671peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size)Agilent770450-902basic pH reversed-phase chromatography
Formic acidSigma-Aldrich399388various
C18 Empore Disks3M14-386-3 STAGE tips
MethanolSigma-Aldrich494437STAGE tips

Ссылки

  1. Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
  2. Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
  3. Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
  6. Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
  7. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
  8. Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
  9. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  10. Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
  11. Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
  12. Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
  13. Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
  14. Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
  15. Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
  16. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  17. Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
  18. Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
  19. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  20. She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
  21. Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
  22. Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

89

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены