Производство гаплоидных эмбрионов данио по<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Оплодотворение

Резюме

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Аннотация

Данио стало основной позвоночных модель, которая имеет отношение к многим дисциплинам научного изучения. Данио рерио особенно хорошо подходит для прямого генетического анализа процессов развития в связи с их внешнего оплодотворения, эмбрионального размера, быстрое онтогенеза и оптической прозрачности - созвездие черт, которые позволяют прямое наблюдение событий, начиная от гаструляции в органогенеза с основной стереомикроскопа. Кроме того, эмбрионы рыбок данио может выжить в течение нескольких дней в гаплоидного государства. Производство гаплоидных эмбрионов в пробирке является мощным инструментом для мутационного анализа, так как она позволяет идентифицировать рецессивных мутантных аллелей, присутствующих в первом поколении (F1) женщин-носительниц следующие мутагенеза в родительской (P) поколения. Такой подход исключает необходимость поднять несколько поколений (F2, F3 и т.д.), включает в себя разведение мутантных семей, тем самым экономя время исследователь вместе с сокращениемпотребности в данио пространстве колонии, труда, стоимость животноводства. Хотя данио были использованы для проведения вперед экраны для последних нескольких десятилетий, имело место постоянное расширение трансгенных и геномных инструментов редактирования. Эти инструменты предлагают множество способов создания нюансы анализов для экранов следующего поколения, которые могут использоваться для дальнейшего препарировать генные регуляторных сетей, которые управляют позвоночных онтогенез. Здесь мы описываем, как подготовить гаплоидных эмбрионов рыбок данио. Этот протокол может быть реализован в новых будущих гаплоидных экранов, таких как энхансер и супрессоров экранов, для решения механизмы развития для широкого ряда процессов и тканей, которые образуют на ранних эмбриональных стадий.

Введение

Основные процессы, которые руководят развитие позвоночных широко сохраняется ^1. Мощный способ идентификации генов с эфирными ролей в развитии является изоляция наследуемые мутации, которые приводят к фенотипическим дефектов в процессе интерес. Данио, Данио рерио, является небольшой пресноводный вид костистых принадлежащие рыбы семейства карповых, которая стала широко используемой моделью организм для позвоночных генетики развития в течение последних нескольких десятилетий ^2. Данио рерио яйца оплодотворены внешне, позволяя доступ к зиготы от начала оплодотворения ^3. Кроме того, в начале эмбрион является оптически прозрачным, что позволяет визуализировать развития с простым стереомикроскопа ^3. Данио рерио онтогенеза является быстрым, с процессами расщепления, гаструляцией, и органогенеза многих структур, таких как сердце и почки, в значительной степени завершена в течение первого дня развития ^3. Тон время от личиночной стадии к половой зрелости занимает 2-3 месяцев, и взрослые мелкими позвоночными примерно 3-4 см в длину, столько рыб содержат в минимальном пространстве ^2. Кроме того, данио взрослые имеют высокую плодовитость, с каждой рыбы, способную производить несколько сотен эмбрионов в неделю ^2. Эти атрибуты оказали удобство манипулирования из рыбок данио для прямого и обратного генетические экраны. Данио рерио обладают высокой степенью сохранения в их анатомии, клеточной биологии и физиологии с более продвинутых видов позвоночных, как млекопитающие ^2,4. В самом деле, недавний анализ последовательности показал, что геном содержит данио гомологи в около 70% человеческих генов ^5. Это сохранение позволило исследователям использовать данио в качестве модели для многочисленных заболеваний человека, в том числе и эмбриональных и взрослых условиях ^2,4. Взятые вместе, эти факторы сделали данио отличная система для экранов с целью выявления генов,необходим для нормального позвоночных онтогенеза.

Ряд больших экранах масштабных были проведены у рыбок данио и выявили несколько тысяч мутаций в генах развития ^6-8. Данио взрослый мужчина поддается мутагенеза и хромосомные изменения могут быть получены с относительно высокой частотой с помощью химического мутагена ethylnitrosourea (ЕНУ) ^6,7 или ретровирусную инсерционного мутагенеза ^9. На сегодняшний день более 9000 наследственные мутации были созданы, и включают в себя гены, которые влияют практически все аспекты эмбриогенеза. Данио сообщество установило централизованного банка от этих мутантов в Международном центре данио рерио ресурсов (или Zirc) ^10, который собрал около 5000 мутантных и трансгенных аллели со всего мира. Многие из этих мутаций были проанализированы и клонировали, давая исследователям через биологических дисциплин ценную информацию, которая была использована, чтобы дразнить друг от друга Numeroнас клеточные и физиологические пути через прозрения, происходящих с данио экспериментов.

Хотя вперед экраны определили внушительное число важных генов, многое еще, чтобы оценить о генетических регуляторных сетей, которые обеспечивают множество процессов. Многие экраны, предпринятые до сих пор не достиг насыщения, и, таким образом вперед, а также обратные генетические экраны остались краеугольным для выявления и анализа механизмов эмбриогенеза. В то время как есть огромные идеи, которые можно почерпнуть из какой-либо одной данио мутантной линии, основным ограничивающим фактором в области исторически была трудоемким усилия, затраченные в позиционного клонирования. По этой причине, личность многих химически индуцированных мутаций остался загадкой. Тем не менее, с появлением в последнее время весь геном подходов секвенирования, которые облегчают быстрое клонирование ^11-14, невероятно эффективным идентификация генетических мутаций теперь Feasible.

Прототипом вперед экран у рыбок данио является диплоидным экран, который может определить рецессивные мутации в течение трех поколений ^6,7 (рис. 1, столбец слева). Этот метод включает генерирующие мутации в репродуктивных клетках родителей (Р) Для мужчин, а затем спаривания этот мужчина с дикого типа женщины. Каждый из первого поколения (F1) потомства от этой вязки будет питать один или несколько уникальных мутаций из-за хромосомных вкладов мутировавшего отцовской генома. Потомство F1 поднимаются и скрещивали с дикими видами, чтобы создать F2 семей. В семье F2, братьев будет либо дикого типа или гетерозиготных носителей, и incrossed случайным образом генерировать F3 муфты, которые анализируются для фенотипа (ов), представляющего интерес. В F3 клатчи из гетерозиготных носителей будет содержать 25% дикого типа, 50% гетерозиготных и 25% гомозиготных мутантов рыбу. Это несколько поколений скрининг схема эффективна, однако один главный недостаток к этомухо д входит время, необходимое для подготовки к экрану: по крайней мере, 1 год только рыбного хозяйства участвует, так как каждое поколение требует около 3 месяцев, чтобы достичь половой зрелости. Другие ограничения этого типа диплоидной экране являются работы, пространство, и стоимость жилья эти поколения.

Гаплоидный экран является одним альтернативой, которая может быть использована для идентификации, а затем изолировать рецессивные мутации с использованием аналогичных стратегий мутагенеза ¹⁵ (рис. 1, правая колонка). Производство гаплоидных эмбрионов данио рерио сначала было описано более 30 лет назад ¹⁶ и способность обычно диплоидной данио разработать в течение нескольких дней с гаплоидный хромосомный плоидности была использована для многочисленных генетических исследований с этого времени. Основное преимущество гаплоидного экране в том, что этот метод не предполагает повышения F2 семьи, чтобы экран для рецессивных мутантных аллелей. Вместо этого, самки поколения F1 оценивают погетерозиготность рецессивных мутаций в процессе интересом исследуя их F2 потомства в гаплоидном состоянии (рис. 1, правая колонка). В целом, шаги, которые закупают гаплоидных зародышей относительно просты (рис. 2). После подготовки необходимых решений для обработки спермы, яйца получаются от самок F1 поколения ручного манипулирования с тем, чтобы выдавить (или "сжать") яйца от пуза. Как только яйца получаются, они оплодотворяются в пробирке под воздействием ультрафиолетового (УФ) инактивируется спермы. УФ инактивированный сперма не способны внести вклад жизнеспособной ДНК в яйцо в связи с тем, что короткий длина волны УФ сшивает отцовской ДНК. Тем не менее, сперма все еще способны вызывать яйцо активность и события, связанные с зиготического развития. По метаболической активации, яйцо завершит мейоза II, и приступить к разработке только с одной материнской хранение копию каждой chromosoя. Из-за этого 1N плоидности, эмбрион является предметом развития последствий рецессивного мутантного аллеля, если он присутствует на материнской хромосоме. Таким образом, каждый F2 гаплоидны сцепления будет содержать 50% дикого типа и 50% мутантных эмбрионов, если мать является гетерозиготным носителем полностью пенетранта рецессивного аллеля. Такое распределение эмбриональных генотипов позволяет относительную легкость с точки зрения оценки сцепления на наличие мутантного фенотипа (ов), представляющего интерес. Если такой фенотип обнаруживается, самка основатель поколения F1 впоследствии скрещивали дикого типа мужского рыбок данио, чтобы создать и собрать больше гетерозиготных носителей. Потому что это не необходимо поднять несколько поколений, чтобы выполнить экран, исследователь может значительно сэкономить время, труд, и аквариум пространство, но все еще имеет силу для обследования значительное количество геномов на основе ряда F1 женщин исследуемой. Таким образом, гаплоидные экраны особенно целесообразно для небольших лабораторий или проектов, инициированных в absencэ существенного финансирования.

Тем не менее, существует несколько ограничений и недостатков использования гаплоидов. Во-первых, гаплоидные эмбрионы рыбок данио живут всего несколько дней, и, обычно умирают от 3 ​​до 5 дней после оплодотворения (DPF) ^15. Гаплоидные эмбрионы рыбок данио можно отличить от диплоидов на основе нескольких характеристик, прежде всего среди них быть короткой и коренастый тело, которое, тем не менее имеет нормальный ряд сомитных сегментов ^15,17. По мере продвижения разработки, экспонаты мозга увеличилась гибель клеток и кровообращение плохое, как правило, связаны с объединения крови на 2-3 DPF и отека ^15,17. Кроме того, гаплоиды не в состоянии надуть ^15,17 плавательного пузыря. Независимо от этих морфологических различий, большинство крупных органы и ткани образуются, в том числе сердца, глаз и хорды ^15,17. Одной из особенностей отмечено о гаплоидных муфт в том, что они содержат ряд фенотипов в плане сортов дефектных эмбрионов и #8212; особенность наблюдается по штаммов данио. Таким образом, следует проверить, если ткань (ы) и время достопримечательность показывают достаточно нормальное развитие в дикого типа гаплоидного деформации и, следовательно, есть потенциал, чтобы быть оценена для генетических дефектов в экран или другой научно-исследовательского проекта.

Несмотря на эти проблемы, гаплоидные экраны были реализованы успешно, чтобы идентифицировать гены, необходимые для начала процессов развития в данио, и гаплоидные протоколы были хорошо известны ресурсов в обществе на протяжении многих лет ^15-19. Совсем недавно, процесс создания гаплоидных зародышей рыб была использована исследователями для создания гаплоидный эмбриональных стволовых (ES) клеточных культур от оризия рыбы ^20,21. После производства оризии гаплоидных эмбрионов в пробирке, эмбрионы были использованы для получения первичных клеточных культур, которые пассировали в течение приблизительно 15 недель с последующим еще 5-8 недель, чтобы генерировать чистые клоны гаплоидных клеток сES клеток свойства ^15-19. Поколение рыбы гаплоидных клеточных линий ES имеет широкий будущей перспективы для анализа рецессивных фенотипов в позвоночных клеточных клонов, и представляет собой новый подход к генетического анализа в ближайшие годы. Таким образом, поколение гаплоидных зародышей рыб уже растет приложений в биомедицинских исследований сообщества. Это видео статья обеспечивает визуальное демонстрацию этапов с производством гаплоидных данио эмбрионов в пробирке с использованием УФ-инактивируется сперму на основе установленных протоколов ^15-19,22.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры для работы с эмбрионов рыбок данио, описанных в этом протоколе были утверждены Комитетом Институциональная уходу и использованию животных в Университете Нотр-Дам на. ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то следующий протокол обеспечивает демонстрацию изоляции спермы, которая включает эвтаназию мужчин, сперма может быть сбор из половых поры наркозом живут мужской данио использованием нежный внутрибрюшного давления и микрокапилл для сбора спермы ^17,18. Сжатие живых мужчин требует нескольких мужчин, которые будут использоваться для того, чтобы собрать эквивалентное количество спермы, которую можно получить от одного эвтаназии мужского ^17,18. Тем не менее, мужчины, которые подверглись сжимая остаются вполне здоровым и может быть использован для физических вязки или последующих процедур в пробирке ^17. Всякий раз, когда это возможно, выбранные процедуры следует свести к минимуму ненужные рыбы жертву.

1. Приготовление растворов и рыбок данио стыковочных палат

<ол>

Подготовка исходных растворов Хэнка (№ 1, 2, 4, 6) и Хэнка предварительный раствор (см. таблицу материалы) ^19, то автоклав и хранить при температуре 4 ° C.

Выберите нужный номер взрослого данио женщина (ы) для гаплоидного коллекции сцепления. ПРИМЕЧАНИЕ: На основе опыта, используя мутагенизированных F1, состоящий из врожденного Тюбинген штамма рыбок данио, около 50% половозрелых самок были «податливый» в среднем после грунтования их, помещая их в брачный клетке ночь с мужчиной - то есть сцепление было получено с помощью процедуры сжимая - и большинство этих муфт (в диапазоне от 70-90%) производится жизнеспособных гаплоиды. С двумя исследователями, выполняющих гаплоиды подготовку, около 80 взрослых женщин F1 данио можно выжать в одно утро. Для вычисления реагенты, необходимые для гаплоидный эксперименте фактора в обоих скорости сжатия в поколении F1 и количество исследователей доступных для выполнения ехрeriment. Имейте в виду, что количество женщин, которые будут производить высококачественные гаплоидных муфты является чрезвычайно переменным, с различия, наблюдаемые между данио самок различных штаммов, возрастов и диетическое питание ^15.

Подготовка спаривания клетки, помещая каждую взрослых данио женщина с взрослого мужского рыбок данио в камере системы водой так, чтобы они разделены делителя на ночь. ПРИМЕЧАНИЕ: Женщины должны подвергаться мужчины на ночь в расцвете сил, или подготовить их, для нереста через сжатия.

2. Рассечение семенников

1. Сделать Хэнка маточного раствора # 6 свежих добавлением 0,35 г бикарбоната натрия в 10 мл дистиллированной воды. Все хорошо перемешать, чтобы растворить порошок бикарбоната натрия.
2. Объедините следующие в трубке на льду для того, чтобы Окончательная рабочий раствор буферизированные Хэнка для спермы: 9,9 мл Хэнкс Премикс I 100 мкл исходного раствора № 6.
3. Тщательно перемешать, затем аликвоту 500 мкл Хэнк7; ы Заключительный рабочий раствор в микроцентрифужную пробирку и место на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый 500 мкл аликвоты будет использоваться для подготовки спермы из яичек 4-5 мужского рыбок данио.
4. Выберите между 4-5 мужского рыбок данио для каждого урожая спермы. ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет урожай достаточно спермы, чтобы собираться, обрабатываться и храниться в одном 1,5 мл трубки микроцентрифужных, которые могут быть использованы для оплодотворения около 15 гаплоидных муфты. Выберите дополнительные когорты мужчин, чтобы подготовить дополнительные трубки в зависимости от масштаба эксперимента. Если выбранный мужской данио малы или рассечение яички является неполным, обычно 5 кобелей будет необходимо.
5. Эвтаназии каждый самец с помощью сети, чтобы передавать осторожно рыбу в чашку, содержащую 0,2% Tricaine в течение примерно 5-6 мин при комнатной температуре. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы гарантировать, что мужчина был правильно эвтаназии до начала вскрытие. Как правило, ждать несколько (2-3) минут после жабрах прекратить движение рыбы и рыбыбольше не реагирует на касания.
6. Выберите мужчина мягко пластиковой ложкой и осторожно промокните мужской сухой жидкости. Затем удалите голову самца с резким ножницами, а затем разрезать надрез вдоль вентральной срединной линии. ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление всех лишней жидкости из рыбы необходима для предотвращения запуска активацию сперматозоидов.
7. Снимите кишки и связанные кишечника органы от брюшной полости с использованием тонких щипцов и место в контейнер для биологически опасных для утилизации.
8. Используйте тонкий пинцет, чтобы удалить яички, которые расположены вдоль спинной стенке тела, боковые для плавательного пузыря, и есть белый непрозрачный внешний вид, если смотреть под стереомикроскопа. ПРИМЕЧАНИЕ: Ведение яички нетронутыми может помочь предотвратить воздействие на сперматозоиды к водной основе жидкостей организма и, следовательно, предотвратить преждевременное активации.
9. Наведите яички в раствор спермы на льду и держать трубку на льду, как и другие яички расчленены. Повторяйте шаги 2.6-2.9, пока вся мэли были расчленены.
10. Поместите туши и все оставшиеся животные ткани в контейнер для биологически опасных для надлежащего институционального распоряжении.

3. УФ спермы Инактивация

1. Гомогенизируют яички, осторожно измельчения микроцентрифужную пробирку со стерильным микропробирок пестиком.
2. Передача супернатант в небольшую чашку Петри, или часовым стеклом на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Не передавать ткани мусора вместе с надосадочной жидкости. Это создаст тени и поставить под угрозу УФ инактивации спермы.
3. Промойте спермы трубку между 300-400 мкл Final рабочего раствора Дополнительный Хэнка (полученного в стадии 2.2 и хранится на льду), и добавьте этот надосадочную мыть в небольшой чашке Петри или смотреть стекло в шаге 3.2.
4. Expose блюдо УФ лучей, излучаемых скамейке лампы (254 нм) на общую сумму 2 мин на расстоянии от источника лампы около 15 в (38,1 см). ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность при работе с УФ-лампой и носить защитную маску илидругой глаз индивидуальной защиты.
5. Вернуться тарелку в ведерке со льдом, а затем перенести УФ инактивированную сперму в свежую пробирку микроцентрифужных и хранить образцы на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент будет примерно 800 мкл УФ инактивируется спермы для гаплоидного сцепления оплодотворения. Сперма должны храниться на льду в течение всего периода времени, затраченного на выдавливание самок. Сперма в холодной Хэнка могут быть использованы на срок до 6 часов без снижения оплодотворения результат. Интересно, что другие исследователи сообщают, что сперма в холодный Хэнка жизнеспособна от нескольких часов до нескольких дней ^18.

4. Яйцо закупок от взрослых данио рерио Женщину и Экстракорпоральное оплодотворение сцепления

1. Подготовка Tricaine ванну для анестезии путем объединения 20 мл 0,2% Tricaine складе 80 мл системы рыбы воды.
2. Выберите самку для сбора яиц, используя сеть, чтобы разместить ее нежно в блюдо ПДДicaine.
3. Подождите в течение 2-3 мин, пока самка не находится под наркозом и больше не реагирует на прикосновения. ПРИМЕЧАНИЕ: Если женщина дергается или вызывает другие движения, дать ей дополнительное время для поддаваться на анестезию.
4. Используйте пластмассовую ложку, чтобы осторожно поднимите самку, переливание решение до размещения самку на бумажное полотенце, чтобы фитиль от лишней жидкости. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не оставить дополнительное решение на самке, как жидкость вызовет активацию яйца перед добавлением спермы.
5. Поместите женщина на ее горкой в ​​чистом чашку Петри и визуализировать ее живот под стереомикроскопа.
6. Ход самки живот мягко в течение приблизительно 10-20 сек с помощью одного или двух пальцев от одной стороны выжать яйца из ее живота, тем временем поддержки самки спину, поместив один или два пальца с другой стороны, сразу за ее спинной стенке тела. ПРИМЕЧАНИЕ: По поглаживая самки живот, яйца должны выйти очень легко. Если яйца не возникают остроумиеч облегчить это не рекомендуется, чтобы "выдвинуть тяжелее" и сила яйца от самки. Это означает, что яйца нет и / или не готова к оплодотворению, и продолжал толкает связано со значительным риском причинения вреда самку (например, разваливающийся плавательный пузырь или вызывает иное смертоносное повреждения внутренних органов). Если женщина выдавливается но предоставляет ни один или несколько яиц, вернуться самку на объект животного. Через 1-2 недели отдыха, пара самку мужчина для естественного спаривания, чтобы вычистить остаточного мусора яйцо. Отделять самок, сопряженные естественно в бак еще на 1-2 недели отдыха, прежде чем пытаться второй давить. Кроме того, женщины могут быть отдохнувшим в течение 4 недель, в течение которых они могут быть созданы для физических вязки ^15.
7. Используйте тонкую зонд или небольшой шпатель, чтобы выкопать яйца из-под женщина и / или ее поверхности живота.
8. Аккуратно поднимите самку и вернуть ее к соответствующей маркировкой бака изоляции, содержащей системы рыба воду.
9. Добавить 50 мкл раствора УФ инактивированной спермы к муфте яиц, и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 сек, во время которого, прикрепить метку, соответствующую к блюду отслеживать его с номера, присвоенного женского родителя.
10. Добавить 1 мл E3 к яйцам, и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 мин.
11. Добавьте достаточное решение E3, чтобы заполнить блюдо на полпути, и поместите эмбрионы при 28 ° С в течение последующей инкубации. Примечание: добавление пенициллин / стрептомицин (1% (объем / объем) ручка-острый раствор, содержащий 5000 единиц пенициллина и 5 мг стрептомицина на мл) ¹⁹ до Е3 может помочь в общее состояние здоровья гаплоидных зародышей.

5. Наблюдение и регулировать гаплоидных эмбрионов

1. После 4-8 часов, удалить неоплодотворенные эмбрионы из чашки и мыть оставшиеся эмбрионы, заменив эмбриона СМИ E3 свежим раствором E3. ПРИМЕЧАНИЕ: неоплодотворенных эмбрионы будут отобразить белый, непрозрачный внешний вид или может отображать прозраченppearance с деформированным одной клетки.
2. Инкубируйте до желаемого времени точки интереса, а затем использовать в нужном анализе экрана или другой исследовательской заявки (заявок).

Результаты

Производство гаплоидных зародышей могут быть реализованы для выявления рецессивных мутаций в поколении F2, когда гаплоиды получаются из зрелых рыбок данио женщин, которые потомство мутагенизированных родителей (рис. 1). Это экономит время и пространство по сравнению с традиционными диплоидной экране, в которых исследователи должны поднять F2 семей, чьи диплоидная потомство затем оцениваются для фенотипов интерес (рис. 1).

Основные шаги в протоколе описано в шагах 1-5 выше для получения данио гаплоидных зародышей через экстракорпорального оплодотворения являются схематически виде блок-схемы (рис. 2). Эти шаги включают в себя подготовку решений и примирование женщин под воздействием мужских гормонов в брачных танков (день 1), а затем сперматозоида и яйцеклетки закупок и экстракорпоральное оплодотворение (День 2), и, наконец, воспитание из гаплоидов (Дни 3-5) (рис. 2). При комсочетании с генетической экране, обычная процедура мутагенеза у рыбок данио включает предыдущий воздействие мужских данио взрослых дикого типа к мутагена (например, к химическим мутагеном, как ЕНУ, хотя другие процедуры, такие как ретровирусов на основе мутагенеза может быть реализован, который также облегчения клонирования дефекта хромосомной) с последующим разведением с самками дикого типа, чтобы создать мутагенезу поколения F1. Такие препараты требуют нескольких месяцев работы (примерно 6 месяцев) на основе времен поколения, необходимых для задних диких видов, выполните мутагенеза, и задние последующее мутагенизированных F1 ^15,17,22.

Еще одним важным пунктом для рассмотрения в использовании гаплоиды для экрана является выбор данио штамма. * (AB звезда) штамм АВ стал хорошо известный по производству гаплоидных зародышей с лучшими общих характеристик и здоровья, чем другие штаммы ^15. Тем не менее, в производной Тюбинген штамма разводят в нашей лабораторииТори, мы недавно наблюдали эмбриологические черты, которые позволили успешно экраны для пороков развития почечной системы (Г. Герлаха и Р. Wingert, не опубликовано). Взрослых данио деформации мужчины Тюбинген были мутации по серии из трех ЕНУ лечения, а затем подошел к дикого типа Тюбингене женщин для создания поколения F1 для скрининга. В F1 женщины были вытеснены для получения яйца и эти F2 яйца были оплодотворены с УФ инактивируется спермы. По сравнению с диплоидных лап, полученных в результате стихийных вязки дикого типа Тюбингене родителей (рис. 3а), эмбрионы в этих гаплоидных деформации когтей Тюбингене отображается более короткий, коренастый ствол характеристику гаплоидного состоянии (рис. 3б, в). Кроме того, гаплоидные клатчи обычно состоят из эмбриона братьев и сестер, которые отображают ряд дефектов, которые мы наблюдали, а (Цифры 3B, C), который, как известно варьироваться в штаммов, как обсуждается ниже ^15,17.

Предыдущие исследования установили канонический классификации серию, соответствие марок А через D, классифицировать диапазон гаплоидных фенотипа дефектов ^15,17, и, кроме того гаплоиды также говорится в плане прилагательных хорошо, средние и бедные качества ^22. Класс A гаплоиды, что соответствует высоким качеством гаплоидов, наиболее нормальный на вид, с коротким и коренастым телом, но в целом показывают, морфологический вид, подобный диплоидов ^15,17,22 (сравните диплоидных братьев и сестер (D), чтобы гаплоидного класса А (с маркировкой А) братья и сестры, 3В). Эмбрионы Гаплоидные класса A также развивать скромный перикарда отек, который является характерной чертой гаплоидного развития данио ^15,17,22 (рис. 3В). По сравнению с уровень А гаплоидов, промежуточный или так называемый уровень В гаплоидных эмбрионов (помечены B, рисунках 3B, C) ​​отличаются развития дальнейшего укороченной или ломаной / TWISТед ствол, хотя особенности головы и хвоста ясно различимы ^15,17,22. И, наконец, класс C или низкое качество гаплоидов (см. также в некоторых ссылок, как C / D) ^15,17,22 чрезвычайно неисправен и отображать неорганизованное массу клеток в ассоциации с шаром желтка (обозначенный С, фиг.3С). Даже среди того же штамма, гаплоидные клатчи варьироваться в распределении А, В, и С фенотипов, что будет наблюдаться. Например, гаплоидная сцепления с одного Тюбинген женщина изображена лучшее развитие общей, с по большей части А и В класса гаплоидны потомство (рис. 3В) по сравнению с гаплоидов полученных от второго Тюбинген женщина, чей сцепления состояла из многочисленных уровень С гаплоидного потомства, а также и B гаплоидные фенотипы (рис. 3C). Похожие изменчивость штамм гаплоидных сортов эмбриона были ранее наблюдались в АБ и АВ * штамма рыбы, а ^15.

Несмотря на эти морphological различия, органогенез многих структур протекает относительно нормально в гаплоидный эмбрион. Хотя они имеют более короткий тела ствола, развитие органов, как глаз и сердце относительно похож на дикого типа диплоидных эмбрионов, и типы клеток, такие как пигментные клетки (меланофорах и xanthophores) также могут быть оценены ^15. Кроме того, мы зафиксировали недавно, что предпочка или эмбриональной почки, разрабатывается 1 день после оплодотворения в дикого типа гаплоид, подобно диким диплоидов типа. В качестве доказательства этого введите предпочка клеток рисунка отображает прототип картину сегментов (рис. 4). Кроме того, фенотип рецессивных мутаций, которые изменяют развитие предпочки, например, либерал-мутации, что снижает производство ретиноевой кислоты, показывают аналогичную картину в гаплоидного состоянии по сравнению с диплоидной состоянии (рис. 4) ^23,24. Это наблюдение в соответствии с деятельностью других рецессииSIVE мутации, приводящие к подобным фенотипов как в гаплоидный и диплоидный состоянии, хотя это не всегда так со всеми мутаций и должны иметь в виду, если оценки этот тип стратегии экрана ^15.

Ряд тканей и органов, как правило, ненормальный в гаплоидов. Например, гаплоиды отображения дефекты в обращении, обычно проявляющие скопление крови, при которых возможно их способность изучить некоторые аспекты васкулогенеза ограничено ^15. Кроме того, было отмечено, что гаплоидов может иметь неровности в развитии уха, так что они могут быть оценены на наличие мутаций, которые предотвращают образование слухового пузырька полностью, но не для мутаций, которые влияют на тонкие процессы, связанные с морфогенеза этой структуры ^15. В качестве еще ​​одного примера этого, мозг морфогенез является ненормальным в гаплоидов, и, таким образом гаплоидные экраны для выявления необходимых пути развития мозга ограничены ^15. Несмотря на эти ограничения, нашанализ развития почек у гаплоидного состоянии (рис. 4) добавляет этот орган в список "для скрининга" эмбриональных структур. Эта находка подчеркивает, что методология гаплоидны экран может быть использован рассекать генетические компоненты почечной паттерна предшественников и добавляет акцент на чувства, что подходы гениальный экран может обойти ограничения гаплоидного эмбриона онтогенезе, чтобы раскрыть новые ценные мутантные модели для изучения развития позвоночных ^15.

Рисунок 1. Схема диплоидных и гаплоидных стратегий экраном в данио модели. После мутагенеза родительского поколения, поколения F1 можно поднимать и использовать либо для генерации F2 мутантные семей, которые используются для скрининга генерацию F3 в диплоидной состоянии (слева ) или непосредственно экранред в гаплоидного стратегии (справа). В гаплоидном экране, половозрелые самки поколения F1 используются для сбора гаплоидных F2 муфты для генетического анализа. Женский гетерозиготных носителей отождествляются, если примерно половина F2 гаплоидов отображения мутантный фенотип (красные эмбрионов) по сравнению с гаплоидных братьев и сестер дикого типа (желтые эмбрионов).

Рисунок 2. Гаплоидных эмбрион производство блок-схема. Основные этапы оплодотворения производить гаплоидные эмбрионы схематически, как задачи, выполняемые на 1 день (розовые коробки) подготовить спермы решения и премьер взрослых данио сук, задачи, выполняемые на 2 день (оранжевых коробках ) для сбора и УФ Деактивировать спермы, чтобы собирать яйца, чтобы оплодотворить яйца с УФ инактивируется спермы для генерации гаплоиды, а затем возродить женскую мать, и finallу задачи, выполняемые в последующие дни 3-5 (желтая коробка), когда клатчи инкубируют в нужную точку (ы) времени для наблюдения и анализа.

Рисунок 3. Сравнение диплоидных и гаплоидных Тюбингене эмбрионов штамм данио. A) диплоидных эмбрионов дикого типа были изготовлены путем естественного размножения и затем инкубировали до примерно 30 HPF. B, C) ​​Гаплоидные эмбрионы дикого типа были изготовлены оплодотворения муфт, полученных из F1 поколения мутагенизированных женщин с УФ-инактивированную спермы, и инкубировали до тех пор примерно в 30 часов после оплодотворения. Гаплоиды выставлены ряд аномалий в развитии по сравнению с диплоидных эмбрионов дикого типа (черных стрел, D, чтобы указать диплоидных). Относительно нормальные гаплоиды был сокращен, еще наличие тело, аналогичное классификации схемегаплоидны ¹⁵ (красные стрелки, помечены А), в то время как гаплоиды с грубыми нарушениями выставлены строго усеченные ось тела (фиолетовые стрелки, помечены B), соответствующие сорта B, и, наконец, уровень С (синие стрелки, помечены С) на основе опубликованные описания ^15. Все эмбрионы были сфотографированы в прямом эфире при увеличении 2.5X.

Рисунок 4. Развивающие структурирование типов клеток, составляющих предпочки эмбриональных орган почки в гаплоидного Тюбинген штамма рыбок данио. Гаплоидные дикие виды отображается нормальную структуру клеточных типов в эмбриональном структуры почек (верхний ряд). Эмбриональной почки состоит из пары сегментированных функциональных блоков, известных как нефронов. Сегментирован шаблон дискретных типов клеток, присутствующих в нефронов могут быть визуализированы на основе всей крепления в гибридизация паттерна экспрессии транскриптов гена, которые уникальны для дифференцированных типов нефрона клеток, которые включают в подоцитов (P), отмеченные wt1b и nephrin, проксимальных извитых канальцев (РСТ) отмечен slc20a1a, проксимального прямой трубочку (PST ) отмечены trpm7, дальний рано (DE) отмечен slc12a1 и дистальной конце трубочку (DL) отмечен slc12a3. либерал гаплоидные мутантные эмбрионы (нижний ряд) дисплей снижение подоциты, РСТ и отсутствует PST, наряду с расширенным DE и сегмент DL, похожие на диплоидных Lib эмбрионов ^18. Эмбрионы были сфотографированы в спинной, с передней влево, при увеличении 10Х.

Обсуждение

Гаплоидных скрининг может быть полезен, чтобы обнаружить существенные гены необходимые для ранних стадий развития. Кроме того, культивирование гаплоидных клеток из оризия рыбы был использован для изоляции ES-подобные клеточные линии, которые имеют многочисленные исследовательские приложений и потенциал, демонстрируя, что гаплоидные клетки могут обеспечить ценную будущего места для других типов генетических исследований позвоночных ^20,21. Этот протокол обеспечивает демонстрацию методов, связанных с выполнением производство гаплоидных эмбрионов данио рерио через экстракорпорального оплодотворения с УФ инактивируется спермы. Эта методика может быть использована для выполнения вперед гаплоидных экраны с мутагенезу рыбы F1, которые могут быть сделаны с использованием дикого типа трансгенные или мутантные штаммы, для энхансер / супрессора скрининга.

Хотя время скрининга с использованием гаплоидный стратегии является значительно сокращен по сравнению с диплоидной скрининга, оно, тем не менее занять несколько месяцев, чтобы закончить. Как мы descriкровать ранее, Есть много преимуществ, которые существуют, выполняя экран с помощью гаплоидный схему, все из которых могут помочь в создании новых взносов в современных знаний о любом количестве событий в развитии. Методология Гаплоидный экран является более эффективным для идентификации рецессивных мутантных аллелей, чем диплоидных основе экранов в связи с сокращением времени, пространства и количества рыбы, которые необходимы. Тем не менее, есть несколько подводных камней в гаплоидном экране. Гаплоидны экран может только идентификации мутантов в генах, которые активны в течение первых нескольких дней развития, как эмбрион может выжить только в течение ограниченного времени с гаплоидный геном. Гены, которые выражаются затем в развитии должны быть определены другим способом, например, диплоидной экране. Кроме того, некоторые органы не развиваются должным образом в гаплоидном организма. Там могут быть анатомические аномалии, или с задержкой времени развития, которые могут привести мутация будет хватать на гаплоидного метод скрининга. Ян Кроме того, некоторые штаммы рыбы не развиваются, а в гаплоидного состоянии ^15. Гаплоиды могут быть классифицированы по классификации серии хороших, средних и плохих эмбриональных особенностей, с эмбрионы быть самый нормальный, B для обозначения эмбрионов с дефектами в оси, но ясно, голова и хвост, и C / D для обозначения эмбрионов с неузнаваемым особенности (массы клеток на вершине желтка шаров) ^15,17. Пропорции эмбрионов в рамках этих категорий зависит от данио штамма, с увеличением числа более качественных гаплоидов наиболее распространенных в частности генетическим фоном ^15,17. В силу этих факторов, необходимо найти правильный штамм рыбок данио для выполнения мутагенеза и последующие кресты. В нашем недавнем опыте, дикого типа Тюбинген штамм производится жизнеспособных гаплоиды скрининга (как показано на рисунках 3 и 4), хотя исторически данио исследователи использовали AB или AB * штаммы для гаплоидного Эксперимтации ^15.

В дополнение к этим вышеупомянутых проблем, не все загрунтованные взрослых самок данио будет производить сцепление на выполнении методики сжатия. Например, при работе с ENU-мутагенизированных деформации самок Tubingen, приблизительно половина всех женщин производится сцепление на сжатие, а некоторые из них фракция (обычно 10-30%) были низким качеством эмбрион или не могли быть оплодотворены. Таким образом, для выполнения гаплоидный экран нужно планируют поднять минимум в два раза столько рыбы, как нужно экранировать нужное количество геномов (каждая самка является одним геном скрининг). Независимо от этого рассмотрения, преимущества гаплоидного метода скрининга для покрытия большого количества геномов без массивного объекта животного действительно весьма значительным, если анализ поддается гаплоидного государства. Тем не менее, следует также отметить, что дальнейшее изучение мутации (ы) определены в гаплоидного сцепления полностью зависит от успешного привлечениян ауткросс от женской основателя. Как и в любом экране, 'парад' первоначально определены в процессе скрининга необходимо заново определены в диплоидной государства.

Несмотря ловушек с использованием гаплоидный экран, он показал, чтобы быть очень успешным в выявлении мутантов, которые были проанализированы в глубину с проницательными выгоды для научной области ^15. Гаплоидные экраны могут быть реализованы для исследования других мало изученных процессов развития позвоночных. Использование гаплоиды для усилителей и супрессоров экранов является одним из способов, чтобы получить более глубокое представление о деятельности и регуляторной сети интересующего гена. Гаплоидный метод скрининга также может быть использован для идентификации энхансеры и ограничителей мутантов, которые уже были изолированы с помощью методов, таких как химическая или инсерционного мутагенеза или обратной генетики подходы, такие как ТИЛЛИНГ или Talens. Короче говоря, ранее выделен мутант может быть мутагенезу с ЕНУ и подвергают скринингу на усилители или сuppressors исходного мутантного фенотипа. Мутант должны быть в состоянии достигнуть взрослых этапы, поэтому необходимо иметь гетерозиготное животное или слабый гомозиготных мутантов рыбу выполнять этот экран, однако последние достижения в трансгенеза позволили исследователям обойти эту проблему. Научиться управлять путей в развитии может привести к много интересных возможностей, включая перспективой возмущающих путей для лечения болезненных состояний.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank's Stock Solution #1			8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O
Hank's Premix			Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 °C.
Hank's Stock Solution #6			0.35 g NaHCO3 in 10.0 ml ddH2O; make fresh on day of use.
Hank's Final working solution			Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
XX-Series UV Bench lamp	UVP	95-0042-05	Model XX-15S Bench Lamp
XX Bench Stand (Adjustable)	UVP	18-0062-01	Model XX-15 Stand
Embryo incubation dish	Falcon	35-1005
50 X E3			250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.
1 X E3			Dilute 50 X E3 in distilled water
Stereomicroscope	Nikon	SMZ645; SMZ1000