Лазерная Захват микродиссекция - Демонстрация изоляции отдельных допамина нейронами и вся область брюшной покрышки

Резюме

Изоляция отдельных нейронов допамина или вентральной покрышки площадь с прямым или косвенным иммуногистохимии показано методом лазерной съемки микродиссекции. Обсуждаются Параметры для изоляции ткани из стекло с помощью инфракрасного лазера и от мембранных слайдов с использованием сочетания инфракрасного и ультрафиолетового лазера.

Аннотация

Лазерная захватывающая микродиссекция (LCM) используется для выделения концентрированного население отдельных клеток или точных анатомических областей ткани из тканевых срезов на предметном стекле микроскопа. В сочетании с иммуногистохимии, LCM можно использовать для выделения отдельных типов элементов на основе специфического маркера белка. Здесь методика описана LCM для сбора конкретной популяции нейронов допамина непосредственно меченных тирозин гидроксилазы иммуногистохимии и выделения допамина нейрона, содержащего область брюшной области покрышки с помощью косвенного тирозин гидроксилазы иммуногистохимии на участке, прилегающей к тем, которые используются для LCM. Инфракрасный (ИК) захвата лазер используется для обоих анализировать отдельные нейроны, а также брюшной покрышки области от стеклах и на НОК крышкой для анализа. Полное обезвоживание ткани со 100% этанола и ксилола имеет решающее значение. Сочетание лазера ИК захвата и ультрафиолетовое (УФ) резнг лазер используется для выделения отдельных нейронов допамина или вентральной области покрышки при использовании PEN мембранные слайдов. ПЭН мембраны скольжения имеет значительные преимущества по сравнению предметное стекло, как это обеспечивает более высокую согласованность захвата и сбора клеток, работает быстрее сбора больших кусков ткани, меньше зависит от дегидратации и приводит к полному удалению ткани от ползуна. Хотя удаление больших площадей ткани из стеклянного слайда возможно, это значительно больше времени и часто оставляет некоторое остаточное ткани позади. Данные, приведенные здесь, показывают, что РНК достаточного количества и качества могут быть получены с использованием этих процедур измерений количественной ПЦР. Хотя РНК и ДНК являются наиболее часто изолированных молекул из ткани и клетки, собранные с LCM, изоляции и измерения микроРНК, белок и эпигенетических изменений в ДНК может также извлечь выгоду из повышения анатомической и клеточной разрешения, полученные с помощью НОК.

Введение

Все ткани состоит из гетерозиготной популяции клеток. Это особенно важно для мозговой ткани, состоящий из различных морфологически и / или нейрохимически различных нейронов, окруженных различных типов глиальных клеток (олигодендроцитов, микроглии и астроцитов). Кроме того, различные области в мозге, таких как зоны коры головного мозга или ствола мозга ядер, имеют конкретные функции. Таким образом, способность выделить конкретные популяции клеток или очень маленьких анатомически различных областях, в сочетании с аналитическими методами (т.е. Q-PCR, микрочипы, РНК-последовательности, а также протеомики), может заметно улучшить понимание различных биологических процессов. LCM является технологией, которая обеспечивает возможность изолировать очень дискретных анатомические области или конкретных клеток из ткани на предметное стекло микроскопа, обеспечивающего гораздо более однородным источник для дальнейшего анализа различных молекул, таких как РНК, микроРНК, ДНК и белков.

T "> С LCM была впервые введена, несколько различных подходов были использованы для microdissect клеток из ткани ^1-3. Первые подходы включен прикреплять ткани на слайде с помощью инфракрасного (ИК) лазер и термопластичной пленки и не- способ связи с использованием ультрафиолетового (УФ) лазер резки, чтобы отделить клетки или ткани и сбора в трубу. Затем LCM был успешно использован на различных тканей и типов клеток, и показали, чтобы быть совместимым с выделением различных молекул для нисходящего анализа в том числе РНК, микроРНК, ДНК и белки, в том числе ферментативной активности ^1,4-7. Здесь LCM демонстрируется с помощью системы LCM, который использует резки УФ лазер и захвата ИК лазер для резки вокруг клетки или ткани и присоединения его к LCM шапка, соответственно. Эта система LCM использует как лазер ИК захвата, чтобы расплавить пластиковую пленку на крышке над клетке или ткани интерес, который клетки к пластиковой пленки и удаляет его из Тон тканей с удалением колпачка (рис 1). Кроме того, в сочетании с ИК-лазера, UV лазер доступны для выреза ткани или клетки интерес ткани, установленный на слайды с мембраной затем выделяют путем присоединения ткани в LCM колпачок с помощью ИК-лазера (рисунок 2). Краткий обзор этих методов можно найти на рисунках 1 и 2.

Несколько вариантов на этой техники описаны либо выделить отдельные клетки, используя прямой флуоресцентный иммуногистохимии и косвенное технику иммуногистохимии наведением, который используется для изоляции области ткани на основе экспрессии специфического белка. В частности, выделение дофамина нейронами из черной субстанции и изоляции брюшной области покрышки и последующего выделения РНК из свежей, замороженной ткани мозга показаны. Как РНК является наиболее лабильным молекул измеренных (по сравнению с ДНК или белка), STEPS, чтобы помочь сохранить целостность РНК входят и данные отображаются на количество и качество РНК, полученной.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Мозговая ткань от мышей была использована в соответствии с Национальными Институтами Руководство здравоохранения для ухода и использования лабораторных животных и протоколы исследования были утверждены уходу и использованию комитета Институциональная животных в Миссисипи государственный университет им.

1. Подготовка слайдов и тканей

1. Используйте либо Силан-подготовительные слайды или полиэтилен napthalate (PEN) мембрана стеклах.
2. Для выделения РНК, DIP скользит в РНКазы дезактивации решения, промыть 3 раза РНКазы водой, затем обезвоживают с градуированной серии РНКазы этанола и вакуумной высохнуть в течение 30 мин.
3. Вырезать срезов ткани в 10 толщиной мкм с помощью криостата и смонтировать на подготовленных РНКазы слайдов. Держите замороженных срезах при секционирования для сохранения качества РНК.
   Примечание: Убедитесь, что ткань приблизительно 4 мм от краев ползуна в качестве LCM не может удалить ткань, которая находится слишком близко к краям слайда. В Ордг ткани, чтобы удалить из мембраны слайд PEN, гарантировать, что ткань 4 мм от левой, верхней и нижней, и 7 мм от правой стороны ползуна которые размеры мембраны, не прикрепленные к каретке.
4. Для выделения отдельных популяций клеток с использованием прямой иммуногистохимии, срез ткани на либо силан-Prep слайдов или PEN мембранных слайдов. Для выделения областей ткани с использованием косвенных методов иммуногистохимии экскурсии, крепление один набор разделов на силан-Prep слайд для иммуногистохимии и альтернативных участков по обе ручку мембраны слайд и / или силановый-Prep слайд для использования в LCM.

2. Подготовка ткани для лазерных Capture - Быстрое Тирозингидроксилаза Иммуногистохимия для прямого лазерного Захват иммунореактивного клеток

1. Схема ткани с гидрофобным пера и дайте высохнуть.
2. Закрепить ткань в смеси ацетон-метанол (1: 1) раствор при -20 ° С в течение 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ouг опыт показал, что фиксация ацетон-метанол в результате гораздо более последовательной иммуногистохимии, чем ацетон или метанол в одиночку.
3. Промыть слайдов в фосфатно-солевом буфере (PBS) с 1% Тритон (РНКазы).
4. Крышка секции с 100-200 мкл PBS с 1% Тритон с тирозин гидроксилазы антитела разводили 1: 100 400 ед / мл Rnasin. Инкубируют в течение 5-10 мин.
5. Кратко в PBS Промыть два раза и PBS-1% Тритон.
6. Покрытие ткани с 100-200 мкл козьих антител против кроличьего IgG, меченного Alexa Fluor 488, разбавленного 1: 100 в PBS-1% Тритон с 400 Ед / мл Rnasin и 50 нг / мл DAPI. Инкубируют в течение 5 мин.
7. Промыть два раза в PBS затем обезвоживают 30 с в серии градуированных РНКазы свободного этанола (75% -75% -95% -95% -100% -100%).
8. Инкубируют в двух промывок ксилола в течение 1 мин, затем 5 мин.
9. Удалить слайды из ксилола непосредственно перед использованием для LCM и дайте высохнуть на воздухе.

3. Подготовка ткани для лазерных Capture - тирозинГидроксилазы Иммуногистохимия для косвенного Лазерная Захват иммунореактивного регионов

1. Процесс один слайд с примыкающих к участкам, установленный на Силан-подготовительные и / или PEN мембранных горками для иммуногистохимии.
   Примечание: Процедуры, используемые здесь, аналогичны тем, которые ранее сообщалось ^5. Для демонстрации изображений, реакционную хромоген диаминобензидина (DAB) был использован для визуализации тирозин гидроксилазы нейронов, представляющих интерес.
2. Для слайдов, используемых для LCM, исправить в течение 5 мин в 100% ацетоне при 4 ° С.
3. Высушить ткани в градуированных серии РНКазы этаноле (75% -75% -95% -95% -100% -100%) в течение 1 мин каждый.
4. Инкубируют в двух промывок ксилола в течение 1 мин, затем 5 мин.
5. Удалить слайды из ксилола непосредственно перед использованием для LCM и дайте высохнуть на воздухе.

4. Использование Лазерная захватывающая микродиссекция системы

ПРИМЕЧАНИЕ: LCM прикладная программа имеет 10 панелей инструментов и 2 окна для контроляПроцедура микродиссекции. Панель инструментов: 1. Микроскоп 2. Захват Лазерная гравировка, 3. лазерной резки, 4. Исследование, 5. Навигация, 6. Материалы, 7. Захват Группы, 8. микродиссекции, 9. шрифта, 10. Аннотация. Окна: 1. живого видео и 2. Дорожная карта.

1. Откройте дверь, выбрав вкладку «открытых дверей» в панели инструментов Материалы в системе LCM программного обеспечения.
2. Загрузка скользит по три доступных слотов. Для этой демонстрации, нагрузка один слайд с тирозингидроксилазы иммуногистохимии визуализированы с DAB, один силан-Prep горкой и одна ручка мембраны слайд каждого помечены для быстрого флуоресцентный Тирозингидроксилаза иммуногистохимии. В типичном эксперименте, использование либо немеченого ацетон неподвижные части с опорным слайд меченого для тирозин гидроксилазы, используя DAB или слайдов непосредственно меченных флуоресцентными тирозин гидроксилазы для лазерного захвата.
3. Загрузите LCM колпачков в свободный слот.
   ПРИМЕЧАНИЕ: планы и HS LCM колпачков доступны для использования. Тип LCM колпачок для использования девисит от числа клеток или количества ткани должны быть собраны. Макро горки перечислены собирать до нескольких тысяч клеток в то время как HS колпачки могут собирать несколько сотен. Макрос слайды позволяют более коллекции тканей, но требуют 50 мкл буфера для лизиса. HS крышки, при использовании адаптеров, требуется только 10 мкл буфера для лизиса, который позволяет для большей пропорциональной восстановления РНК.
4. Закрыть дверь.
5. Загрузите слайд, чтобы активировать окно Дорожная карта, которая обеспечивает рабочую вид на весь слайд, это позволяет по выбору интересующей области (Рисунок 3). Просмотр Дорожную карту по ходу окне видео, чтобы перейти к интересующей области.
6. На панели инструментов Материалы, определить мембранные слайды перо, установив флажок над задвижки. Для обеспечения свойства крышек, щелкните правой кнопкой мыши на крышках в баре материалы Инструменты и выберите «шапка свойства питания". Отметьте, указывающие положение крышек и выберите либо МаCRO или HS шапки.
7. Выберите вкладку "флуоресценции" в строке Микроскоп инструмента для включения люминесцентной лампы и позволяют люминесцентная лампа, чтобы согреться. Используйте синюю и УФ-фильтры, чтобы визуализировать Alex Fluor 488 и DAPI, соответственно. Используйте вкладку "Adjust Camera" для увеличения чувствительности изображения, чтобы увидеть флуоресцентно меченых клеток.
8. На панели инструментов Материалы, щелкните правой кнопкой мыши по шапке и переместите его к слайду интересов. Двойной щелчок на месте в Дорожной карте, чтобы выбрать область, которая появляется в окне живого видео. Перемещение крышку вокруг на слайде, выбрав область на дорожной карте (двойной левый клик) и щелкните правой кнопкой мыши и выбрав "Place крышку в центре региона."
9. Перед использованием лазера захвата ИК, цель и настроить его на прочность. Поместите крышку в области выскользнуть из ткани. На панели инструментов Capture лазер, выберите "Включить". Регулировать мощность (3-100 мВт), пульс (100-1000000 μ; С) и # Удар лазера. Пожарная лазер ИК когда крышка по части слайда без ткани и проверить, если лазер достаточно тает LCM колпачок мембраны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это называется увлажнение, которое тает полимерной мембраны на крышке, так что он контактирует предметное стекло. Достаточное увлажнение виден как темное кольцо, слитый с горкой с центром кольца четкой (рис 4 для примеров достаточной и недостаточной плавления). Если смачивания не хватает, регулировать мощность и пульс, и испытание на огнестойкость, пока это не будет достигнуто. Кроме того, несколько пожаров лазера также могут быть использованы.
10. Когда интенсивность лазерного ИК регулируется, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Capture лазер здесь", чтобы прицелиться лазера.
    Примечание: Этот шаг говорит компьютеру, где лазерный ИК захвата, направленную на ткани. Этот шаг с целью лазер имеет решающее значение, и необходимо повторить каждый раз, когда колпачок перемещается или цель изменяется.

5. Лазерная Захват микродиссекция индивидуального допамина нейронов от силана-Prep слайдов

1. Перейти к интересующей области, чтобы захватить клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: пример изолирующих дофамина нейронами показано здесь.
2. Для захвата отдельных клеток офф Силан-Prep слайд, выберите вкладку "LCM", а затем значок "единая точка" в баре микродиссекция инструмента.
3. На панели инструментов микроскоп, откройте вкладку "Выдержка" для переключения между флуоресценции и светлого поля с люминесцентными фильтры вкладки, чтобы выбрать соответствующие фильтры и использовать вкладки Задачи изменять масштаб изображения. После того, как клетки интерес видны в окне живого видео, регулировать размер светового пятна используется для обозначения клеток, представляющих интерес для приблизительного размера клеток. Для этого перейдите на вкладку пятна на панели Capture Лазерная инструмента затем щелкните на одной стороне окрашенной клетки, а затем, нажав на противоположной стороне.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот рассчитываетДиаметр пятна и отображает значение.
4. Отметить клетки, представляющие интерес, нажав на них, пока выбран значок "Единая точка". Сделайте это, чтобы поместить точечный маркер на каждой клетке. Здесь Синий фильтр и цель 10X используются для визуализации допамина нейронами. Протестировать и цель ИК-лазера на крышке, где нет ткани под ней, как описано в шагах 4,9 и 4,10.
5. Как только клетки помечены, выберите "Перейти - вырезать и захват» вкладку на панели микродиссекция инструмента и лазера ИК автоматически срабатывает при всех отмеченных клеток выбранных. Кроме того, в случае необходимости, огонь ИК лазер вручную в любой точке интереса (фиг 5D).
6. Перемещение крышку от участка и на открытой области слайда, чтобы проверить, если клетки были взяты в плен на LCM крышкой. Убедитесь, что клетки интерес удаляются из слайда (фиг.5В, Е) и прикреплены к LCM колпачок (5С, F). Го документаэто процесс, нажав на вкладке "Захват изображения" в панели инструментов микроскопом.
7. После завершения сбора ткани, снимите крышку, нажав правой кнопкой на крышке и выберите "Переместить в", а затем "Выгрузить".

6. Лазерная Захват индивидуального допамина нейронов от ПЕН-мембраны слайдов

1. Для захвата отдельных клеток от ПЕН-мембранных слайдов с использованием как ИК и УФ лазеров, выберите "Вырезать и записывай" вкладки в панели микродиссекция инструмента. Выберите вкладку "единой точки", чтобы отметить клетки интерес. Используйте вкладку "линии разреза", чтобы наметить каждую ячейку. Будьте уверены, чтобы проверить лазер ИК, как описано в шаге 4.9 и 4.10 и проверить УФ лазер для определения минимальную интенсивность, необходимую, чтобы сократить думал PEN мембраны и ткани (рис 4 и 5)
2. Выберите "Capture и сократить" на вкладке панели микродиссекция инструмента. При сборе отдельные клетки с помощью этой техники, будетУбедитесь, что огонь ИК-лазера, сначала сопровождаемого УФ лазера как эти маленькие кусочки могут быть потеряны, если они отрезаны до начала прикреплена к LCM крышкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс также может быть сделано вручную, стрельба из лазера ИК в точке интереса и клетки индивидуально описано с УФ-лазера.
3. После сбора клеток, представляющих интерес, переместить LCM колпачок, как описано выше на стадии 5,7, чтобы определить, если клетки были удалены, и прикреплен к крышке (рисунок 6).
4. После завершения сбора ткани, снимите крышку, нажав правой кнопкой на крышке и выбрав "Переместить в", а затем "Выгрузить".

7. Захват вентральной покрышки Площадь от Силан-подготовительные слайдов

1. Чтобы определить область интереса, используйте слайд обрабатывается для иммуногистохимии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для демонстрации вентральной области покрышки изолирован (7А).
2. Загрузите LCM крышку и проверить лазеры, как в шагеŠ 4,9 и 4,10.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, Макро LCM крышка используется, но HS крышка также может быть использован (рисунок 8).
3. Для выделения области ткани (т.е. вентральной области покрышки) с силиконовым-Prep слайд, выберите вкладку "LCM" в строке микродиссекция инструментов, затем выберите вкладку "Полигон-внешний". Опишите область интересов в окне живого видео. В зависимости от размера области для сбора, выделить область интереса при малом увеличении (2x цель). Для сбора, однако, прибор использует цель 10X поэтому регулировать и цель ИК-лазера под цели 10X до захвата.
4. Выберите "Go - захват и Cut" вкладки в панели микродиссекция инструмента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: компьютер автоматически срабатывает ИК лазер в течение всего выбранной области (рис 7F, I). Если LCM мембрана не растаял достаточно по всей площади, лазер может быть уволен человекпенно или повторяется весь процесс.
5. Перемещение LCM колпачок из ткани, чтобы определить, насколько хорошо ткань была собрана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один проход, используя этот метод, как правило, оставляет некоторые ткани позади на слайде (см Figure7G). Если это происходит, повторите выбор и захватить шаг выше. Повторяя этот шаг может увеличить количество ткани, собранной (фиг 7J).
6. После завершения сбора ткани, разгрузить пробку, щелкнув правой кнопкой на крышке и выбрав "Переместить в", а затем "Выгрузить".

8. Захват вентральной покрышки Площадь от ПЕН-мембраны слайдов

1. Используйте слайд обрабатывается для иммуногистохимии в качестве руководства для выбора интересующей области из ткани на мембрану слайд PEN, как указано выше.
2. Выберите "вырезать и Capture" вкладки в панели микродиссекция инструмента. Выберите вкладку "линии разреза" и наметить область интереса, используя immunohistocheМистри помечены слайд в качестве руководства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программа автоматически добавит пятна на ИК-лазера, чтобы прикрепить ткань к крышке. Используйте вкладку "единой точки", чтобы добавить дополнительные места, чтобы лучше защитить ткань к крышке.
3. Под 10X цели, испытания на огнестойкость и направлены ИК и УФ лазерного, как описано в 4.9 и 4.10. Проверьте, что УФ-лазер может проникать через мембрану на слайде и что это сокращение соответствует расположению на экране компьютера. Используйте УФ лазерного силу, что как раз достаточным, чтобы разрезать мембрану и ткани, но не повреждает ткани (рис 5).
4. Выберите "Go - захват и Cut" вкладки в панели микродиссекция инструмента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: компьютер автоматически срабатывает ИК лазер на всех помеченных точек в ткани, чтобы прикрепить ее к крышке затем огонь УФ лазер, чтобы сократить слайд PEN мембраны и ткани (7С). Дополнительные ИК расплавленные пятна могут быть необходимы для адекватного прикрепить ТИСподать в суд на LCM колпачок, который также может быть добавлен вручную.
5. Перемещение LCM колпачок из ткани, чтобы определить, если ткань была удалена из секции (7С) и прикреплены к крышке (7С).
6. После завершения сбора ткани, чтобы снять крышку, нажмите правой кнопкой мыши на колпачке и выберите "Переместить в", а затем "Выгрузить".

9. Выделение РНК

1. Для сбора РНК из захваченных клеток или тканей, инкубировать LCM колпачок мембраны в буфере для лизиса РНК в течение 30 мин при 37 ° С.
   Примечание: Для HS крышками, адаптер доступен, что позволяет использовать всего 10 мкл буфера для лизиса на крышке и подключается к 0,5 мл микроцентрифужных трубки. Макро-колпачки требуют 50 мкл буфера для лизиса и крепится непосредственно к 0,5 мл микроцентрифужных трубки.
2. После инкубации, спина буфер лизиса вниз, в 0,5 мл микроцентрифужных трубки.
3. Для обеспечения полного лизиса всех клеток оR ткани, очистить от LCM крышки мембраны крышки и места в буфере для лизиса.
4. Для проверки целостности РНК, использование РНК, выделенной из ткани, остающегося на слайде после LCM для измерения целостности РНК.
   Примечание: Из-за ограниченного РНК образца, полученного с LCM, это, как правило, не практично, чтобы проверить целостность РНК на LCM выделенной РНК, однако, РНК из оставшейся ткани обеспечивает хороший показатель любой деградации РНК за счет фиксации, иммуногистохимии и времени в течение Процедура LCM.

Результаты

Микрофотография на фиг.6 и 7 показывают возможности для выделения отдельных нейронов допамина. Ток анатомические разрешение составляет около 5-10 мкм, как маленький размер пятна, которые могут быть последовательно производятся на LCM шапки, чтобы изолировать клетки. Единственное ограничение для выделения конкретных типов клеток является возможность визуализации клеток. Хотя LCM способен выделения отдельных нейронов допамина, загрязнение частей соседних немеченого клеток скорее всего имеет место. Таким образом, окончательная проба концентрированный набор дофамина нейронами, не чистый население дофаминовых нейронов. Эта технология также может изолировать небольшие участки ткани, такие как дискретные ядер или регионах в пределах мозга, как показано с выделением вентральной области покрышки. Предыдущие публикации показали, это применение в ткани головного мозга, а также для изоляции патологической ткани из нормальной ткани ^5,11.

Из-за Наиболее распространенное использование клеток и тканей, изолированных с помощью НОК является анализ РНК, процедуры, представленные были оптимизированы, чтобы сохранить целостность РНК. Для того чтобы определить качество РНК, которые остались следующие LCM, РНК выделяли, используя на основе оксида кремния спин колонки, из ткани на слайдах следующих LCM, либо после быстрого тирозин гидроксилазы флуоресцентного процедуры иммуногистохимии или фиксации в ацетоне. Качество РНК измеряется и сравнивается со значениями для РНК из коммерчески доступных всем РНК головного мозга (рисунок 9). Качество РНК была снижена в образцах РНК из ткани, используемых для LCM с более низкой целостности после иммуногистохимии (RIN не доступна), а затем ацетоном фиксации (RIN 2,6), по сравнению с целой РНК головного мозга (RIN 8,2), как можно видеть по относительному снижению Высота пика рРНК S28 по сравнению с пиком S18. Тем не менее, РНК сохранила 18S и 28S полосы и экспрессии генов может быть измерена с помощью Q-PCR.

Чтобы измерить количество РНК, полученной из нейронов, полученных с помощью LCM, дофамин нейронов (50, 100 и 200 дофамина нейронами) были выделены из вентральной области покрышки от силана-подготовительные слайдов. РНК выделяли с использованием диоксида кремния на основе спин колонки и количество РНК была измерена. На основании стандартной кривой, полученной в общей сложности 17,3, 24,8 пг и 50,9 пг / мкл был выделен из 50, 100 и 200 дофамина нейронами, соответственно (фиг.10А). Для измерения количества РНК с Q-PCR, в диапазоне концентраций от всей РНК головного мозга и РНК из дофамина нейронами были обратной транскрипции и ген β-актина была измерена с помощью Q-PCR, как описано выше ^5. На основании этих измерений, концентрации 3,55, 6,82 и 20,58 пг / мкл рассчитывали из 50, 100 и 200 дофамина нейронами, соответственно (фиг.10В).

Чтобы продемонстрировать, как изоляция дофаминовых нейронов сравнивает к изоляции всей VЕНТРАЛЬНАЯ покрышки зона с LCM, допамин нейронов конкретных генов (Nurr1, тирозин гидроксилазы, и переносчика дофамина) измеряли с Q-ПЦР в этих двух различных типов образцов и по сравнению с экспрессией β-актина (рисунок 11). Поскольку нижняя С _Т значения генерируются с высокой концентрацией интересующего гена, уменьшение delta; C _T показывает повышенную экспрессию генов допамина нейронов по отношению к β-актина. Это показывает, как выделение отдельных нейронов допамина концентратов экспрессию допамина нейронов специфических генов. В вентральных образцов покрышки площадь, дофамин нейронов конкретные гены, которые разводили в качестве других клеток (без дофаминергических нейронов и глиальных клеток) также будут собраны, которые экспрессируют β-актина, но не экспрессируют гены нейронов допамина.

Рисунок 1. Лазерная захвата с помощью инфракрасного (ИК) захвата лазера на. мелкая пластика LCM крышка имеет мембрану на дне, что находится на вершине ткани, установленной на предметное стекло (шаг 1). Когда ткань или клетки интерес идентифицируется, лазерная захвата ИК обжигают через LCM колпачок, чтобы расплавить небольшой углубление в мембране на основной ткани / клетки (шаг 2). Когда LCM колпачок снят, ткань удаляется из микроскопа и остается прикрепленной к LCM крышкой.

Рисунок 2. Лазерная захвата с использованием инфракрасного (ИК) лазер захвата и ультрафиолетового (УФ) лазерной резки. Чтобы получить большие участки ткани или облегчать восстановление клеток с использованием УФ-лазера, ткань установлена ​​на слайде с мембраной подключен к скользить по внешнему углу (PEN мембранные слайды). LCM колпачок помещают на Тон тканей и лазерная захвата ИК используется, чтобы расплавить крышку мембраны и закрепите ткань к LCM колпачок (шаг 1 и 2). Ультрафиолетовых лучей лазера затем используется, чтобы прорезать слайд мембраны и ткани (стадии 3 и 4), так что, когда крышка удалена ткань удаляется из ползуна и остается на LCM колпачок (этап 5).

Рисунок 3. Лазерная Захват микродиссекция Система Дорожная карта. Этот лазерный Capture микродиссекция система имеет пространство для 3 слайдов одновременно. Когда слайды загружаются в микроскоп, малое увеличение Дорожная карта изображения для каждого слайда создаются. Выбор области в рамках плана изображения перемещает окно живого изображения для этого региона. Для демонстрационных целей, средний мозг мыши разрезали на секции 10 мкм на 3 горками. Первый слайд была предназначена для Тирозингидроксилаза immunoreactiviти с помощью диаминобензидин как хромоген (A). Разделы были установлены либо на Силан-подготовительные слайдов (б) или PEN мембранных слайдов (C). Оба эти слайды были помечены с использованием быстрого флуоресцентного тирозин гидроксилазы иммуногистохимии. Стрелки в (С) указывает на присоединение мембраны пера на стекле. Нет ткани за пределами этой границы не могут быть собраны с LCM.

Рисунок 4. Использование лазера ИК съемки. Лазерная захвата ИК используется, чтобы растопить LCM колпачок мембраны для присоединения ткани в LCM колпачок и снимите его с остальной ткани. Лазерная захвата ИК должны быть достаточно прочными, чтобы растопить LCM колпачок мембраны достаточно связаться с основной ткани и предметное стекло. Изображение выше показывает, когда лазер был недостаточно, чтобы растопить мембранык слайду (осталось два пятна). Когда растаял мембрана соприкасается стекле, толстый черный контур можно наблюдать (нужное место). Интенсивность лазера может регулироваться изменением мощности (3-100 МВт), пульс (100-1,000,000 мкс) и # хитов лазера. Кроме того, повторяется стрельбы из ИК-лазера на том же месте может также дополнительно расплава мембрану. Целью ИК-лазера должна быть скорректирована в любое LCM крышка перемещается или когда задача изменилась. Шкала бар = 100 мкм.

Рисунок 5. Использование ультрафиолетовых лучей лазера. Лазерной резки УФ используется, чтобы прорваться через мембрану PEN и ткани. Перед использованием минимальную интенсивность, необходимую, чтобы прорваться через мембрану и ткань должна быть определить с УФ лазер может повредить ткань. Выше, три пятна (стрелки) разной интенсивности УФ лазерных показаны Размер левого место достаточно для 10 мкм секций, средней место для более толстых секций и в нужном месте, демонстрируя при интенсивности УФ-излучения, является слишком высокой. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6. Прямая изоляция Тирозингидроксилаза иммунореактивными нейронов с помощью ИК-лазера. Нейроны допамина показаны после быстрого флуоресцентного мечения для тирозингидроксилазы (A). Когда ИК лазера обжигают плавления LCM колпачок мембраны над этих нейронов (D), удаление колпачка выбирает эти клетки от ползуна (В, Е). Эти нейроны могут быть визуализированы в прикреплен к LCM колпачок (C, F). Шкала бар = 250 мкм.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" TARGET = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7. Прямая изоляция тирозин гидроксилазы иммунореактивных нейронов из-под пера мембранных слайдов с использованием ИК и УФ лазеры. Тирозингидроксилаза меченые нейроны показано выше (А). Эти нейроны могут быть прикреплены к LCM колпачок с помощью лазера ИК и вырезали из мембраны слайд PEN с помощью УФ-лазера (B). Масштабная линейка = 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 8. Косвенные изоляция вентральной области покрышки с использованием Тирозингидроксилаза иммунореактивности. расположение дофаминовых нейронов в вентральной области покрышки визуализировали в разделе с использованием стандартных методов иммуногистохимии (А и Е). Это иммуногистохимии помечены раздел был использован в качестве шаблона, чтобы найти вентральной области покрышки в неокрашенных соседних секций (В и F). Использование УФ-лазер, вентральной области покрышки был прикреплен к LCM колпачок с лазером ИК и вырезать из слайда с УФ-лазера (C и D) и показано, прикрепленной к крышке HS LCM (D). Вентральной области покрышки изолированы от Silane-Prep слайдов, используя только ИК-лазер Показано также, прикреплен к макро крышкой (ФК). Следует отметить, что более, чем одна попытка была необходима для сбора большей части ткани из этой области (ср G и J). Шкала бар = 500 мкм.pload / 52336 / 52336fig8large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

На качество 9. РНК. Типичные электрофореграммы и связанные с ними гель изображения коммерчески доступного всей РНК головного мозга (А) и РНК, выделенной из секций после фиксации ацетоном и LCM (б) или быстрого флуоресцентного тирозин гидроксилазы иммуногистохимии и LCM (C). Хотя качество РНК была снижена в разделах обработанных для иммуногистохимии, по сравнению с целой РНК головного мозга, что электрофореграммы показывают в основном интактной РНК на основе присутствии пиков рРНК S18 и S28. Всего концентрация РНК мозг был 6,487 пг / мкл с РИН 8,2. Ацетон фиксированной концентрации РНК ткань была 5,036 пг / мкл с РИН 2,6. РНК, полученной после иммуногистохимического ч Объявление концентрация 4,474 пг / мкл и Рин не был доступен.

10. Количество РНК. Чтобы определить количество РНК в нейронах, полученных с LCM, со стандартной кривой концентрации РНК получали, используя fluorospectrometer и Q-PCR. Для измерений fluorospectrometer (а), большой график показывает более высокую спектр РНК количествах и небольшой график показывает чувствительность этого анализа до 10 мкг / мкл. Концентрации РНК, полученные из 50, 100 и 200 дофамина нейронами был 17,3, 24,8 и 50,9 пг / мкл, соответственно. Использование Q-PCR для измерения количества РНК (В), концентрации РНК получают из 50, 100 и 200 дофамина нейронами было 3,55, 6,82 и 20,58 пг / мкл, соответственно.

ES / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg "/>
Рисунок 11. Концентрация допамина нейронами определенных генов с выделением отдельных нейронов допамина. Разница в C _{T (delta;} C _Т) между допамина нейронов конкретных генов (Nurr1, тирозингидроксилазы и переносчика дофамина) и β-актина в образцах дофаминовых нейронов в вентральной области покрышки изолированы LCM по сравнению с выражением в рассечений всей брюшной покрышки региона показано на рисунке. Поскольку нижняя С _Т значения генерируются с высокой концентрацией интересующего гена, уменьшение delta; C _T показывает повышенную экспрессию генов допамина нейронов относительно β-актина в других клетках (не дофаминергических нейронов и глиальных клеток) будет быть собраны в вентральной образцов покрышки площадь, которые экспрессируют β-актина, но не экспрессируют гены нейронов допамина.

Обсуждение

LCM является мощным средством для вскрытия отдельных популяций клеток или регионах ткани из тканевых срезов на предметном стекле и последующего выделения РНК, микроРНК, ДНК и белков. Использование LCM в комбинации с анализом с использованием высокой пропускной технологий, таких как микрочипов, следующего поколения РНК последовательности, эпигенетическом анализа ДНК и протеомики становится все более и более распространенным, как чувствительность этих методов улучшает и количество исходного материала, необходимое снижается ^8-12. С LCM, лучше анатомические разрешение достигается для образца, и понимание из последующих мер этих образцов значительно возрастает. Одно предостережение с LCM является то, что он обеспечивает концентрированный образец клеток, представляющих интерес, но не обязательно в чистой популяции клеток. Пределы точности означает, что будут какие-то загрязнения от соседних тканей. Тем не менее, этот метод делает сконцентрировать клетки, представляющие интересчтобы свести к минимуму эффекты, связанные с окружающей ткани и клетки, и максимизировать воздействие на экспериментальных клеток, представляющих интерес.

Прямая против косвенного иммуногистохимии

Поскольку LCM в настоящее время используется в основном для изоляции и измерения РНК РНК сохраняя нетронутыми является очень важным критерием. Поддержание целостности РНК основной причиной, по использованию косвенного иммуногистохимического вести рассечения тканей, что исключает необходимость пачкать ткань непосредственно, которые могут ухудшить РНК (Рисунок 10). При экспериментальной вопрос, однако, требуется выделение определенной популяции клеток, таких как нейроны допамина, прямой флуоресцентной иммуногистохимии требуется. Использование быстрого протокола иммуногистохимии маркировки может свести к минимуму деградацию РНК во время процедуры. Короткое время инкубации за счет использования высоких концентраций первичной и вторичной антиорганы, которые концентрации около 10-20 раз выше, чем то, что необходимо для обычного иммуногистохимического с 2 ч инкубации. Однако, если более длительные периоды инкубации требуется, Браун и Смит использовал высокие буферы солевые ингибировать деградацию РНК и получить хорошее качество РНК с длительным временем инкубации (до 20 ч) ^13. Этот подход также может быть использован, если существует значительное время, необходимое между маркировке ткани и получить доступ к системе LCM.

Выбор слайдов - PEN мембраны, Силан-подготовительные и без покрытия стеклах

Использование без покрытия стеклах для LCM были зарегистрированы ^14. В нашей лаборатории, силана преп-горки были найдены, чтобы быть оптимальным выбором, поскольку это покрытие придает достаточно ткани на слайде для иммуногистохимии без потери ткани, но все еще позволяет для прикрепления ткани к LCM колпачков и удаления из слайда , Без покрытия стеклышки естьпоказали некоторую потерю ткани с процедурой, иммуногистохимии. Если используется косвенное иммуногистохимии, однако, сохранение ткань становится менее важной проблемой. При правильном обезвоживания, захватив клеток или ткани выключения силаном подготовительные слайдов не было проблемой. Каждый из различных подходов к выделению нейронов или отделов головного мозга, описанных в этой статье имеет свои преимущества и недостатки. Для выделения отдельных нейронов допамина, использование силана преп-слайдов имеет преимущество более оптики и является менее дорогостоящим, чем мембраны слайдов пера. Недостатком является то, что иногда захватывая клетки может быть трудно, если недостаточно обезвоживание (см ниже), а некоторые ткани могут быть оставлены на слайде. Преимущество PEN мембран слайдов в том, что с помощью комбинации лазерного и ультрафиолетового лазера ИК гарантирует, что дофамин нейроны будут собраны. Если вы не заберете клеток из PEN мембранных слайдов почти никогда не происходит, так как он меньше зависит от обезвоживания, чем стеклах. Дополнительным преимуществом является то, что УФ лазер может быть использован, чтобы более точно аппроксимировать форму нейронов интерес, по сравнению с кругом для захвата нейронов офф стеклах с лазером ИК. Для выделения регионов ткани, мембранные горки PEN гораздо выше и оправдать дополнительные затраты. Такой подход приводит к полному удалению всех тканей вырезать на мембране, гораздо быстрее, чем захват большую площадь ткани с использованием ИК-лазера в одиночку и толстые срезы ткани могут быть собраны. Использование только лазер ИК требует, чтобы LCM колпачок мембраны полностью расплавляется по всей площади ткани. Кроме того, неполный сбор ткани характерно и обычно требуется несколько попыток. Хотя это занимает больше времени, чем выделение ткани из мембранного слайд PEN, если доступна ткани уже на предметное стекло или УФ-лазера отсутствует, это приемлемый вариант, поскольку большинство из ткани могут быть собраны (фиг 8J).

ove_content "> Основные этапы

100% этанола инкубации являются одним из наиболее важных стадий. Для того чтобы собрать клетки от Силан-преп слайдов полное обезвоживание ткани требуется. Таким образом, любой воды не удалены, который в основном связан с 100% этанола инкубации, будет воздействовать на способность подобрать клетки от слайдов. Для того, чтобы решить эту проблему, часто менять 100% этанола решения как поглощение воды из воздуха или передачи по сравнению с предыдущими стадиями промывки могут повлиять на обезвоживание. Кроме того, молекулярные сита используются, чтобы поглотить любое загрязнение воды. Система LCM в идеале должны быть расположены в небольшой комнате с осушителем для поддержания низкой влажности.

Хорошие участки криостатные имеют решающее значение для правильного LCM. Разделы должны быть плоскими складками в ткани сведена к минимуму. Складки ткани будет увеличить расстояние между LCM колпачок и предотвратить его от контактируя тон тканей. Затем он становится трудно в достаточной степени расплавления мембраны колпачок на ткани. Для стеклах, как правило, в разделе толщина должна быть между 6 и 12 мкм. Более толстые секции могут быть захвачены с мембраной слайдов пера.

LCM предлагает технического потенциала для обеспечения очень точные вскрытия ткани и клетки от микроскопа. Это значительно увеличивает разрешение дальнейшего анализа по сравнению с валовой рассечение тканей штук. Хотя, LCM может быть времени и труда, он не требует интенсивного обучения или опыта и, в сочетании с другими технологиями высокой пропускной, может значительно улучшить понимание биологического процесса, когда дискретные клетки или анатомические регионы используются.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veritas Laser Capture Microdissection System	Life Technologies, Grand Island, NY	Newer model is now sold
CapSure Macro LCM Caps	Life Technologies, Grand Island, NY	LCM0211
CapSure HS LCM Caps	Life Technologies, Grand Island, NY	LCM0213
PEN Membrane slides	Life Technologies, Grand Island, NY	s4651
Silane prep-slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Rnase Free Triton	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8787
Molecular Sieve	EDM Millipore, Billerica, MA	MX1583D
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies, Grand Island, NY	A-11008
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	G2939AA
Stratagene MX 3005P	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	401513
Nanodrop 3300 fluorospectrometer	Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen	Life Technologies, Grand Island, NY	R11490
RNaseZap	Life Technologies, Grand Island, NY	AM9780