JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Аннотация

Мирна клонирование и высокой пропускной последовательности, называется микроРНК-Seq, стоит особняком как транскриптома-широкий подход к количественной микроРНК с одной резолюции нуклеотидов. Эта техника захватывает микроРНК путем присоединения 3 'и 5' олигонуклеотидные адаптеры, чтобы молекул микроРНК и позволяет De Novo микроРНК открытие. Сцепление с мощными платформами для секвенирования следующего поколения, микроРНК-Посл играет важную роль в изучении микроРНК биологии. Тем не менее, значительные уклоны, введенные олигонуклеотидных шагов лигирования предотвратили Мир-Seq с должности работать как точный инструмент количественного. Предыдущие исследования показали, что перекосы в текущих микроРНК-Seq методов часто приводит к неточным микроРНК количественного с ошибками до 1000-кратного для некоторых микроРНК 1,2. Чтобы решить эти предубеждения придаваемых РНК перевязки, мы разработали небольшой РНК методом перевязки, что приводит к повышению эффективности перевязки более 95% как для 3 'и 5' шагов лигирования. Бенчмаркинг этот чатоказалась библиотека метод строительства с использованием эквимолярных или дифференциально смешанные синтетические микроРНК, последовательно дает считывает числа с менее чем в два раза отклонения от ожидаемого значения. Кроме того, этот высокоэффективный метод микроРНК-Посл позволяет точно генома микроРНК профилирования из в естественных условиях общего образцов РНК 2.

Введение

Методологии, основанные высокопроизводительного секвенирования были широко применяется для многих биологических образцов в последние годы значительно расширяющих наши представления о молекулярной сложности биологических систем 3,4. Тем не менее, подготовка образцов РНК для высокопроизводительного секвенирования часто придает определенные предубеждения, присущие занятого методологии, ограничивающие потенциальную полезность этих мощных методов. Эти метод конкретных предубеждения были хорошо документированы для перевязки основе, малых РНК библиотечных препаратов 1,2,5,6. Эти предубеждения привести к изменению 1000 раз в считывает числа для эквимолярными синтетических микроРНК, делая вывод о микроРНК изобилия из данных секвенирования дико переменная и ошибок.

Исследования фокусировки от свойств фага Т4, полученных РНК лигазы документально, что ферменты обладают нуклеотидные на основе предпочтений 7, которые проявляются в виде смещенные библиотеки в высокой пропускной экспериментов секвенирования 1,2,8. Для того чтобы свести к минимуму погрешностей придаваемых РНК лигазы, множественные стратегии были использованы; макромолекулярный скученности 9, рандомизации нуклеотидную на адаптере, который является ближайшим к лигирования сайта 6, и с использованием высоких концентраций лигирования адаптера 2. Благодаря сочетанию этих трех подходов мы разработали рабочий процесс для объективной подготовки небольших библиотек РНК совместимых для высокопроизводительного секвенирования (рисунок 1). Для прямых сравнений между текущими протоколами и наш оптимизированный метод, пожалуйста, обратитесь к нашему недавнему докладу 2. Это оптимизированный метод дает эффективность перевязки более чем 95% в обоих 3 'и 5' шагов и позволяет объективную перевязку малых молекул РНК из синтетических и биологических образцов 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно поддерживать РНКазы условия в течение всей процедуры.

1. аденилирование 3 'Linker

  1. Развести олигонуклеотид ДНК, предназначенный для 3 'лигирования реакций до 100 мкм в нуклеазы без H 2 O.
    ПРИМЕЧАНИЕ: олигонуклеотид должен иметь 5 'фосфатной группы, рандомизированное динуклеотида на 5' конце, и "dideoxycytosine 3. 5 'фосфатная группа является требованием фермента М-й для эффективного 5' аденилирование 10. Фосфат может быть добавлен путем предварительной обработки олигонуклеотида с полинуклеотидной киназы, или заказать с модификацией непосредственно. Рандомизированное динуклеотид на 5 'конце имеет важное значение для минимизации предпочтение, РНК-лигазы демонстрируют наверняка конец-конец присоединения реакции по сравнению с другими 6 последовательности. 3'dideoxycytosine помещает блокирующий элемент на 3'-конце олигонуклеотида ТO ингибировать образование линкер-линкера конкатемеры во время последующих стадий лигирования, а также служит для блокировки 'конец молекулы микроРНК-линкер, образованного на конце 3' 3 реакции лигирования 11. Олигонуклеотидный линкер последовательность, выбранная для объективной методом микроРНК-Seq заключается в следующем: 5'PO 4-NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG dideoxyC3 '.
  2. Собирают следующую реакцию: аденилирование 200 пмоль 3 'олигонуклеотидный линкер, 4 мкл 10х 5' аденилирование ДНК буфера, 4 мкл 1 мМ АТФ, 4 мкл Mth РНК-лигазы, нуклеазы без H 2 O до конечного объема 40 мкл.
  3. Инкубируйте реакции при 65 ° С в течение 1 часа. Завершить реакцию при нагревании до 85 ° С в течение 5 мин.
  4. Осадок adenylated линкер добавлением 2,5 объемов 100% этанола и 1/3 объема 10 М ацетата аммония для удаления остаточного АТФ и предотвратить непредвиденные лигирования в будущих реакций.
    1. Вкратце, смешать Альcohol, соль, и олиго раствор до гомогенности, вращается на максимальной скорости в микроцентрифуге (~ 15000 мкг) при 4 ° С в течение 20 мин. Вымойте гранул в 70% -ном этаноле, воздух сухой, и ресуспендируют в соответствующем объеме нуклеазы без H 2 O, получая 50-100 мкМ adenylated олиго.
  5. Подтвердите аденилирование, запустив на 18% полиакриламидном геле.
    1. Готовят гель смешением следующих вместе: 6,3 г мочевины, 6,75 мл 40% акриламида, и 1,5 мл 10-кратного КЭ. Добавить H 2 O в 15 мл.
    2. Смешать до мочевины полностью не растворится и добавить 150 мкл 10% (вес / объем) персульфата аммония (APS) и 15 мкл TEMED (tetramethlyethylenediamine).
    3. После того, как гель установить, предварительно поработать 30 минут при 24 В / см ширины гель с 1x КЭ работает буфер при комнатной температуре. После 30 мин составляет промойте лунки работает буфер.
    4. Смешайте 5 пмоль олигонуклеотидов с adenylated и равным объемом 2х денатурации РНК загрузочным буфером (95% (об / об) формамид,0,02% (вес / объем) SDS, 0,02% бромфенолового синего (вес / объем), 0,01% (вес / объем) ксилолцианола, 1,0 мМ ЭДТА), тепло кратко до 75 ° С, и оснастки охлаждали на льду. Разлить весь образец в лунку геля. Кроме того, включать одинаковый объем не-adenylated контроля и низкие стандарты молекулярных размеров вес.
    5. Запуск гель при 24 В / см до тех пор, бромфенолового синего не три четверти пути к нижней части геля. Разберите аппарат, после пятно гель с 1x SYBR-раствором золота в 1x КЭ и визуализировать на УФ-трансиллюминатор коробки (рисунок 2).
      Примечание: Гель очищают adenylated олиго аналогично тому, как описано выше, если "нет входного РНК" контроль не приводит к высокой количества продукта ПЦР по сравнению с образцами с входным РНК.

2. Linker Лигирование 3 'Конец микроРНК

  1. 3 'Лигирование
    1. Собирают следующие компоненты на льду в указанном порядке: 1,0 мкл 50% -ного (вес / объем) ПЭГ 8000, 0,5 &# 956; л 10x РНК-лигазы буфера (500 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl 2, 10 мМ ДТТ), 1,0 мкл adenylated 3 'Linker (100 мкм), ингибитор РНКазы 0,5 мкл, 0,5-8,0 мкг тотальной РНК, 0,5 мкл РНК-лигазы Т4 2, нуклеазы без Н 2 О до конечного объема 5 мкл.
    2. Смешайте реакцию с помощью пипетки, как раствор слишком вязким, чтобы вихря из-за высокой концентрации ПЭГ 8000. После тщательного перемешивания разместить реакцию в термоциклере с подогревом крышкой. Установка блока до 16 ° С, и инкубируют в течение 4 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция может быть расширена до конечного объема 20 мкл без потери эффективности лигирования. Реагировать в течение 4 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° С с получением по существу идентичные эффективность лигирования.
  2. Гель Очистка
    1. После 3 'лигирование, смешать реакцию с равным объемом 2х буфера для загрузки РНК. Нагревают до 70 ° С в течение 5 мин, и оснастки охладили на льду.
    2. Запустите пример на 15% полиакриламидном геле для очистки странице.
      1. Приготовьте 15% полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину, способом, аналогичным тому, который описан ранее на стадии 1.5.
      2. Предварительно запустить гель на 24 В / см ширины гель для не менее 30 мин. Выключите питание, флеш скважин, образец загрузить и запустить гель на же напряжение, предварительной перспективе.
      3. Загрузите образец и запустить страницу, пока голубой бромфениловый не только вышел из геля. Требуемый продукт будет мигрировать близко к ксилолцианола.
  3. Окрашивание, Визуализация, и иссечение
    1. Разберите гель устройство и место гель в чистом подносе с 1x работает буфера (КЭ), 1x Sybr-золото, и рок в течение 15 мин.
    2. Удалить гель от окрашивания блюдо и визуализировать на УФ трансиллюминатор коробки покрыта чистым полиэтиленовой пленкой. Перевязка продукт должен быть около 45 нуклеотидов в длину.
    3. Акцизный область, содержащую продукт лигирования с чистой Razoг лезвие и место в 0,5 мл микро-трубки центрифуги.
  4. Выделение продукта и осадков
    1. Пирс дно 0,5 мл микроцентрифужных трубки с 30 G иглы и разместить пирсинг трубку во втором чистой, с низким уровнем удержания, 1,5 мл микроцентрифуга трубки. Центрифуга течение 5 мин при 15000 х ~ г.
    2. Визуально подтвердить, что весь срез гель перемещается через отверстие во внутренней трубке. При необходимости, используйте чистую пипетки, чтобы подтолкнуть некоторые фрагменты геля ближе к лунке.
    3. Отменить пустую трубку 0,5 мл и добавляют 400 мкл буфера с высоким содержанием соли колонке (HSCB 400 мМ NaCl, 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,1% SDS) к суспензии акриламида. Рок трубка (и) при 4 ° С в течение ночи.
    4. Передача суспензии до 0,22 микрон из ацетата целлюлозы спинового колонке с использованием пипетки широким отверстием. Центрифуга в течение 3 мин при комнатной температуре при 15000 х г ~ собрать всю жидкость от акриламида гель матрицы.
    5. Перенесите жидкость в чистую, с низким уровнем удержания, 1,5 мл трубки содержатчисле 1 мкл 20 мг / мл гликогена. Добавить равный объем изопропанола и 1/10 ацетат натрия объем. Смешайте раствор путем обращения трубки несколько раз и выпадают в осадок в -80 ° C морозильнике в течение 20 мин.
    6. Центрифуга на полной скорости при 4 ° С в течение 20 мин для осаждения нуклеиновой кислоты. Удалить супернатант и мыть в 70% -ном этаноле. Воздух сухой осадок в течение 10 мин при комнатной температуре и приступить непосредственно к 5'-лигирования шага.

3. Linker Лигирование к 5 'концу микроРНК-3' Linker Hybrid

  1. Для гранулированного нуклеиновой кислоты, добавить следующие компоненты: 2 мкл ПЭГ 8000 (50% вес / объем), 0,5 мкл 10х буфера РНК-лигазы, 0,5 мкл АТФ (10 мМ), 0,5 мкл N, N-РНК олиго (100 мкМ), а Н 2 O до конечного объема 4 мл.
    Примечание: В состав «NN-РНК олиго» заключается в следующем 5'-дидезокси-инвертированного TCUACAGUCCGACGAUCNN3 'и очищали с помощью ВЭЖХ изготовителем.
  2. Смешиватьэтот образец с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Делайте это в течение некоторого времени (до 5 мин), чтобы убедиться, что осадок был полностью повторно растворены. Если повторное растворение является проблематичным, нагрева образца кратко (3-5 мин) до 37 ° С и возобновить пипетирования смешивать.
  3. После того, как осадок снова в раствор, передавать содержимое на чистую ПЦР-пробирку, содержащую 1 мкл смеси 1: 1 ингибитора РНКазы и РНК-лигазы Т4 (1) 5 ед. Опять перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
  4. Инкубируйте реакции в термоциклере при 37 ° С в течение 4 ч. Действуйте немедленно синтеза кДНК.

4. Обратный Транскрипция / Синтез кДНК

  1. Добавьте следующие компоненты в 5 'реакции лигирования: 2 мкл буфера 5х РТ, 0,75 мкл 100 мМ ДТТ, 1 мкл праймера RT Illumina 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3' (1 мкМ), и 0,5 мкл дНТФ (10 мм).
  2. Перемешать с помощью пипетки и тепла до 65 ° С в течение 5 мин. Затем медленно остыть на скамейке тсоч.
  3. После реакции охлаждают до комнатной температуры, место трубки на льду и добавляют 0,5 мкл каждого из фермента обратной транскриптазы и ингибитор РНКазы. Смешать с помощью пипетки и место в термоциклер для дополнительного этапа, указанного в инструкции изготовителя.
  4. После завершения Добавьте 5 мкл нуклеазы без H 2 O, чтобы довести конечный объем кДНК библиотеки до 15 мкл.

5. Библиотека Подготовка

  1. Для индексации ПЦР, сборки следующую реакцию на льду: 6 мкл 5х буфера Phusion, 1 мкл дНТФ (10 мм), 0,9 мкл ДМСО, 0,75 мкл 5 'праймер (25 мкМ), 0,75 мкл 3' Праймер (25 мкМ), 3 мкл кДНК-библиотеку (переменная концентрация в зависимости от количества входных), 0,5 мкл Phusion полимеразы (1 единица), нуклеазы без Н 2 О до конечного объема 30 мкл. Выбор Последовательности праймеров, чтобы обеспечить совместимость с шаблоном и секвенирования платформевыбор.
    1. Запуск реакции ПЦР со следующими параметрами: первоначальной денатурации при 98 ° С в течение 3 мин, в течение первых 4 циклов, денатурации 98 ° C в течение 15 сек, отжиг при 50 ° С в течение 15 сек, расширить при 72 ° С в течение 15 сек ,
      Примечание: В зависимости от количества исходного материала, различаются полные числа ПЦР циклов. Как правило, для входа 1-2 мкг общей РНК, 13 циклов ПЦР всего являются достаточными для генерации библиотеку микроРНК-Seq.
    2. Провести последующие циклы, например, циклы 5-12, в двухступенчатой ​​форме, где комбинируются и проводили при 70 ° С в течение 30 сек и денатурации и отжига удлинительные циклы снова 98 ° С в течение 15 сек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем реакции составляет от 30 мкл разрешить паузу программу ПЦР и удалить 10 мкл аликвоты в заранее определенные номера цикла для отслеживания появления нужного продукта. Как правило, циклы 10, 13, и 16 выбраны для тестирования от общей выборки РНК.
  2. Подготовить8% без денатурации гель акриламида путем смешивания 2 мл 40% акриламида, 1 мл 10-кратного КЭ, и H 2 O в 10 мл. Затем добавить 100 мкл 10% APS и 10 мкл TEMED. Налейте гель и пусть множество.
    1. Предварительно запустить гель при 12 В / см ширины гель в течение 30 мин. Флеш скважин. Добавить 1 мкл 10х буфера для нанесения (15% Ficoll-400, 66 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,1% (вес / объем) SDS, 0,01% (вес / объем) бромфенола синего), добавить 10 мкл Образец в каждую лунку размерами 5 мм х 1 мм х 15 мм. Как правило, каждый хорошо можно загрузить до 30 мкл образцов. Запустите образец геля на 10 В / см ширины гель в 1x КЭ буфера до бромфенол синий краситель просто не выбегает из нижней части геля.
    2. Пятно и визуализировать гель, как описано в шаге 2.3.
    3. Акцизный пара группа 146 базовый и вымывания в течение ночи в 0,25 мл HSCB способом, аналогичным тому, который описан в разделе 2.4. Осадок ДНК в равном объеме изопропанола и 1/10 объема ацетата натрия. Промойте осадок в 70% еthanol и ресуспендируют в буфере ТЕ.
    4. Количественная библиотеку с помощью PicoGreen в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Ожидаемые результаты за предшествующий метод должен сначала быть наблюдение за одну смену нуклеотидной (увеличение) размера олигонуклеотида ДНК, которая была предметом аденилирование по Mth РНК-лигазы (Рисунок 2). После лигирования 3 ', визуализация акриламида гель показ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Методика описана в данном документе используется несколько ключевых переменных, чтобы максимизировать эффективность лигирования, а именно высокие концентрации PEG, использование линкеров рандомизированных и высокую концентрацию линкеров 2,6,9. Такой подход позволяет надежно кол...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors declare no competing financial interests.

Благодарности

The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked)Integrated DNA Technologiescustom
5' LinkerIntegrated DNA Technologiescustom5' blocked, HPLC purified
T4RNL2 (1-249 K227Q)New England BiolabsM0351SSpecialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters
10x Ligation buffer (without ATP)New England BiolabsIncluded with M0351S
10x Ligation buffer (with ATP)New England BiolabsIncluded with M0204L
RNaseOUTInvitrogen10777-019
Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000)New England BiolabsIncluded with M0204L
Nuclease-free waterAmbionAM9937We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality.
T4RNL1New England BiolabsM0204L
Superscript III RT kitInvitrogen18080-051 
Phusion PCR kitNew England BiolabsM0530S
Illumina RP1 primerIntegrated DNA TechnologiescustomSequence information available from Illumina
Illumina RT primerIntegrated DNA TechnologiescustomSequence information available from Illumina
Illumina index primer(s)Integrated DNA TechnologiescustomSequence information available from Illumina
40% AcrylamideFisher ScientificBP14081
UreaSigma AldrichU6504
Ammonium persulfateSigma AldrichA3678
Tetramethyethylenediamine (TEMED)Sigma AldrichT9281
2x Denaturing RNA loading bufferNew England BiolabsIncluded with M0351S
Razor bladesVWR55411-050
SpinX Centricon tubesCostarCLS8161
Low retention microfuge tubesFisher Scientific02-681-320
Sybr GoldInvitrogenS-11494
Adenylation kitNew England BiolabsE2610L

Ссылки

  1. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
  2. Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109(2013).
  3. Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
  4. Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  5. Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
  6. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141(2011).
  7. McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
  8. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54(2012).
  9. Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
  10. Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
  11. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
  12. Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
  13. Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

93

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены