Экс Utero электропорации и Органотипической фрагмент Культура мыши ткани гиппокампа

Резюме

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Аннотация

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Введение

Гиппокамп играет важную роль в памяти и обучения, а также эмоциональное поведение. Один основная функция состоит в консолидации кратковременной памяти в долговременную память, которая требует высокой пластичности нервной системы. Зубчатая извилина гиппокампа выступает в качестве основного шлюза для ввода информации, а также один из двух областей мозга с постоянной нейрогенеза в течение взрослой жизни ^1,2. Развитие гиппокампа структуры происходит во время позднего эмбриогенеза и особенно в течение первого 3 до 4 недель послеродового ^3. Во время раннего развития зубчатой ​​извилине пул стволовых клеток, учрежденного требуется для послеродового а также нейрогенез ^4. Развивающиеся нейроны пройти через различные этапы, из стволовой клетки через несколько этапов клеток-предшественников в незрелые и, наконец, зрелого нейрона во время послеродового а также нейрогенез. На разных этапах нейрогенеза экспрессияспецифические гены требуется, чтобы созревание и интеграции новых нейронов в гиппокампе схемы ^5,6.

Использование генетику мыши и анализ фенотипа с помощью иммуногистохимии, а также молекулярные методы позволили определить характер экспрессии и функции многих из этих генов. В дополнение анализа микрочипов, а также иммунопреципитации хроматина (чип) представил информацию о потенциальных прямых и косвенных генов-мишеней ^7,8. Тем не менее, есть еще много открытых вопросов, касающихся механизмов регуляции гиппокампа развития, в частности развития зубчатой ​​извилины. Чтобы получить более глубокое представление, как специфические гены регулируются систему требуется позволяя манипулировать небольшим количеством клеток ВНИЗ или повышающей регуляции гена интереса и / или его генов-мишеней и следить за их судьбу во время разработки. Внутриутробное электропорации из shRNAs, кДНК генов интересов или Cre рекомбинацииSE обеспечивает такой инструмент. В целях обеспечения присутствия плазмиды экспрессии нужной ДНК или малых РНК должны использоваться для электропорации. Этот подход очень успешно применяется в изучении развития коры ^9,10, но более сложные подходы, изучения развития зубчатой ​​извилине из-за позиции гиппокампа структур в более глубоких слоях мозга.

Экс маточно электропорации с последующим органотипической культуры среза, является одним из подходов, чтобы обойти эту проблему ^11,12. В отличие от внутриутробного электропорации не весь эмбриона, но только головка используется позволяя таким образом, чтобы поместить электроды в более выгодном образом, чтобы направить shRNA / ДНК в сторону гиппокампа и зубчатой ​​извилины. Наша группа успешно применяются экс внутриутробно электропорации для изучения роли фактора транскрипции Bcl11b во зубчатой ​​развития извилины ^8. Bcl11b имеет двойную роль в зубчатой ​​извилине развития на гegulating пролиферацию клеток-предшественников, а также дифференцировку как было показано с помощью иммуногистохимии. Для дальнейшего определения механизма участия Bcl11b в этих процессах, протоколы группы Polleux ^11,12 доводили до изучения зубчатой ​​извилине, как описано ниже в разделе протокола. В первом приближении вопрос был рассмотрен Bcl11b регулирует ли нейронов дифференциации клеток клеточно автономно. Второй подход рассматривается ли Desmoplakin, непосредственным объектом ген Bcl11b, достаточно, чтобы спасти фенотип Bcl11b.

протокол

Примечание: Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с немецким законом и были одобрены правительственных учреждений в Тюбингене.

1. Подготовка Дозаторы, растворов и мембран

1. Подготовка микропипеток
   1. Потяните стеклянной микропипетки с помощью микропипетки съемник со следующей программой: Жара: 540, Pull: 125, Скорость: 20 и задержку: 140. Длина иглы суммы на 5,5 см.
   2. Конические иглы с использованием microgrinder, чтобы получить соответствующий размер наконечника 4 мм. Храните иголки в коробку или 15 см чашку Петри, чтобы предотвратить повреждение кончиков.
2. Приготовление растворов
   1. ДНК плазмиды решение
      1. Подготовка плазмидной ДНК, содержащей нужную кДНК конструкцию, используя бесплатный Maxi-Prep Kit эндотоксина в соответствии с протоколом производителя.
      2. Регулировка раствора плазмиды ДНК в конечной концентрации 3 мкг / мкл (без GFP шип вектор) или 4 мкг /мкл (1 мкг GFP шип вектор) в эндотоксинов Трис-буфер, содержащий ЭДТА Fast Green (конечная концентрация 0,05%).
   2. Ламинин Stock решение
      1. Растворите 1 мг ламинина в стерильной воде до конечного объема 1 мл. Подготовьте 100 мкл аликвоты и хранят при температуре -80 ° С.
   3. Поли-L-лизин Исходный раствор
      1. Растворите 50 мг поли-L-лизина в 50 мл стерильной воды до конечной концентрации 1 мг / мл. Подготовка 1 мл аликвоты и хранить в -20 ° C.
   4. Заполните сбалансированный солевой раствор Хэнка (полный HBSS)
      1. Подготовьте полный HBSS путем объединения 100 мл 10x HBSS, 2,5 мл 1 М HEPES-буфера (рН 7,4), 30 мл 1 М D-глюкозы, 10 мл 100 мМ CaCl _2, 10 мл 100 мМ MgSO _4, и четыре мл 1 M NaHCO _3. Добавить стерильной водой до 1 л и хранят при температуре 4 ° С.
         Примечание: все решения Автоклав ожидать 1 М HEPES-буфера и 1 М D-глюкоза, которые являются филтер стерилизации.
   5. Кусочек культуральной среде
      1. Подготовка ломтик культуральную среду путем добавления 35 мл базальной среды Eagle, 12,9 мл полной HBSS (1.2.4), 1,35 мл 1 М D-глюкозы, 250 мкл 200 мМ L-глутамина и 500 мкл пенициллина-стрептомицина, чтобы получения конечного объема 50 мл. Добавить лошадиной сыворотки до конечной концентрации 5% и хранят при температуре 4 ° С.
   6. Low-Точка плавления (LMP) Агароза
      1. Подготовка 4% раствора агарозы LMP добавлением 2 г LMP агарозы с 50 мл полного HBSS (1.2.4) с последующим нагреванием в микроволновой печи в течение 1-2 мин при высокой мощности. Хранить этот раствор в водяной бане при 37 - 39 ° С. Хранить раствор при температуре 4 ° С и повторного использования.
   7. Параформальдегид Решение
      1. В вытяжном шкафу подготовить 4% параформальдегида (PFA) раствор добавлением 4 г параформальдегида в 100 мл 1х PBS. Раствор нагревают до 60 ° С и добавить несколько капель 1 н NaOH, пока раствор станет CЛир.
   8. Пермеабилизирующего Решение
      1. Растворите 9 г BSA в 300 мл 1х PBS, содержащим 0,3% Trition Х-100 и хранят при температуре 4 ° С. Добавить 10% азида натрия для длительного хранения.
3. Покрытие мембранных вставками
   1. Развести одну аликвоту исходного раствора ламинин (1.2.2) и одну аликвоту поли-L-лизин раствора (1.2.3) в стерильной воде до конечного объема 12 мл.
   2. Поместите мембранные вставки в 6-луночные планшеты с каждой лунке, содержащей 2 мл стерильной воды. Добавить 1 мл раствора для нанесения покрытия на верхней части мембраны и инкубируют O / N при 37 ° С в 5% СО ₂ инкубаторе.
   3. После инкубации промыть мембраны вставляет три раза 1 мл стерильной воды и высушить. Используйте покрытием мембранные вставки на тот же день или магазин при 4 ° С на срок до четырех недель в сухом 6-луночного планшета.

2. Инъекции ДНК и Электропорация E15.5 и E18.5 эмбрионов

1. Обезболить время повязана у самок мышей, поместив его в обезболивающим камере, насыщенной 5% ИФ и подключенного в испаритель. Циркуляцию изофлуран и кислород со скоростью 1 л / мин. Держите животное в коробке в течение 2-4 мин или до потери сознания, которое испытывает ущемление между лапами мыши.
2. Эвтаназии бессознательное мышь, шейки дислокации на день эмбрионального развития (E) 15,5 или 18,5. Проанализируйте матку, содержащий эмбрионов ¹³ и поместить его в чашку Петри, содержащую 15-20 мл холодной полного HBSS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента, держите эмбрионов и тканей на льду.
3. Используйте ножницы, чтобы отделить каждый эмбрион от рога матки и место во второй чашке Петри с холодными полный HBSS.
4. Под микроскопом рассекает, разорвать стенку матки мышечной и плаценты с помощью пинцета (# 55) и ножницы. Осторожно освободите эмбриона, из желточного мешка.
5. Используйте пару Бонн ножницами, чтобы decapitatе эмбрионы чуть выше передних под углом 60 °. Если эксперимент требует генотипирование эмбрионов, собрать образец ткани для изоляции геномной ДНК (небольшой кусочек хвоста).
6. Передача голову чистой и сухой чашке Петри. Потому что голова была обезглавлена ​​в угол 60 °, голова должна наклоняться в одну сторону при размещении спинной стороной вверх.
7. Поместите иглу тщательно в середине полушарии, близкой к темени (рис 1а, б). Вводят приблизительно 2-3 мкл (на 3 или 4 мкг / мкл) раствора ДНК, наступив на педали в picospritzer III с использованием 30 фунтов давления на протяжении 10-15 мс на импульс, применяя 5-8 импульсов. Продолжительность и количество импульсов зависит от диаметра отверстия иглы с небольших отверстий, требующих больше времени. Интервал между каждым импульсом составляет 1 сек.
8. Перед размещением электродов, применять несколько капель полного HBSS на голове EMBRлет. Поместите электроды таким образом, что "отрицательное" терминал находится на той же стороне, что и введенного желудочка и "положительного" электрода на противоположной стороне впрыскиваемого желудочка ниже уха головы эмбриона (фиг 1С, D). Применить 5 импульсов 50 В.
   1. Используйте 3 мм электроды для E 15,5 и 5 мм Электроды Е 18.5.

3. Вскрытие мозга

1. После электропорации, снимите кожу от головы с помощью пинцета. Используя пару пружинных ножниц сделать небольшой разрез в середине мозжечка на средней линии черепа.
2. Вставьте пружинные ножницы в разрез и вырезать в продольном направлении вдоль стреловидного шва. Лупиться череп и отсоедините мозг от черепа с помощью тонких щипцов. Перевести весь мозг в 15-20 мл холодной полного решения HBSS.
3. Между тем, влить 4% LMP агарозы,выдерживали при 37-39 ° С на водяной бане, в отслаиванию вдали формы.
4. Возьмите мозг из полного HBSS небольшой совок шпателем и слейте избыток ССРХ с помощью тонкой папиросной бумаги или Kimwipes.
5. Поместите весь мозг мягко в агарозы и отрегулируйте ее положение с помощью тонкой иглы. Держать форму на льду до тех пор, пока агарозном затвердевает и блок срезы (для корональных секций обонятельные луковицы указывают вверх).

4. Vibratome секционирования и нарезать Культура

1. Обрезать агарозном блоки LMP и приклейте их к сцене образца с использованием «супер клей". После клей высохнет передачи стадии образца в буферном лоток vibratome и залить охлажденным льдом HBSS до завершения блок не погружен в раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизовать все инструменты и оборудование поверхностей с 70% этанола до секционирования.
2. Подготовка 250 мкм разделы vibratome использованием нового диска, как следует.
   1. Обрезать блок Wiго следующих условиях; Частота - 60 Гц, амплитуда - 0,7 мкм, скорость 16-18 мм / сек. Вырезать разделы, содержащие нужную ткань с вышеуказанными настройками на замедленной скорости (9 мм / сек). Запуск срезов от заднего мозга, собирать 5-7 части из головного мозга.
   2. Передача участков с чистой культуральной чашке 6 а, содержащего 5 мл охлажденного льдом HBSS завершить с помощью изогнутого шпателя и держать на льду, пока все секции собраны (фиг 1E).
3. Смочите мембраны в поперечном моды с 100 мкл полной ССРХ до размещения секций на мембране, чтобы облегчить ориентацию разделах.
4. Передача участков с помощью изогнутого шпателя на мембране (подобрать угол разделе пинцетом и вытащить на шпателем, а затем использовать пинцет, чтобы нажать на раздел на мембране). Поместите до пяти разделов на одной мембраны и организовать с помощью щипцов (рис 1F). Не перекрывать секции друг с другом.
   1. Возьмите избыток ССРХ от мембраны использованием пипетки. Конкретные Мембраны, используемые здесь, прикреплены к раме и вставляется в планшет для тканевых культур, что позволяет ткани, чтобы быть в контакте, но не покрыт продуктом.
5. Поместите мембранные вставки в 6-луночный планшет, содержащий 1,8 мл культуральной среды срез (1.2.5) (рис 1G, H). Инкубируют культуры блюдо при 37 ° С с 5% СО ₂ в течение 11 DIV или 14 DIV. Изменить половину среды (0,9 мл) каждый второй день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, добавляйте реагенты, как бромдезоксиуридин (ВДУ; 10 мкМ конечная концентрация) для маркировки пролиферирующих клеток в средствах массовой информации в течение первых 20 ч от времени культивирования.

5. Фиксация секций Вслед за иммунофлюоресцентного окрашивания

1. Используйте чистую и резкое лезвие скальпеля вырезать и обрезать мембраны в зависимости от ориентацииразделы.
2. Передача участков вместе с мембраной в 24-луночный планшет, содержащий 1 мл 4% PFA (1.2.7). Инкубируйте разделы в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим промыванием 3 1x PBS в течение 15 мин каждый. Инкубируйте секций O / N с пермеабилизации растворе при 4 ° С при осторожном перемешивании.
3. На следующий день, инкубировать секций с соответствующими первичными антителами, разводили в пермеабилизации раствора, O / N или в течение 48 ч при 4 ° С при осторожном перемешивании.
4. Вымойте разделах 3 раза в течение 15 мин с 1x PBS и инкубировать O / N при 4 ° С с соответствующими вторичными антителами разводят в пермеабилизации решения.
5. После инкубации с вторичными антителами, мыть секций один раз 1x PBS в течение 15 мин с последующим окрашиванием DAPI в течение 10 мин.
6. Вымойте разделах 3 раза 1x PBS в течение 15 минут каждый и трансфер в микроскоп слайды. Добавить ImmunoMount и осторожно поместить покровное в верхней части секций. Высушите слайды O / N при 4 ° С и селенааль лаком для ногтей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите слайды всегда при 4 ° С.
   1. Проанализируйте срез культуры от конфокальной микроскопии (рис 1I).

Результаты

Удаление фактора транскрипции Bcl11b вызывает ухудшение пролиферации клеток-предшественников и нейрональной дифференцировки приводит к снижению зубчатой ​​извилины размера и количества клеток. Кроме того мутантные нейроны не интегрироваться в гиппокампе схемы, вызывая обучения и ух...

Обсуждение

Гиппокамп играет важную роль в процессах обучения и памяти. Зубчатая извилина также является одним из двух областей мозга, где нейрогенез происходит не только во время разработки, но и во всей взрослой жизни. Послеродовая и взрослых гиппокампа нейрогенеза происходит в аналогичным обр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flaming/ Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments Company (USA)	P-97
Fine Glass Pipettes	Warner Instruments	G100F-4
Microgrinder	Narishige, Japan	EG-44
Anesthetic Bracket unit	Harvard Apparatus	PY2 34-0412
Halovet Vaporizer	Harvard Apparatus	PY2 34-0398
Fluovac System	Harvard Apparatus	PY2 34-0387
IMS Fluosorber	Harvard Apparatus	PY2 34-0415
Anesthetizing Chamber	Harvard Apparatus	PY2 34-0460
Electroporator	BEX Company	CUY21 EDIT
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P3	3 mm electrodes for E15.5
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P5	5 mm electrodes for E18.5
Picospritzer III	Parker Hannifin Corporation	P/N 052-0500-900
HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V	Thermo Scientific	920120
Dissection Microscope	Carl Zeiss Microscopy Gmbh	Stemi SV8
Inverted Microscope	Leica	Leica DM IL LED
Confocal Microscope	Leica	Sp5II
6 well dish	BD Falcon	#353502
6 well dish	CELLSTAR	#657160
Tissue culture inserts	BD Falcon	#353090
Fast Green	Sigma	F7252
Laminin	Sigma	#L2020
Poly-L-lysine	Sigma	#P5899
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Forceps	Dumont #55	11255-20 Inox
HBSS 10x	Life Technology	14180-046
BME	Life Technology	41010-26