JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

Аннотация

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

Введение

Определение хоста и вирусные характеристики, которые влияют на ВИЧ-1 патогенез и прогрессирование заболевания имеет первостепенное значение для рационального проектирования вакцины. Клеточный иммунный ответ является ключевым компонентом человеческого иммунного ответа на ВИЧ-1 инфекции. Цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) необходимы для первоначального контроля острой виремии, и позволяют с хозяином, чтобы создать устойчивое состояние (уставка) вирусной нагрузки 1,2. Экспериментальный истощение этих эффекторных клеток приводит к потере вирусных управления 3,4. Несмотря на это, избежать мутации возникают в вирусном геноме, что подорвать CTL признание инфицированных вирусом клеток 5-9.

Некоторые аллели HLA были связаны с более низким уровнем вирусной нагрузки и более медленными прогрессирования заболевания в том числе B * 57, B * 27 и B * 81 10-15. Часть защитного благо аллелей HLA класса I может быть связано с тем, что они ориентированы на функционально ограниченных областей генома, такие как Gagи выберите для эвакуации мутаций, которые снижают способность вируса к репликации в пробирке 16-21. Хотя побег из клеточной иммунной системы полезно для вируса в контексте класса выбора HLA Я аллель, эффект этих мутаций может иметь дифференциальные последствия для хозяина при передаче на HLA-несоответствие индивидуального 22,23. Таким образом, понимание последствий передаваемых HLA-ассоциированных эвакуации мутаций на вирусной мощностью репликации будет важно углубить наше понимание ранней ВИЧ-1 патогенезе.

Несмотря на значительный прогресс был достигнут, чтобы идентифицировать и охарактеризовать фитнес дефекты отдельных мутаций эвакуации, связанных с конкретной HLA класса I аллелей 24-29, естественным штаммы ВИЧ-1 были уникальные и сложные следы HLA-ассоциированного полиморфизма, вероятно, возникающие в связи с HLA -опосредованной иммунная давление различных иммуногенетических фоны 30. В арrevious анализ, Goepfert др. показал, что накопление HLA-ассоциированных мутаций в передаваемых Gag последовательностей, полученных из 88 остро инфицированных Замбии было связано со снижением уставки вирусной нагрузки 31. Это позволило предположить, что передача вредных мутаций эвакуации, в частности, в Gag, чтобы HLA-получателей несоответствие обеспечивает клинический эффект, и могут быть ослаблены вследствие вирусной репликации. Двигаясь вперед, необходимо изучить, насколько сложным комбинации Gag полиморфизмов в природе изолятов работать согласованно определить характеристики передаваемого вируса, таких как емкости репликации, и как рано репликация может в свою очередь влияет на ВИЧ-1 клинические параметры и поздней стадии Патогенез.

Брокман и др. Впервые показали связь между способностью репликации кляп-про последовательностей, выделенных во время хронической инфекции стадии и вирусной нагрузки в обоих подтипа C и B инфекций32-35. Экспериментальный подход представлены в этих исследованиях, хотя подходящими для изучения возможностей репликации в пробирке последовательностей, полученных из хронически инфицированных лиц, имеет несколько технических предостережений и ограничений, которые делают изучающих ВИЧ-1 репликативной способности в подтипа C остро инфицированных трудно. Этот метод основан на рекомбинации основе население ПЦР-амплифицированных последовательностей в подтипа B NL4-3 провирусом, производного частично от LAV, лаборатория адаптированы вирусов запас 36. Вирус поколение было достигнуто путем ко-трансфекции с СЕМ на основе линии Т-клеток 37 с ПЦР-ампликонов и расщепляли дельта-GAG-Pro NL4-3 ДНК. Этот метод требует вырост вируса в течение нескольких недель или месяцев, потенциально перекоса природу выделенного вируса складе в отношении вирусных квазивидов в живом организме, и, следовательно, изменения измерение мощности репликации в пробирке. Этот метод яS больше подходит для изучения хронически инфицированных индивидуумов, где он эффективно выбирает на вирус с самой высокой репликативной способности, и где клонирование многочисленные различные вирусные варианты с большим количеством хронически инфицированных лиц довольно трудоемким и, следовательно, не представляется возможным. Тем не менее, в рамках остро инфицированным человеком, там, как правило, 1:59 варианты присутствуют, и, таким образом, устраняя риск перекоса природу восстановленного вируса складе, через в пробирке давлений отбора, позволяет для более точной оценки в пробирке емкостью репликации. Во-вторых, этот метод требует рекомбинации подтип C кляп-про последовательности в подтип B полученной позвоночника, и может ввести магистральных несовместимости предубеждения в анализ. Вследствие этих ограничений, большое количество последовательностей должны быть проанализированы с целью преодоления любых потенциальных предубеждений, введенные.

Здесь мы опишем альтернативный экспериментальный APPROACH подходит для изучения последовательности, полученные из подтипов C остро инфицированных. Мы используем рестрикции стратегию, основанную клонирования ввести ген рвотный полученный из острых моментов времени инфекция ВИЧ-1 подтипа С инфицированных лиц в подтип C провирусного позвоночника, MJ4. Использование MJ4 в качестве общего позвоночника в которой клонировать гены кляп имеет решающее значение для анализа подтипа C полученных последовательностей. MJ4 является производным от первичного изолята 38, и, таким образом, менее вероятно, чтобы ввести смещение вследствие несовместимости между подтипа позвоночника и рвотным гена. Кроме того, подход с использованием фермента рестрикции на основе клонирование позволяет провирусной конструкции для трансфекции непосредственно в клетки 293Т, и для восстановления клонального вирусного штамма, идентичной последовательности клонированного затычки.

Метод, представленный ниже, является высокая метод пропускная способность для оценки способности репликации подтипа C происходит Gag-MJ4химерные вирусы. Трансфекцию в клетках 293Т является простым и восстановление вируса занимает всего три дня. В пробирке емкость репликации анализируют на той же CEM-CCR5 основе линии Т-клеток, созданной Брокман соавт. 37, но с использованием важные изменения протокола необходимо для успешного тиражирования из подтипов C MJ4 химерных вирусов. Использование соответствующей линии Т-клеток, а не МНПК позволяет для большого числа подтип С MJ4-химерных вирусов, которые будут протестированы с высокой анализа воспроизводимости. Наконец, с помощью меченого обратной транскриптазы анализа для количественного определения вируса в супернатанте является более экономически эффективным, чем с использованием коммерчески доступного p24 ELISA комплектов. Это также дает более широкий динамический диапазон, который был важен для обнаружения как плохо и очень реплицирующиеся вирусы внутри же анализе и для обнаружения тонкие различия в репликации между изолятов.

В заключение, метод, представленный здесь позволилоуглубленное изучение способности репликации кляп последовательностей, взятых у ВИЧ-1 подтипа C остро инфицированных лиц из Замбии, и как написано, может также быть расширен для изучения другой подтип C зараженный населения. Наблюдался высокая степень изменчивости в емкостях репликации между различными изолятов Gag. Кроме того, мы смогли показать статистическую связь между мощностью репликации передаваемого Gag и установить точки вирусной нагрузки, а также с CD4 + упадка в течение 39 три года. Такие результаты указывают на важность изучения как передаются вирусные характеристики, такие как емкости репликации, взаимодействуют с иммунной системой хозяина влиять патогенеза в начале инфекции и будет неотъемлемой частью для разработки эффективных мер вакцины, а также лечение.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1 Усиление ВИЧ-1 кляп гена от Infected, Frozen Plasma

  1. Выделите вирусную РНК из 140 мкл талых инфицированных ВИЧ-1 в плазме с использованием набора для экстракции.
    1. Когда это возможно, незамедлительно приступить к синтеза кДНК после экстракции РНК как разморожены вирусная РНК дает наилучшие результаты амплификации. Если это возможно, установить ПЦР основной смеси для первого раунда амплификации ДНК и хранить при температуре 4 ° С до вирусного выделения РНК.
  2. Обратный-транскрибировать кДНК из РНК и амплификации ДНК-продукты в первом раунде с помощью обратной транскриптазы и термостабильной ДНК-полимеразы в одностадийном RT-PCR.
    1. Возьмите РНК из -80 ° C морозильник (если было необходимо замораживание) и кратко оттепели при комнатной температуре, затем поместить в холодную блока. Передача 5 мкл РНК в каждую ПЦР-пробирку, содержащую 45 мкл мастер-смеси с получением конечного объема 50 мкл. Сразу же место оставшиеся образцы РНК в -80 ° C морозильник.
    2. После ферментdded в первом раунде ПЦР мастер-микс (Таблица 1А), аликвотной 45 мкл в каждую тонкостенной ПЦР-амплификации трубки для ряда реакций желаемых. Обязательно используйте ПЦР пробирок с отдельными крышками, а не лишить колпачки для обеспечения минимального перекрестного загрязнения между образцами. Поместите ПЦР трубы в холодном блоке, чтобы защитить чувствительный RT фермента РНК-шаблон и температуры. Примечание: Образцы должны быть запущены в трех экземплярах для того, чтобы адекватно отведать вирусные квазивидов. Кроме того, важно, чтобы использовать продукт с высокой точностью фермента ДНК-полимеразы с целью минимизации ПЦР-введенную основанных на ошибке включени. Пожалуйста, обратитесь к списку реагентов для рекомендуемого продукта.
    3. После матрицы РНК была добавлена ​​всех реакционных труб, передачи ПЦР пробирок в амплификатор для амплификации с помощью программы Cycler, описанный в таблице 1В. Примечание: Продукт этой усиления будет использоваться во втором раунде ПЦР.
  3. Выполните вложенными себеусл-тур ПЦР-амплификации, используя 1 мкл первого раунда ПЦР-амплификации (1.2) в качестве матрицы ДНК.
    1. Алиготе 49 мкл второго круга ПЦР мастер-микс (Таблица 2A) к каждой тонкостенной ПЦР-пробирку для ряда реакций желаемых. Передача 1 мкл из первого раунда ПЦР-амплификации с каждой реакционной трубы, чтобы дать конечного объема 50 мкл. Примечание: Это будет служить матричной ДНК для второго круга усиления. Важно также использовать ДНК-полимеразы с очень высокой точностью и корректура возможностей для того, чтобы свести к минимуму ПЦР-введенный основанных на ошибке включени. Пожалуйста, обратитесь к списку реагентов для рекомендуемого продукта.
    2. Трансфер второго круга ПЦР реакции микс Термоциклеры и программу запуска, описанную в таблице 2B. Примечание: После завершения программы, продукты этой реакции будут работать на агарозном геле, чтобы подтвердить получение продукта.
  4. Добавить 3 мкл 5х загрузки красителя 5 и #181; л из 50 мкл второго раунда реакционного объема и работать при 120 В на 1% агарозном ТАЕ-геле, содержащем УФ-флуоресцентным красителем ДНК, пока полосы не будут решены. Визуализация 1,6 кб полосы на синем света осветителя (рисунок 1А).
  5. Запустите оставшиеся 45 мкл реакционного объема на 1% агарозном-TAE геля, содержащего пятно ДНК, и вырезать соответствующие полосы с чистым лезвием бритвы.
    1. Извлечение ДНК из геля среза с использованием набора для очистки гель, элюируют в нуклеазы без воды, объединить три положительные реакции на человека, и заморозить продукт при -20 ° С для последующего использования.

2. Подготовка кляп Ампликоны для клонирования по внесение необходимых сайтов рестрикции

  1. Amplify длинного концевого повтора (LTR) / 5 'UTR часть плазмиды MJ4 (таблица 3).
  2. Представьте 1.3 кб продуктов ПЦР на осветителя, акцизные положительные ампликоны, гель для очистки и заморозить как ранееописано (1.4,1.5; рис 1В).
  3. Создать слиты MJ4 LTR- кляп ампликоны через "сплайсинга перекрытия-расширения" ПЦР (таблица 4).
  4. Представьте, акциз, очистить и заморозить 3,2 кб ампликоны как в 1.4,1.5 (смотрите рисунок 1С).

3. Клонирование Усиленный кляп гены в MJ4, подтип C, инфекционных молекулярной Clone

  1. Дайджест 1,5 мкг MJ4 плазмиды и 1,5 мкг очищенного продукта LTR- кляп ПЦР с BclI (метилирование чувствительны) рестриктазы для 1,5 ч при 50 ° С (см таблицу 5A).
  2. Добавить 1 мкл NgoMIV к реакции переваривания и инкубируют при 37 ° С в течение 1 часа.
  3. Добавить 5x красителем к ограничению переварить реакции и медленно electrophorese общий объем на 1% агарозном ТАЕ-геле, содержащем ДНК из геля пятно в течение 1-2 ч при 100 В. визуализации, акциза и очистить указанные полосы для клонирования, как ранее алфавитуribed (рисунок 2).
  4. Подготовьте перевязки реакции с использованием очищенного LTR- рвотный вставку и MJ4 векторной ДНК в 3: 1 вставки соотношения вектора. Инкубируйте реакции лигирования в течение ночи при 4 ° С (таблица 5B).
  5. Преобразование JM109 химически компетентные бактерии с лигирования продуктов и выкладывают на LB чашках с агаром с 100 мкг / мл ампициллина и расти при 30 ° С в течение 22+ часов.
    1. Оттепель JM109 компетентных клеток на льду в течение 15 мин. Этикетка 1,5 мл микроцентрифужных пробирок и охладить на льду.
    2. Алиготе 50-100 мкл JM109 клеток предварительно охлажденной 1,5 мл микроцентрифужных пробирок. Добавить 2,5-5 мкл реакции связывания в JM109 клеток, стряхивая трубку слегка перемешать и сразу же возвращаются на лед. Инкубируйте компетентных клеток с продуктом лигирования на льду в течение 30 мин.
    3. Тепловой удар 1,5 мл микроцентрифужных пробирок, содержащих JM109 компетентных клеток и реакцию лигирования в 42 ° C тепла блока в течение 45 с и вернуться на лед в течение не менее 3 мин.
    4. Добавить 50 мкл SOC сред к каждому микроцентрифужных трубки и пластины всю реакцию на преобразование при комнатной температуре LB-агаром с добавлением 100 мкг / мл ампициллина.
    5. Передача пластины до 30 ° С инкубатор и оставить на 20 часов, или до тех пор, колонии не будут четко сформированы.
  6. Выбор изолированных колоний и расти в 4 мл LB с 100 мкг / мл ампициллина, при 30 ° С в течение 22+ часов.
  7. Спин вниз культур в 3200 мкг в течение 15 мин, слить бульон, и извлечь ДНК плазмиды.
  8. Для подтверждения клонирования верность, сократить минипрепаративную ДНК с NgoMIV и HpaI ферментов рестрикции в двойной переварить при 37 ° С в течение 2 часов. Анализ на 1% агарозном ТАЕ-геле (таблица 5, в).
  9. Последовательность LTR-GAG вставка область каждой плазмиды с использованием следующих праймеров: GagInnerF1, GagF2, REV1, rev3 и GagR6 (Таблица 6), чтобы подтвердить идентичность последовательности.
  10. Сравнение клонированных последовательностей, полученных с последовательностями населения дерived от первоначального очищенной ампликоне от 1.5.1. Примечание: Важно, в конечном счете оценить потенциал репликации двух независимых клонов, чтобы гарантировать, что любые в пробирке фенотипы репликации не связаны с магистральных ошибок, вносимых в процессе клонирования.

4 поколение и титрование репликации компетентных Gag-MJ4 химерных вирусов

  1. Генерация репликации компетентного вируса путем трансфекции 1,5 мкг химерного MJ4 плазмиды ДНК минипрепаративную в клетках 293Т с использованием 4: соотношение Fugene HD 1, как описано в Prince соавт 39.
  2. Титр собирают вирусные акции на ТЗМ-BL клеток, как описано ниже и в Принс и соавторы 39.
    1. Пластинчатые ТЗМ-бл клетки 24 часа в сутки до заражения вирусом, чтобы иметь на 30-40% монослоя сливающийся клеток на следующий день. Это обычно может быть достигнуто путем добавления 5 × 10 4 клеток в общем объеме 800 мкл на лунку в 24-луночный планшет.
    2. После добавления клеток в лунку, слегка перемещать 24-луночного планшета вперед и назад, а затем из стороны в сторону для того, чтобы эффективно распределить клетки. Никогда не циркулируют - это приведет к клеток, накапливающихся в центре пластины.
    3. На следующий день, подготовить 1% FBS в DMEM; это будет использоваться для разбавления DEAE-декстрана и для разбавления вируса натуральной оспы. Со DEAE-декстран 10 мг / мл или 125x, и конечная концентрация 80 мкг / мл или 1x желательно.
    4. Выньте вирусов запас для тестирования от -80 ° C морозильник и место на шейкере таять при комнатной температуре.
    5. Использование многоканальную пипетку, последовательно разбавленной запасами вируса в культуре круглым дном ткани обрабатывают 96-луночный планшет с крышкой. Это протокол разведения в 3 раза. Смотреть таблицу 7 для схемы разбавления.
    6. Удалить носитель из посеянных 24-луночных планшетах ТЗМ-бл при помощи вакуумного аспиратора решений, чтобы не нарушить клеточный монослой. Только извлекайте носитель из одного 24-луночного планшета в то время, так что клетки делаютне высыхают.
    7. Добавить 150 мкл 1х DEAE-декстрана + 1% FBS в DMEM смеси в каждую лунку с использованием 1000 мкл пипетки. Не использовать повторное пипетки, так как это нарушает монослой.
    8. Добавить 150 мкл каждого разведения вируса в соответствующую лунку. Добавить вирус в центре скважины и вихревой нежно, чтобы равномерно распределить вирус через клеточный монослой. Инфицированные клетки инкубируют в течение 2 ч в инкубаторе для тканевых культур при 37 ° С и 5% СО 2.
    9. После 2 ч инкубации, добавление 0,5 мл 10% FBS в DMEM в каждую лунку и возврата пластин в инкубаторе в течение еще 48 часов.
    10. Через 48 ч клетки должны быть на 100% сливной. Потому MJ4 является репликация компетентный вирус, будет некоторое гибель клеток, но это и следовало ожидать.
    11. Удалить СМИ из каждой лунки и добавить 400 мкл / лунку фиксации решение (см Таблицу 8A для рецепта). Закрепить только одна пластина одновременно. Добавить фиксации решение с использованием 1000 мкл пипетки, и оставьте на 5 мин припри комнатной температуре.
    12. Удалить крепежный решение и промыть 3 раза с PBS с Са 2 + / Mg 2 +. Используйте шприц бутылку осторожно добавить PBS в сторону колодца, чтобы избежать нарушения монослой. После третьего промывания, промокните знак сухой на впитывающую бумагу.
    13. Добавить 400 мкл / лунку окрашивание раствора (таблица 8B для рецепта) в каждую лунку 24-луночного планшета и инкубировать при 37 ° С в течение по крайней мере 2 часов. Более длительное время инкубации являются приемлемыми, но время инкубации должны храниться в соответствии между титрованием экспериментов.
    14. Вымойте 2x с PBS с Са 2 + / Mg 2 + и забить на инфекции, или добавить PBS и хранят при температуре 4 ° С для озвучивания позже. Плиты можно хранить при 4 ° С в течение до четырех дней, до тех пор, монослой хранится гидратированный.
    15. Забить на инфекции, использовать постоянный маркер разделить лунки пластины 24-а на сектора. Подсчет всех синих клеток в поле зрения, используя общее увеличение порядка 200Х, один раз вкаждого из четырех квадрантов скважины.
    16. Вычислить инфекционных единиц на мкл следующим образом: [(# синий клеток / 4) × 67] / (мкл вирус, добавленный) = МЕ / мкл. В Таблице 8C по объему в мкл вируса в каждую лунку добавляли. Средние несколько скважин вместе; цифры должны быть относительно одинаковы для точного титрования.

5 приготовления питательных сред и распространении GXR25 клеток для экстракорпорального репликации Пробирной

  1. Подготовить всю RPMI (cRPMI) для распространения GXR25 клеток. ПРИМЕЧАНИЕ: Это чрезвычайно важно, чтобы культура GXR25 клеток не менее 4 месяцев до запланированных экспериментов репликации (таблица 9).
  2. Разбить ячейки 1:10 два раза в неделю и поддерживать плотность клеток между 1 х 10 5 до 2 × 10 6 клеток / мл.

6. Экстракорпоральное тиражирования Gag-MJ4 химерами в GXR25 (CEM-CCR5-GFP) Клетки

  1. Накануне Infection, разделить клетки в концентрации между 2-3 × 10 5 клеток / мл таким образом, что они находятся в логарифмической фазе роста в день инфекции.
  2. В день инфицирования, удалить с запасами вируса от -80 ° C морозильник и оттепели. Рассчитать объем необходимой вируса от каждого складе на основе МЕ / мкл титра от ПЗМ-BL анализе клеток для того, чтобы инфицировать 5 х 10 5 клеток GXR25 при множественности заражения 0,05, используя формулу:
    Объем вируса для заражения (мкл) = 1 мкл / X МЕ х 0,05 х 500000
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы выбрали МВД 0,05, как это приводит к логарифмической фазе роста для всех вирусов, которые мы проверили. Важно провести начальные эксперименты, чтобы определить оптимальный MOI, чтобы захватить логарифмический рост на вирус, подлежащего испытанию.
  3. Развести вирус в cRPMI до объема 100 мкл (для того, чтобы достичь 0,05 MOI) и добавить в лунку культуры V-Нижний ткани обрабатывают 96-луночного планшета. Примечание: включать как positiве (MJ4 WT зараженный) и отрицательный (макет инфицированные клетки) контроль в каждой серии экспериментов репликации. Настройте пластину таким образом, что каждый второй столбец пустой ограничить перекрестное загрязнение между скважинами. Положительный контроль является обязательным, так как он будет использоваться в дальнейшем в качестве стандарта для нормализации склоны репликации, которые мерой скорости репликации экспериментальных повторах.
  4. Количество GXR25 клеток с использованием автоматизированной счетчика клеток. Подсчитайте количество клеток, необходимых в общей для всех инфекций (5 х 10 5 х # инфекции). Алиготе необходимый объем в 50 мл коническую трубку и центрифуги для осаждения клеток. Всегда рассчитывать на 25% больше инфекций, чем нужно.
  5. Аспирируйте СМИ тщательно и ресуспендируют в cRPMI в концентрации 5 × 10 5 клеток / 100 мкл.
  6. Внесите клеток в стерильной корыто и тщательно перемешать. Использование пипетки многоканальный, добавьте 100 мкл клеток в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего разбавленный вирус. Мих тщательно.
  7. Добавить 2 мкл 5 мг / мл (100x) раствору полибрена в каждую лунку и смешать клетки тщательно.
  8. Инкубируют при 37 ° С в культуре ткани инкубаторе с 5% CO 2 в течение 3 часов.
  9. Для того, чтобы вымыть инфицированные клетки, центрифуги 96-луночный V-нижняя пластина для осаждения клеток. Затем осторожно удалить 150 мкл среды и заменить свежими 150 мкл cRPMI не нарушая осадок клеток. Повторите еще 2 раза (в том числе центрифугирования), чтобы достаточно мыть клетки.
  10. После последнего центрифугирования и добавлением 150 мкл cRPMI, ресуспендируют осадок клеток с помощью многоканальной пипетки и добавить весь клеток / вируса смесь (примерно 200 мкл) из каждой лунки независимо друг от друга до 800 мкл cRPMI в лунку 24-луночного культура пластины.
  11. Место пластины в 5% CO 2 культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ° C.
  12. Каждые два дня, удалить 100 мкл надосадочной жидкости с поверхности культуры хорошо и передать 96-луночный U-bottom пластины и хранить в замороженном виде при -80 ° С до запуска вируса количественный анализ. Примечание: Тщательное размещение супернатантах в 96-луночных планшетах позволит для передачи пипетки многоканального из культуральных супернатантов в течение вириона количественного через меченного обратной транскриптазы (RT) анализа. Каждая тарелка должна содержать образцы из стандарта инфекции с целью нормализации изменение между пластины в аналитическом считывания РТ.
  13. После удаления каждого образца 100 мкл, разбить ячейки 1: 2, тщательно ресуспендированием клеток и удаления половину оставшегося объема (450 мкл). Восстановление первоначального объема (1 мл), добавляя 550 мкл свежей cRPMI в каждую лунку.

7 Анализ обратной транскриптазы (RT) в надосадочной жидкости культуры клеток

Протокол адаптировано из Островского и др 40.

  1. Настройка биологический защитный кожух в BSL-3 объекта для использования с радиоактивными материалами.
    1. Поместите фильтровальной бумагой в ого-год и заменить аспиратор для аспиратора предназначен для радиоактивных использования. Примечание: Все радиоактивные отходы должны быть утилизированы неправильно с согласно правилам техники безопасности.
  2. Добавить 1-2 мкл 10 мКи / мл [α- 33 P] дТТФ и 4 мкл 1 М дитиотреитола (DTT) в каждую 1 мл аликвоты RT мастер-смеси (таблица 10 и Ostrowski и соавт. 40).
  3. Тщательно перемешать каждый 1,5 мл микроцентрифужную трубку РТ мастер-микс, DTT, и [α- 33 P] дТТФ с 1000 мкл пипетки и переносят в стерильную корыта.
  4. 25 мкл меченого комнатной температуре смешивают в каждую лунку 96-луночного тонкостенной пластины ПЦР. Примечание: Включите пространство для положительного контроля (MJ4 WT инфекции) и отрицательного контроля (Мок инфекции).
  5. Добавить 5 мкл каждого супернатанта к пластине ПЦР, содержащего основной смеси RT.
  6. Уплотнение ПЦР пластины с покрытием из фольги клей и инкубируют в течение 2 ч при 37 ° С в амплификатор. По соображениям безопасности, РинSE наконечники с Amphyl и распоряжаться советы в небольшой контейнер, содержащих Amphyl отходов, которые в дальнейшем будут утилизировать в радиоактивных отходов.
  7. После инкубации, сделать маленькие отверстия в крышке из фольги с использованием 200 мкл многоканальный пипетки. Примечание: Если наконечники трогать жидкости в хорошо, заменить советы, прежде чем перейти к следующему строки или столбца.
  8. Mix образцы 5x и передача 5 мкл каждого образца к DE-81 бумаги. Воздух сухой 10 мин.
  9. Wash блоты 5x с 1х SSC (хлорид натрия, цитрат натрия), а затем 2x с 90% этанола в 5 мин на каждую промывку. Дайте высохнуть на воздухе.
    1. Место каждого кляксу в отдельном стиральной контейнер, например, ящик для хранения сэндвич, добавить достаточно промывочный буфер (1x SSC или 90% этанол), чтобы покрыть кляксу, и встряхивают в течение 5 мин.
    2. Вылейте промывочного буфера в отдельном контейнере и повторите. Примечание: первые 3 моет считаются радиоактивными и должны быть утилизированы должным образом. Последние 2 моющие средства могут быть утилизированы регулярно.
  10. После высыхания, автомобильefully обернуть пятном в Саран обернуть и выставить на phosphoscreen в плотно закрытой кассеты в течение ночи при комнатной температуре.
  11. Анализ phosphoscreens с Phosphorimager и количественно радиоактивные стенограммы.
  12. Нарисуйте круг вокруг каждого радиоактивного сигнала с использованием OptiQuant программного обеспечения. Графике Digital Light Unit (DLU) величины для построения кривых репликации.
  13. В целях получения оценки потенциала репликации, значения DLU были журнал 10 -transformed и склоны были рассчитаны с использованием день 2, 4, и 6 временных точек. Репликация склоны затем делится на склоне WT MJ4 в порядок генерировать десятки мощности репликации. Важно, чтобы нормализовать на основе значений MJ4 WT, полученных из того же RT пластины, чтобы уменьшить вариабельность внутри теста.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для того чтобы правильно выполнить этот протокол, который создает провирусную плазмиды, способной сборки полностью функциональные, инфекционные химеры Gag-MJ4, большое внимание должно быть принято, чтобы генерировать соответствующие ампликоны ПЦР. Определение ПЦР породила ли соответст...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Благодаря длине и технического характера этого протокола, есть несколько шагов, которые имеют решающее значение как для успешного строительства химерных Gag-MJ4 плазмид, а также для количественного определения вирусной мощностью репликации. Хотя на основе стратегии клонирования рестри...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

The investigators thank all the volunteers in Zambia who participated in this study and all the staff at the Zambia Emory HIV Research Project in Lusaka who made this study possible. The investigators would like to thank Jon Allen, Smita Chavan, and Mackenzie Hurlston for technical assistance and sample management. We would also like to thank Dr. Mark Brockman for his discussions and generous donation of the GXR25 cells.

This study was funded by R01 AI64060 and R37 AI51231 (EH) and the International AIDS Vaccine Initiative. This work was made possible in part by the generous support of the American people through the United States Agency for International Development (USAID). The contents are the responsibility of the study authors and do not necessarily reflect the views of USAID or the United States Government. This work also was supported, in part, by the Virology Core at the Emory Center for AIDS Research (Grant P30 AI050409). DC and JP were supported in part by Action Cycling Fellowships. This work was supported in part by the Yerkes National Primate Research Center base grant (2P51RR000165-51). This project was also funded in part by the National Center for Research Resources P51RR165 and is currently supported by the Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PCR Reagents
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standard desalt
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
Nuclease free waterFisherSH30538FSManufactured by Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
Simport PCR 8 Strip Tubes, Blue (Flat Cap)DaiggerEF3647BX
SuperScript III one-step RT-PCR systemLife Technologies/Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II DNA polymeraseFisherF-549L
PCR Nucleotide MixRoche4638956001
Agarose, high gel strengthFisher50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
Promega 1 kb DNA ladderFisherPRG5711Manufactured by Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000xLife Technologies/InvitrogenS33102
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up SystemPromegaA9282
Razor blades, single-edgedFisher12-640Manufactured by Surgical Design
Thermocycler, PTC-200MJ Research
Microbiology & Cloning Reagents
LB Agar, MillerFisherBP1425-2
LB Broth, LennoxFisherBP1427-2
Sterile 100 x 15 mm polystyrene Petri dishesFisher08-757-12
Ampicillin sodium saltSigma-AldrichA9518-5G
Falcon 14 ml Polypropylene round-bottom tubesBD Biosciences352059
NgoMIV restriction endonucleaseNew England BioLabsR0564L
BclI restriction endonucleaseNew England BioLabsR0160L
HpaI restriction endonucleaseNew England BioLabsR0105L
T4 DNA Ligase, 5 U/μlRoche10799009001
JM109 competent cells, >108 cfu/μgPromegaL2001
PureYield plasmid miniprep systemPromegaA1222
Safe Imager 2.0 Blue Light TransilluminatorInvitrogenG6600
Microfuge 18 centrifugeBeckman Coulter367160
Cell Culture Reagents
Amphyl cleaner/disinfectantFisher22-030-394
Fugene HD, 1 mlVWRPAE2311Manufactured by Promega
Hexadimethrine bromide (Polybrene)Sigma-AldrichH9268-5G
Costar Plates, 6-well, flatFisher07-200-83Manufactured by Corning Life
Costar Plates, 24-well, flatFisher07-200-84Manufactured by Corning Life
Costar Plates, 96-well, roundFisher07-200-95Manufactured by Corning Life
Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm2Fisher10-126-37
Flasks, Corning filter top/canted neck, 150 cm2Fisher10-126-34Manufactured by Corning Life
Conical Tubes, 50 ml, blue capFisher14-432-22Manufactured by BD Biosciences
Conical Tubes, 15 ml, blue capFisher14-959-70CManufactured by BD Biosciences
Trypsin-EDTAFisherMT25052CIManufactured by Mediatech
RPMI, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11965-118
Penicillin/Streptomycin/Glutamine, 100xLife Technologies/Invitrogen10378-016
PBS with magnesium and calcium, 500 mlLife Technologies/Invitrogen14040-133
PBS without magnesium and calciumLife Technologies/Invitrogen20012-050
Sarstedt tubes, assorted colorsSarstedt72.694.996
Reservoir Trays for Multichannel, 55 mlFisher13-681-501
DEAE-DextranFisherNC9691007
Corning 96 well clear V bottom tissue culture treated microplateFisher07-200-96Manufactured by Corning Life
HEPES, 1 M Buffer SolutionLife Technologies/Invitrogen15630-080
FBS, Defined, 500 mlFisherSH30070 03
X-galVWRPAV3941Manufactured by Promega
Glutaraldehyde, Grade II, 25% in H2OSigma-AldrichG6257-100ML
1 M Magnesium chloride solutionSigma-AldrichM1028-100ML
Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5%Sigma-AldrichF8775-500ML
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrateSigma-AldrichP9387-100G
Potassium hexacyanoferrate(III)Sigma-AldrichP8131-100G
Allegra X15-R centrifugeBeckman Coulter392932
TC10 automated cell counterBio-Rad1450001
VistaVision inverted microscopeVWR
Reverse-Transcriptase Quantification Assay Reagents
dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCiPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0Life Technologies/Invitrogen15568025Must be adjusted to pH 7.8 with KOH
2 M Potassium chloride (KCl)Life Technologies/InvitrogenAM9640GAdjust to 1 M solution
0.5 M EDTALife Technologies/Invitrogen15575-020
Nonidet P40Roche11333941103
Polyadenylic acid (Poly rA) potassium salt Midland Reagent Co.P-3001
Oligo d(T) primerLife Technologies/Invitrogen18418-012
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815-1G
SR, Super Resolution Phosphor Screen, SmallPerkin-Elmer7001485
Corning Costar Thermowell 96-well plate model (M) PolycarbonateFisher07-200-245Manufactured by Corning Life
Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, NonsterileFisher07-200-684Manufactured by Corning Life
DE-81 anion exchange paperWhatman3658-915
Trisodium citrate dihydrateSigma-AldrichS1804-1KG
Sodium ChlorideFisherS671-3
Autoradiography cassetteFisherFB-CA-810
Cyclone storage phoshpor screenPackard

Ссылки

  1. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 68, 6103-6110 (1994).
  2. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. Journal of virology. 68, 4650-4655 (1994).
  3. Jin, X., et al. Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. The Journal of experimental medicine. 189, 991-998 (1999).
  4. Schmitz, J. E., et al. Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science. 283, 857-860 (1999).
  5. Brumme, Z. L., et al. Marked epitope- and allele-specific differences in rates of mutation in human immunodeficiency type 1 (HIV-1) Gag, Pol, and Nef cytotoxic T-lymphocyte epitopes in acute/early HIV-1 infection. Journal of virology. 82, 9216-9227 (2008).
  6. Leslie, A. J., et al. HIV evolution: CTL escape mutation and reversion after transmission. Nature medicine. 10, 282-289 (2004).
  7. Phillips, R. E., et al. Human immunodeficiency virus genetic variation that can escape cytotoxic T cell recognition. Nature. 354, 453-459 (1991).
  8. Price, D. A., et al. Positive selection of HIV-1 cytotoxic T lymphocyte escape variants during primary infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 1890-1895 (1997).
  9. Goulder, P. J., et al. Late escape from an immunodominant cytotoxic T-lymphocyte response associated with progression to AIDS. Nature. 3, 212-217 (1997).
  10. Tang, J., et al. Favorable and unfavorable HLA class I alleles and haplotypes in Zambians predominantly infected with clade C human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 76, 8276-8284 (2002).
  11. Prentice, H. A., et al. HLA-B*57 versus HLA-B*81 in HIV-1 infection: slow and steady wins the race. Journal of virology. 87, 4043-4051 (2013).
  12. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 2709-2714 (2000).
  13. Leslie, A., et al. Additive contribution of HLA class I alleles in the immune control of HIV-1 infection. Journal of virology. 84, 9879-9888 (2010).
  14. Kaslow, R. A., et al. Influence of combinations of human major histocompatibility complex genes on the course of HIV-1 infection. Nature medicine. 2, 405-411 (1996).
  15. Altfeld, M., et al. Influence of HLA-B57 on clinical presentation and viral control during acute HIV-1 infection. AIDS. 17, 2581-2591 (2003).
  16. Kiepiela, P., et al. CD8+ T-cell responses to different HIV proteins have discordant associations with viral load. Nature medicine. 13, 46-53 (2007).
  17. Mothe, B., et al. Definition of the viral targets of protective HIV-1-specific T cell responses. Journal of translational medicine. 9, 208(2011).
  18. Peyerl, F. W., Barouch, D. H., Letvin, N. L. Structural constraints on viral escape from HIV- and SIV-specific cytotoxic T-lymphocytes. Viral immunology. 17, 144-151 (2004).
  19. Rolland, M., et al. Broad and Gag-biased HIV-1 epitope repertoires are associated with lower viral loads. PloS one. 3, e1424(2008).
  20. Wagner, R., et al. Molecular and functional analysis of a conserved CTL epitope in HIV-1 p24 recognized from a long-term nonprogressor: constraints on immune escape associated with targeting a sequence essential for viral replication. J Immunol. 162, 3727-3734 (1999).
  21. Wang, Y. E., et al. Protective HLA class I alleles that restrict acute-phase CD8+ T-cell responses are associated with viral escape mutations located in highly conserved regions of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 83, 1845-1855 (2009).
  22. Chopera, D. R., et al. Transmission of HIV-1 CTL escape variants provides HLA-mismatched recipients with a survival advantage. PLoS pathogens. 4, e1000033(2008).
  23. Crawford, H., et al. Evolution of HLA-B*5703 HIV-1 escape mutations in HLA-B*5703-positive individuals and their transmission recipients. The Journal of experimental medicine. 206, 909-921 (2009).
  24. Boutwell, C. L., et al. Frequent and variable cytotoxic-T-lymphocyte escape-associated fitness costs in the human immunodeficiency virus type 1 subtype B Gag proteins. Journal of virology. 87, 3952-3965 (2013).
  25. Brockman, M. A., et al. Escape and compensation from early HLA-B57-mediated cytotoxic T-lymphocyte pressure on human immunodeficiency virus type 1 Gag alter capsid interactions with cyclophilin A. Journal of virology. 81, 12608-12618 (2007).
  26. Crawford, H., et al. Compensatory mutation partially restores fitness and delays reversion of escape mutation within the immunodominant HLA-B*5703-restricted Gag epitope in chronic human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 81, 8346-8351 (2007).
  27. Martinez-Picado, J., et al. Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 80, 3617-3623 (2006).
  28. Schneidewind, A., et al. Escape from the dominant HLA-B27-restricted cytotoxic T-lymphocyte response in Gag is associated with a dramatic reduction in human immunodeficiency virus type 1 replication. Journal of virology. 81, 12382-12393 (2007).
  29. Wright, J. K., et al. Impact of HLA-B*81-associated mutations in HIV-1 Gag on viral replication capacity. Journal of virology. 86, 3193-3199 (2012).
  30. Kawashima, Y., et al. Adaptation of HIV-1 to human leukocyte antigen class I. Nature. 458, 641-645 (2009).
  31. Goepfert, P. A., et al. Transmission of HIV-1 Gag immune escape mutations is associated with reduced viral load in linked recipients. The Journal of experimental medicine. 205, 1009-1017 (2008).
  32. Brockman, M. A., et al. Early selection in Gag by protective HLA alleles contributes to reduced HIV-1 replication capacity that may be largely compensated for in chronic infection. Journal of virology. 84, 11937-11949 (2010).
  33. Huang, K. H., et al. Progression to AIDS in South Africa is associated with both reverting and compensatory viral mutations. PloS one. 6, e19018(2011).
  34. Wright, J. K., et al. Gag-protease-mediated replication capacity in HIV-1 subtype C chronic infection: associations with HLA type and clinical parameters. Journal of virology. 84, 10820-10831 (2010).
  35. Wright, J. K., et al. Influence of Gag-protease-mediated replication capacity on disease progression in individuals recently infected with HIV-1 subtype. C. Journal of virology. 85, 3996-4006 (2011).
  36. Adachi, A., et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. Journal of virology. 59, 284-291 (1986).
  37. Brockman, M. A., Tanzi, G. O., Walker, B. D., Allen, T. M. Use of a novel GFP reporter cell line to examine replication capacity of CXCR4- and CCR5-tropic HIV-1 by flow cytometry. Journal of virology. 131, 134-142 (2006).
  38. Ndung'u, T., Renjifo, B., Essex, M. Construction and analysis of an infectious human Immunodeficiency virus type 1 subtype C molecular clone. Journal of virology. 75, 4964-4972 (2001).
  39. Prince, J. L., et al. Role of transmitted Gag CTL polymorphisms in defining replicative capacity and early HIV-1 pathogenesis. PLoS pathogens. 8, e1003041(2012).
  40. Ostrowski, M. A., Chun, T. W., Cheseboro, B., Stanley, S. K., Tremblay, M., et al. Detection assays for HIV proteins. Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan ... [et al.]. 12 (Unit 12 15), Forthcoming.
  41. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  42. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
  43. Bichara, M., Pinet, I., Schumacher, S., Fuchs, R. P. Mechanisms of dinucleotide repeat instability in Escherichia coli. Genetics. 154, 533-542 (2000).
  44. Ackerson, B., Rey, O., Canon, J., Krogstad, P. Cells with high cyclophilin A content support replication of human immunodeficiency virus type 1 Gag mutants with decreased ability to incorporate cyclophilin A. Journal of virology. 72, 303-308 (1998).
  45. Dudley, D. M., et al. A novel yeast-based recombination method to clone and propagate diverse HIV-1 isolates. BioTechniques. 46, 458-467 (2009).
  46. Ganser-Pornillos, B. K., von Schwedler, U. K., Stray, K. M., Aiken, C., Sundquist, W. I. Assembly properties of the human immunodeficiency virus type 1 CA protein. Journal of virology. 78, 2545-2552 (2004).
  47. Forshey, B. M., von Schwedler, U., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. Journal of virology. 76, 5667-5677 (2002).
  48. Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G., Haseltine, W. A. Effect of mutations affecting the p6 gag protein on human immunodeficiency virus particle release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 3195-3199 (1991).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

901GagMJ4CEMGXR25

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены