Методы для кожи телесные повреждения и анализы для заживления ответы в<em&gt; C. Элеганс</em

Резюме

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Аннотация

C. Элеганс эпидермис и кутикула образует простой, но сложный слой кожи, который может исправить локализованное повреждение в результате ранения. Исследования ответов раны и ремонта в этой модели с подсветкой наше понимание цитоскелета и геномных ответов на повреждение ткани. Два наиболее часто используемые методы ранить С Элеганс взрослых кожей уколы с микроинъекции иглы и локальном лазерном облучении. Игла ранение локально разрушает кутикулу, эпидермис и внеклеточный матрикс, связанный, а также может привести к повреждению внутренних тканей. Результаты лазерного облучения в более локализованной повреждений. Ранение вызывает последовательность легко определить реакции, включая повышенной эпидермиса Ca ²⁺ (секунды-минуты), формирование и замыкании актин-содержащие кольца на месте раны (1-2 ч), повышенная транскрипции антимикробных генов пептид (2-24 ч), и формирование рубца. Практически все взрослые животные дикого типа выжить ранения, гдекак мутанты с дефектом в заживления раны или других ответов показывают снижением выживаемости. Подробные протоколы для иглы и лазерной ранения, и анализы для количественного и визуализации раневых реакций и процессов репарации (Ca динамики, динамики актина, антимикробной индукции пептидов и выживания) представлены.

Введение

Кожные заживления ран механизмы основных биологических интереса и отношение к здоровью человека. Заживление ран у позвоночных и млекопитающих представляет собой сложную серию скоординированных реакций многих тканях и сигнализации ^1. Многие простые генетические модели организмы также способны заживления ран кожи ^2. Поэтому представляет интерес анализ генетически послушный модели кожной раны ремонта. Мы и другие начали использовать Caenorhabditis Элеганс как новая модель кожной раны исцеление ^3,4. Цель этого протокола заключается в обеспечении более широкого набора исследователям использовать C. Элеганс как инструмент для исследования молекулярных и клеточных механизмов эпидермиса заживления ран.

C. Элеганс кожи включает в себя эпидермис (также известные как гиподермы) и внеклеточный кутикулу ^5. Взрослые эпидермиса образуется из небольшого числа многоядерных синцитиев, из которых крупнейшим является синцитиально кNown как hyp7. Эпидермис просто эпителий, что выделяет кутикулу на вершинной поверхности. Кожа может активно защищаться от кожи, проникая патогенов и ремонта небольших ран ^4. Рана ремонт С Элеганс кожа является надежным, так как почти все дикие типа животных выжить могут выжить небольшие проколы, вызванные иглами, или локальное повреждение кожи под действием лазерного облучения. C. Элеганс кожи ранение вызывает набор ответов, в том числе эпидермального врожденного иммунного ответа, заживления раны и образования рубца ^4. Взрослые эпидермис постмитотическими, и заживление ран включает в себя местные клеточные реакции в отличие от распространения эпидермиса или миграции клеток. Мы показали, что кожа ранение вызывает большой и устойчивый рост в эпидермальных Ca ^2+, требуя мембрана TRPM канал GTL-2 и внутренние Ca ²⁺ магазины ^3. Сигнал эпидермального Ca ²⁺ необходим для формирования и закрытия F-актина колец на WOунд сайт. Ранение также вызывает врожденные иммунные реакции, которые активируют транскрипцию АМП, такие как НЛП-29. Ранений, вызванных транскрипции усилителей зависит от МДП-1 / ПМК-1 р38 МАР-киназы каскада, действующего автономно в эпидермисе ^4. Дефекты в любом сигнального пути Ca ²⁺ или в врожденного иммунного ответа приведет к снижению выживаемости после ранения. Относительно простой структурой С. Элеганс эпидермис, его генетический уступчивость и преимущества для в естественных изображений делают его отличным систему для изучения различных аспектов заживления ран.

Здесь мы представляем протоколы для двух распространенных методов ранения: иглы ранения и лазерной ранения. Игла ранение не требует специального оборудования (кроме иглы съемника), а с опытом можно выполнить на сотни червей в день. Игла ранения осуществляется на животных, растущих на чашках с агаром. В отличие от этого, лазерное нанесение ран выполняется на Anesthetized животные установлен на агар Рамки под покровное, и подходит для живого изображения клеточных реакций на повреждение.

протокол

Следующие протоколы описывают детальную процедуру для C. Элеганс кожи ранив и анализироваться в раны ответов.

1. Игла Ранение ^3,4

1. Расти здоровыми unstarved червей на стандартный НГО (нематода среднего роста) пластин с Е. палочка OP50 бактерии, как продукты питания, поддерживаемые в 20 ° C инкубатора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Методы NGM пластин агара и рутинной культивирования С. Элеганс можно найти на www.wormbook.org ^6.
2. Выберите 25 L4 стадии червей только что засеянного пластина 1 сутки до ранив и культура при 20 ° CO / N.
3. Перед ранив, тянуть иглы из капилляров с помощью иглы съемник. Иглы, используемые в ранении идентичны тем, которые используются для микроинъекции С Элеганс.
4. Убедитесь, что все черви в молодом взрослом. Место пластины червей на льду в течение 30 мин. Охлаждение вызывает у животных будет медленным, облегчая иглы ранения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 5 мин удаления со льда, черви начнут двигаться в нормальном режиме. Это возможно, но сложно ранить движущихся червей. С опытом, 5 мин достаточно времени, чтобы ранить 25 червей. Остановите с такими препаратами, как левамизол виде (используемых в лазерной ранения, смотри ниже), хотя животные займет больше времени, чтобы восстановиться.
5. Снимите агаризованной от льда рассекает стереомикроскопа. Использование червей выбор, двигаться 25 червей в центр чашки с агаром.
6. Поставьте иглу в пипетки 100 мкл легче держать иглу. Прокол передней или задней части тела червя с иглой, избегая гонады. В общем, пытаться наматывают между задней глотки и передней гонад, или между задней гонад и прямой кишки. Повторное использование игл много раз, пока они не сломаться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что раны краткие, нежные уколы, что прокол кутикулы и кожи, проникая ~ 5-10 мкм в животное. Игла должна войти в Анималь приблизительно под прямым углом к ​​коже. Раны не должно вызывать видимых повреждений внутренних органов, или немедленного разрыва корпуса. Соблюдайте небольшое количество цитоплазмы, которая сочится в течение нескольких секунд после раны; Однако, если клеточного содержимого просочиться в течение длительного времени животные не выживут. Для оптимальной визуализации, ранить боковую эпидермальный синцитий (hyp7) или боковой шов.
   Примечание: Эта процедура включает в себя использование стеклянной иглы.
7. Разрешить червей для восстановления при комнатной температуре тогда культура при 20 ° C. Судите успех иглы ранения со стороны ряда анализов, описанных ниже. Более 95% от животных дикого типа выживают 24 ч после иглы ранение в молодой взрослой стадии. Эффект ранение в личинок или пожилых людей еще не были широко проанализированы.

2. Лазерная Ранение ³

Используйте фемтосекундного лазерного излучения (800 нм) для выполнения более точного ранения.

1. Подготовка агара рРеклама на предметное стекло с растопленным 2% агара ^7. Убедитесь, что колодки похожи на чашках с площадок, используемых для живого изображения С. Элеганс.
2. Трансфер 10 молодых взрослых червей на агарозном площадку с червячной выбор, и добавить каплю 2 мкл 12 мМ раствора левамизол. Обложка животных и жидкости с покровным. Подождите 1-2 минуты для червей, чтобы парализовать.
3. Поместите предметное стекло на вращающийся диск конфокальной микроскопии. Перемещение на сцену, чтобы найти червей и сосредоточиться на боковых передних или задних синцитиальных эпидермиса с целью 100X (NA 1.4-1.46).
4. Установите мощность фемтосекундного лазера до 140 мВт (измеряется до цели). Используйте фемтосекундного лазера с частотой повторения 80 МГц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Два импульсы 200 мс каждый (разделенных на 20 мс) являются достаточными для ранив в наших руках.
5. Фокус на апикальной поверхности клетки эпидермального и наматывают на эпидермис. Соблюдайте локального разрушения цитоплазмы (пузырьков), или в местную отбеливания OГде: Любая флуоресцентным маркером используется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте соответствующим процедурам безопасности Лазерная при использовании фемтосекундного лазера. Линии или точки сканирования с использованием фемтосекундных лазеров, такие как те, в двух фотонных микроскопов должны обеспечивать достаточную мощность для лазерной ранения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя мы не имеем непосредственный опыт использования других лазеров, в принципе ранения должна быть возможность с помощью обычных УФ лазеров (как это используется в C. Элеганс клеток абляции). Возможно, использовать флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания модуль (FRAP) на вращающемся диске конфокальной ранить эпидермис (Н. Пуйоль, личное сообщение).

3. Визуализация эпидермальный Ca ²⁺ Ответы на причинение телесных повреждений,

1. Используйте трансгенных C. Elegans штаммы, экспрессирующие Ca2 ⁺ датчики (например, те из серии GCaMP) в эпидермисе, под контролем взрослых эпидермального специфического промотора Col-19 (фиг 1A; трансгены, перечисленные в Таблица 1). Использование трансген, экспрессирующих красный флуоресцентный белок, такой как tdTomato в качестве внутреннего контроля для уровня экспрессии трансгена.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали tdTomato в качестве внутреннего контроля для экспрессии трансгенов в флуоресценции эпидермальный tdTomato является относительно стабильным и не мешает визуализации GCaMP.
2. И игла и лазерной ранив триггер Ca ²⁺ высоты в эпидермисе. Однако, как игла ранение не может быть легко выполнена на вращающемся диске конфокальной, лазерная ранение является предпочтительным для количественного анализа Ca ²⁺ ответа (Рисунок 1).
3. Приобретать покадровой изображения времени в многомерном режиме сбора (интервал времени 2 сек с 114 мс возбуждения лазерного воздействия) с использованием вращающийся диск конфокальной с 100X цели (NA 1.4-1.46) и соответствующие наборы фильтров (GFP фильтры будут работать на GCaMP3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретите ЗАМЕДЛЕННАЯ изображений каждые 30 сек около 2 часов, чтобы исследовать Ca ²⁺ соотвonse с ранением в течение более длительного времени, конечно.
4. Использование программного обеспечения для анализа изображений измеряют среднюю флуоресценции GCaMP в десять приравненных к ним местностях, представляющих интерес (ROI), пять из которых сосредоточены на эпидермальный цитозоле клеток и пять в фоновом режиме.
5. Собрать основную флуоресценции (F ₀₎ путем усреднения флуоресценцию в 5 трансформирования в эпидермисе затем вычесть среднее 5 трансформирования в фоновом режиме, прежде чем травмы. Экспресс изменение флуоресценции; F как отношение изменения по отношению к базовой линии [(F _T -F ₀₎ / F _0].

4. Визуализация F-актина Динамика после ранения

1. Примечание: В ответ на иглы ранения, наблюдается актина кольцо в месте раны, которые постепенно закрывает вокруг раны. В этом разделе протокол анализы закрытия раны путем измерения диаметра актина кольцо.
2. Создание трансгенных червей, которые выражают F-актин маркер, такой как дрозофилы moesin актина связывающего домена, слитого сGFP, экспрессируется под контролем специфического промотора эпидермальной таких как Col-19 (фиг.2А) (трансгена juIs352).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы получили аналогичные результаты, используя другие актин связывающий маркеры домена, таких как Lifeact или F-tractin (неопубликованные результаты).
3. Выполните иглу ранив на стр кол-19- GFP-moesin трансгенных червей. После иглы ранения, наблюдать кольцо GFP-moesin вокруг раневой на ~ 5 мин. Актина кольцо становится меньше в диаметре, и в конечном итоге закрывает 2-3 ч после ранив в животных дикого типа (Рисунок 2А).
4. Приготовьте 2% агара площадку на предметное стекло и передачи 10 червей на площадку в 2 мкл раствора 12 мМ левамизол. Изображение в GFP-moesin кольца 1 ч после ранения с помощью обычной конфокальной микроскопии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте конфокальной микроскопии приобрести Z-стеки (13 х 0,5 мкм) актина колец 1 ч после ранения.
5. Измерьте диаметр актина кольцо после ранения. Для количественного эпидермальный GFP-moesin, сначала сделайте Проекция максимальной интенсивности в Z-стека, а затем сделать 4 строки сканирования (при 45 ° друг к другу) над GFP-moesin кольца. Кольцо диаметром определяется как среднее от пика до пика расстоянии четырех сканирования линий (рис 2b). Для колец, которые уже закрыты, диаметр определяется как 0 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: F-актин кольца удобно измерять 1 ч после ранения, как это примерно на полпути через процесс заживления раны в дикого типа. F-актина кольца также может быть измерено в нескольких точках времени для получения временной ход закрытия раны. Временной интервал фильмы закрытия раны могут быть получены с помощью левамизола иммобилизованных червей и вращающийся диск конфокальной микроскопии.

5. Анализ индукции эпидермальной антимикробных пептидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Ранение также вызывает врожденные иммунные реакции в С Элеганс кожи. Транскрипцию генов, кодирующих антимикробных пептидов (AMPS) является Induced в эпидермисе. НЛП-29 (нейропептида-подобный белок) AMP сильно индуцируется ранив ^4. Для анализа как эпидермис контролирует AMP выражение после ранения, используйте трансгенных журналистам или ПЦР в реальном времени для обнаружения индивидуальные уровни транскриптов AMP.

1. Трансгенные репортер тест для врожденного иммунного ответа на ранив ^4.
2. Выполните иглы ранения (как в протоколе 1) на взрослых животных, выражающих трансгенных репортера frIs7, который содержит P НЛП-29- GFP и P-полковник 12- DsRed в качестве внутреннего контроля. Соблюдайте единой раны взрослых животных, темно-красные или оранжевые в GFP длинный пас фильтра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ранение черви дикого типа будет вызывать P НЛП-29 -GFP выражение, но не повлияет на P-полковник 12 -dsRed, в результате чего червей, которые появляются оранжевый, желтый, или зеленый под GFP длинный пас освещения. Потеря функции генов в р38 МАРК пути, такие как ПМК-1 или NSY-1 будет блокировать NLP-29 -GFPиндукция после ранения ^4. P НЛП-29- GFP экспрессируется на высоких уровнях в личиночной стадии
3. Выполните AMP индукционные анализы у молодых взрослых животных. Убедитесь, что единой раны у контрольных животных имеют низкие уровни GFP.
   Примечание: С NLP-29- выражение GFP также индуцируется осмотического стресса ^8, и может быть чувствительным к другим экологическим стрессам.
4. 6 ч после ранения, оценка число червей, которые имеют P НЛП-29 -GFP индукции (рисунок 3) ⁹ с помощью флуоресцентного рассекает сферу с GFP давно фильтр.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На 1 час после ранения P НЛП-29- GFP заметно индуцированных, достигая пика около 6 ч после ранения, а затем остальные повышен до 24 ч после ранения. Количественной оценки экспрессии при помощи визуального скоринга ^4,9. Кроме того, количественного определения уровней экспрессии с помощью флуоресцентного активирована червя сортировщик ^4. Для червя сортировщика, по крайней мере 50 животные должны быть ранен.
5. ПЦР в реальном времени анализ для кваntitating уровни транскрипции отдельных генов АМФ. Аналитические уровни транскриптов некоторых генов: НЛП-29, НЛП-30, ЧПУ-1, и CNC-5.
6. Выполните иглу ранив по дикого типа или мутантных червей (см протокол 1)
7. Соберите 50 раненых червей и 50 без единой раны червей в необходимые моменты времени (например, 3, 6, 24 ч) пост-ранения.
8. Извлечение РНК с использованием коммерческого набора в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
9. Производить обратную транскрипцию, чтобы получить общую 20 мкл кДНК с использованием коммерческого обратный набор транскриптазы.
10. Для RT-PCR, используют 0,2 мкл кДНК (1/40) из каждого образца в сочетании с зеленым Supermix флуоресцеина и 0,2 мкМ праймеров. Для сравнения качества РНК, используйте АМА-1 или SNB-1 RT-PCR в качестве эталона; сравнить AMP относительный уровень экспрессии путем нормализации внутреннего контроля (АМА-1 или SNB-1), или сравнить индукции раз пост-ранения (индукция AMP ранеными червей / без единой раны черви) по нормеального подхода к внутреннему контролю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CNC-1 и ЧПУ-5 caenacin семьи антимикробные пептиды, чьи транскрипция активируется ранив ^10. Как правило, иглы ранения индуцирует экспрессию (~ 500 раз для ЧПУ-1) в течение времени течение 4 ч ^10. Праймеры, используемые в опубликованных работ приведены в таблице 2.

6. Анализ выживания после ранения

1. ПРИМЕЧАНИЕ: Ранение активизирует по крайней мере, два независимых сигнальных путей в эпидермисе: Са ²⁺ зависит заживления ран путь и врожденную иммунную путь отклика. Оба пути необходимы для полного выживания стерильной ранения. Чтобы проверить, влияет ли мутант или лечение РНК-интерференции заживление ран, измерить выживание в 24-48 ч после ранения. Возможно, использовать обычные продолжительность жизни анализов, чтобы определить влияние ранения на продолжительность жизни ^4,9.
2. Выполните иглу ранив на молодого человека (L4 + 24 ч) черви (50 червей, повторите СевRAL раз) в соответствии с протоколом 1 выше. Поддержание эквивалентное количество единой раны червей в качестве контроля.
3. Проверьте выживания каждые 24 ч (передача раненых червей к новому агаром каждые 24 ч). Соблюдайте ~ 50% выживаемости 24 часа после ранения в мутантов, дефектных в заживлении ран, таких как GTL-2 или TIR-1, когда нормализуется к единой раны у контрольных животных. Смерть определяется как отсутствие реакции опорно-двигательного аппарата на ощупь от червей выбор.

Результаты

Лазерная или игла ранение вызовет быстрый и устойчивый подъем уровня эпидермиса Ca, как визуализировали с помощью Са датчиков, таких как GCaMPs (рис 1). Высота Ca происходит в течение нескольких секунд, и остается повышенным в течение нескольких десятков минут. Игла ранив воспроизво...

Обсуждение

Методы, представленные здесь иглой и лазерной ранения обеспечивают дополнительные подходы к оценке способности эпидермиса эпителия для ремонта повреждений. Лазерная ранение относительно локализованными и (в зависимости от лазерного конфигурации) может быть ограничен эпидермиса, в ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Denville Scientific	CA3510-8
Plastic Petri plate	Tritech Research	T3308	60 mm
Levamisole	Sigma	L9756	12 mM
Borosilicate glass capillary	World Precision Instruments	1B100F-4
Needle puller	Sutter Instrument	P-2000
Worm pick (platinum wire)	Tritech Research	PT-9010
M9 solution	Home-made		3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving
Trizol	Invitrogen	15596026	Use 500 ml for 50 worms
iQ SYBR Green	Bio-Rad	1708882
SuperScript III	Invitrogen	18080-051
PCR machine	Bio-Rad	C1000/CFX96
96-well PCR tubes	Bio-Rad	MLL9601
Image analysis software	Molecular Devices	Metamorph