Комплексная оценка зародышевой линии химической токсичности Использование нематоды<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Резюме

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Аннотация

Определение репродуктивную токсичность тысяч химических веществ, присутствующих в окружающей среде был одним из самых изысканных проблем в области гигиены окружающей среды. Это связано, в частности к нехватке модельных систем, которые могут (1) точно воспроизводят ключи особенности процессов размножения и (2) сделать это в средней и высокой пропускной образом, без необходимости большого числа позвоночных животных.

Здесь мы опишем метод количественного нематоды C. Элеганс, что позволяет быстро идентифицировать зародышевой линии токсикантов путем мониторинга индукцию анеуплоидных эмбрионов. Благодаря использованию в GFP репортер линии, ошибки в сегрегации хромосом в результате зародышевой линии разрушения легко визуализировать и количественно с помощью автоматизированной флуоресцентной микроскопии. Таким образом, скрининг определенного набора соединений для его токсичности могут быть выполнены в виде пластины с 96- до 384-а в течение нескольких дней. Вторичный анализ положительного чего можно выполнить, чтобы определить, является ли возникла хромосомных аномалий от мейоза нарушения или ранних эмбриональных ошибок хромосом. В целом, этот анализ представляет собой быстрый стратегию первого прохода для быстрой оценки зародышевой линии дисфункции следующей химического воздействия.

Введение

Есть около 87000 химических веществ, зарегистрированные для торговли в Соединенных Штатах, но только небольшое количество из них были протестированы для потенциальных последствий для здоровья ^1. Из тех, что были проверены, только часть была оценена для эффектов репродуктивного здоровья, отчасти из-за трудностей в определении изменения ранних репродуктивных событий у млекопитающих, особенно во время развития женского зародышевых клеток и дифференцировки. В самом деле, первого мейотического события происходят во время ранней стадии эмбрионального развития у самок млекопитающих, и, таким образом, трудно получить доступ и собрать в числах, пригодных для целей скрининга.

Зародышевой линии обеспечивает важную связь между поколениями, и ее соответствующая функция зависит от четкое исполнение сложной программы клеточного и хромосомного деления называется мейоза. Нарушение регуляции мейоза процесса может привести к снижению рождаемости и производствагамет и эмбрионов с аномальной числа хромосом, состояние называется анеуплоидии. Хромосомные ошибки сегрегации в мейозе являются весьма актуальными для здоровья человека. Хромосомные аномалии являются общими, с частотой 1 случай на 150 живорожденных, трисомии 21, 18 и 13, а также X и Y ошибок хромосом, являющихся наиболее распространенных типов ^2,3. Кроме того, врожденные пороки развития, в том числе хромосомных происхождения, являются ведущей причиной смерти младенцев в США ⁴ мысль, что влияние окружающей среды может повлиять на хромосомный сегрегации и поведение не является новой ^5, но все еще ​​плохо изучены. Поэтому очень важно исследовать, какие из химических веществ, внесенных в нашей среде мешают человеческого плодородия, раннего развития и общего репродуктивного здоровья.

В свете этих ограничений моделей млекопитающих, мы разработали экраном анализа с высокой пропускной испытать токсическое действие на репродуктивную аскариды C. Элеганс. Мы мобилизовали несколько важных особенностей, предлагаемых этой широко используется генетическая модель системы, такие как ее небольшой размер, низкая стоимость, короткий цикл воспроизводства, высокой долей половых клеток и легкости манипуляции ^6. Черви могут быть выращены в 96-луночных планшетах или в высоких жидких культурах объемом и из-за их прозрачности может быть непосредственно отображается на пластинах для обнаружения флуоресцентных репортеров. Анализ, описанный ниже пользуется этими характеристиками и использует червя штамма, содержащего люминесцентные репортером Pxol-1 :: GFP для определения зародышевой линии нарушения и индукцию эмбрионального анеуплоидии.

Использование этого репортера деформации на основе, как правило редком возникновении мужчин в основном гермафродитов населения червя. Эти мужчины (<0,2%), естественно, происходят от ошибок в сегрегации в Х-хромосоме ^7. Однако, как нарушение зародышевой линии часто приводит к ошибкам в сегрегации аутосоми heterochromosomes, коррелируется как с повышенной заболеваемости мужчин фенотипа (X missegregation), а также эмбриональной летальности (аутосомно missegregation). Для легко обнаружить индукцию мужчин в обход проблемы эмбриональной летальности, мужчина-промотор (XOL-1) используется для управления экспрессией GFP у ранних эмбрионов еще, содержащихся в матку червя. Таким образом, появление GFP-экспрессирующих эмбрионов используется в качестве посредника для присутствии анеуплоидных эмбрионов. Этот метод был ранее использован для идентификации генов, участвующих в обеспечении зародышевой линии и мейоза ^8,9. Адаптированный к химической скрининга, этот штамм используется в среде с экрана с высокой пропускной способностью. Важно отметить, что штамм верно сообщает aneugenicity химических веществ и, следовательно, отношение к млекопитающих репродуктивных конечных точек ^10. Анализ, описанный здесь будет особенно полезно токсикологов в фармацевтической и химической промышленности настроек ищутбыстро оценить токсичности химических веществ в области репродуктивного конечных точек. Кроме того, этот анализ полностью присоединяется с государственными приоритетами, выделенных в токсичности в докладе века ^{21-го 11.}

протокол

1. Подготовка Кормление бактерий

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается подготовка кормления бактерий (штамм E.coli OP50).

1. Изолировать единственная колония E. Штамм OP50 из лизогении бульона (LB) агаром и асептически инокуляции в 300 мл автоклавного LB бульоне.
2. Дайте инокулировали культурой расти в течение ночи в вибраторе при 200 оборотах в минуту и ​​37 ° C, до насыщения пока не будет достигнута.
3. Передача OP50 в 6 стерильных, предварительно взвешенных 50 мл конические пробирки. Гранул бактерий центрифугированием в течение 5 мин при 6000 оборотов в минуту (5000 мкг).
4. Удалите супернатант и мыть бактерии с 50 мл стерильного M9. Повторите дважды.
5. После второй промывки удаления оставшейся M9, чтобы ни М9 не осталось в трубке.
6. Определить вес таблетки с весом трубки, содержащей бактерии гранул и вычесть вес 50 мл коническую трубку.
7. Ресуспендируют гранул Iп М9 при концентрации 100 мг / мл.
8. Хранить OP50 раствора при 4 ° С, пока не будет использован для червячного культуры.

2. Подготовка нематоды роста средних пластин (NGM) Петри

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается подготовка NGM чашках Петри, которые являются пластины, где С. Элеганс червей обычно поддерживается в лаборатории.

1. Автоклав агара среду NGM.
2. Используя стерильные процедуры, обойтись 17 мл NGM раствора агара в 6 см чашки Петри с помощью перистальтического насоса.
   Примечание: постоянное количество агара в пластинах уменьшает потребность в переориентации микроскоп при переключении с одной пластины на другую.
3. Оставьте пластин при комнатной температуре в течение 2-3 дней перед использованием, чтобы агар затвердеть и позволяют избыток влаги испаряться.
4. Семенной пластин NGM с помощью метода стерилизации. Нанесите 1-2 капли OP50 жидкой культуры и распространяется, используя стеклянную палочку. Убедитесь, что нераспространять газон бактерий всю дорогу к краям пластин.
5. Дайте OP50 газон расти в течение 1-2 дней при комнатной температуре перед использованием пластин расти червей.

3. Подготовка синхронного Worm населения

ПРИМЕЧАНИЕ: жизненный цикл C. Элеганс состоит из эмбриональной стадии, четыре личиночные стадии (L1-L4) и в зрелом возрасте. В этом разделе описывается подготовка возрастной синхронного населения червей. Все материалы, контактирующие с C.elegans после лечения отбеливателя должны быть стерильными.

1. День 1 - Подготовка беременных Worm населения
   1. Используйте NGM пластин, в которых большинство населения червя состоит из голодали личинок L1.
   2. Сбор Личинки L1 стерилизованной червя выбрать и перенести их на свежие 6 см NGM пластин затравку OP50. Инкубируют в течение примерно 65 ч при 20 ° С до тех пор, большинство червей не беременные взрослых. Дляизбежать пластины переполненности тюрем и позволяют черви расти, не истощая бактерий, не передавать более чем один или два скопления L1 личинок каждым новым NGM пластины.
2. День 4 - Создание Синхронное L1 личинок населения
   1. Сбор беременной червей из пластин NGM, вымойте их с 1-2 мл M9 и передавать их в конической трубе 15 мл.
   2. Пусть беременной черви осадок на дно в 15 мл коническую пробирку в течение примерно 5-10 мин. Удалить супернатант, не нарушая червя гранул.
   3. Передача червя гранул 2-4 микропробирок и добавить 1 мл отбеливателя / раствора гидроксида натрия. Инкубируют в течение 2-3 мин при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции под стереоскопическим чтобы подтвердить все черви умерли. Не отбеливать больше, чем 5 минут, как эмбрионы могут погибнуть.
   4. Сбор червей путем центрифугирования в течение 1 мин при 3000 оборотов в минуту (900 мкг). Удалить супернатант и добавить 1 мл стерильной M9 снейтрализовать реакцию.
   5. Промыть червей в два раза центрифугированием в течение 1 мин при 3000 оборотов в минуту (900 мкг).
   6. Удалить супернатант и добавить M9, чтобы до 100-200 мкл.
   7. Использование стекла пипетки Пастера добавить каплю червя / M9 смешать, чтобы очистить NGM пластины и инкубировать их в течение по крайней мере 24 часов при 20 ° С, чтобы эмбрионы в люк.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Без еды рост личинок будет остановлен на стадии L1.
3. День 5 - Создание Синхронное L4 личинок населения
   1. Сбор личинок L1 от четких NGM пластин путем промывки пластин с 1-2 мл M9 и передавать их в конической трубе 15 мл.
   2. Пусть мертвые взрослых червей осадок на дне 15 мл коническую трубку в течение примерно 5 мин.
   3. Сбор супернатант, где черви L1, в новом коническая 15 мл пробирку и осадить червей путем центрифугирования в течение 2 мин при 2600 оборотов в минуту (1000 XG).
   4. Удалить супернатант леaving примерно 500 мкл.
   5. Определить концентрацию червей в растворе М9 путем подсчета количества червей в 10 мкл капли использованием стереомикроскопа. Количество по меньшей мере, 5 капель.
   6. Отрегулируйте концентрацию червей до 20-25 экз / мкл и добавить 50 мкл Worm / M9 смеси, чтобы NGM пластин, посеянных с OP50.
   7. Выдержите в течение 65 ч при 15 ° С (для инкубации через выходные), чтобы синхронизированной население L1 расти, пока они не достигнут стадии L4.

4. Воздействие червей химических веществ в 96-луночных

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается использование Pxol1 :: GFP транскрипции репортера, содержащий С Штамм Элеганс для выявления индукции анеуплоидии.

1. Сбор личинок L4 с ясного NGM пластин путем промывки пластин с 1-2 мл M9 и передавать их в конической трубе 15 мл.
2. Пусть L4 червей осадок на дно15 мл коническую трубку в течение примерно 5-10 мин. Удалить супернатант, не нарушая червя гранул.
3. Добавить 3-5 мл M9 и определить концентрацию червей в растворе М9 путем подсчета количества червей в 10 мкл капли использованием стереомикроскопа. Количество по меньшей мере, 5 капель для каждого образца.
4. Ресуспендируют червей в концентрации 1000 червей / мл в М9.
5. Развести OP50 бактерий из раздела 1, в 10 раз с M9. Убедитесь в том, ресуспендированные бактерии до комнатной температуры, потому что низкая температура влияет на развитие червя.
6. Используя многоканальную пипетку, сначала добавьте 100 мкл Worm / M9 смеси (со стадии 4.4), а затем добавить 400 мкл разбавленных OP50 бактерий (из шага 4.5) в каждую лунку 2 мл глубокой круглым дном 96-луночного планшета. В конце концов, каждый хорошо будет 100 червей в 500 мкл.
7. Добавить 0,5 мкл либо исследуемого вещества или соответствующего управления с желаемыми скважин, чтобы достичь предлагаемый окончательный Концция 100 мкМ, концентрация, обычно используемый в химических экранов в С Элеганс ^12. Защиту этанол или ДМСО управления растворителе при конечной концентрации 0,1%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать нокодазолом (100 мкм) в качестве положительного контроля.
8. Печать пластины с помощью клейкой пленки. Будьте уверены, чтобы запечатать пластины также для предотвращения перекрестного загрязнения между скважинами.
9. Оберните пластину с алюминиевой фольгой.
10. Трансфер пластину шейкер (170-180 оборотов в минуту) соответствующей температуре в течение подходящего периода времени (24 или 65 ч). Температура в помещении влияет на рост червей; поддерживать температуру около 20 ° С.

Приобретение 5. Изображение беременной червей в 384-луночного планшета

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается использование высокой микроскопом содержимого, чтобы изображение подвергается Pxol1 :: GFP червей, визуализировать выражение GFP в эмбрионах в матке взрослых гермафродитов. Длякаждый 384-луночный планшет для скрининга, использовать червей из 4 х 96-луночных планшетах.

1. После химического воздействия в шейкере, пусть пластина Остальные 96-луночный в течение 10-15 мин, чтобы позволить взрослых червей для осаждения на дно тарелки.
2. Используя многоканальную пипетку, удалите 350 мкл M9, будучи очень осторожным, чтобы не беспокоить червей в нижней части плиты.
3. Вымойте червей с 1 мл M9 и повторите шаг 5,1.
4. Используя многоканальную пипетку, удалить 1 мл M9, будучи Вэй осторожность, чтобы не мешать червей в нижней части пластины.
5. Используя многоканальную пипетку, ресуспендируйте червей в оставшейся M9 и собирать 100 мкл Worm / M9 смеси из 96-луночных планшетах в и загрузить его в лунки черных стен / прозрачным дном 384-луночного планшета. Повторите процесс с использованием червей из 4 х 96-луночных планшетах, пока все лунки 384-луночного планшета не были загружены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно для всех скважин, чтобы иметь тот же объем, чтобы увеличитьэффективность и скорость автофокусировки в процессе захвата изображений. Каждый колодец должен содержать от 80 до 100 червей.
6. Добавить 1 мкл левамизол (100 мкм) в каждую лунку и пусть черви инкубировать в течение примерно 30 мин.
   Примечание: Левамизол действует как агонист рецепторов ацетилхолина и удерживает червей.
7. Передача пластины к широким полем зрения высокой микроскопом содержимому, способной обеспечить автоматизированное изображений.
8. Для получения изображения, используйте высоким содержанием сбора и анализа изображений программное обеспечение в соответствии с руководящими принципами производителя. Выберите цель 4X приобрести 1 изображение на лунку.
9. Перед началом захвата изображения, настроить параметры изображения GFP в 45 мс воздействия изображения и разрешение 2160 х 2160.
10. Сбор данных как количество GFP позитивных червей, деленное на общее число червей в скважине, последний показатель является относительно постоянной между скважинами.

Результаты

Воздействие на Pxol-1 :: GFP репортер напряжения к воздействию химических веществ, таких как микротрубочки яда нокодазолом (фиг.1) приводит к индукции высокой долей GFP-экспрессирующих эмбрионов в полость матки, подверженных взрослых гермафродитов по сравнению с контролем ДМСО...

Обсуждение

Метод, описанный здесь, является первой большой стратегии масштаба для идентификации зародышевой линии токсикантов. Это требует использования в GFP трансгенных Pxol-1 :: GFP, содержащий штамм, который верой и правдой сообщает индукцию анеуплоидии у ранних эмбрионов, который использует?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Vented, sharp edge Petri dishes	Tritech	T3315
Agar	Apex	20-274
Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate	Corning	P-DW-20-C-S
Bactopeptone	Apex	20-261
Bacto-tryptone	Fisher Scientific	BP1421-2
Bleach	Clorox
Calcium chloride (CaCl2)	VWR	AA12316-A1
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138225
DMSO	VWR	IC19018680
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Ethanol 200 proof	VWR	EM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 well plates	Sigma-Aldrich	M1937-32EA
ImageXpress Micro XLS System	Molecular Devices
Levamisole hydrochloride	Fluka	31742
Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4)	VWR	97061-438
MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software	Molecular Devices
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Rayon films for biological cultures	VWR	60941-086
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	VWR	BDH0316
Stereomicroscope	Nikon	SMZ 745	This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Yeast extract	Becton Dickinson	212750