Долгосрочный мониторинг Непрерывный ЭЭГ в малых грызунов Модели заболеваний человека с использованием системы Эпоха беспроводной передатчик

Резюме

Here we demonstrate the use of a wireless enabling technology for electroencephalogram (EEG) in neonatal rodent models of human disease. With telemetry, there are no encumbering connections, thus allowing natural behaviors.

Аннотация

Многие прогрессивные неврологические заболевания у человека, такие как эпилепсия, требуют доклинические модели животных, которые медленно развиваются болезни для того, чтобы проверить вмешательства на различных стадиях патологического процесса. Эти модели животных особенно трудно реализовать в незрелых грызунов, классическая модель организм лабораторного исследования этих нарушений. Запись непрерывной ЭЭГ у молодых животных моделях судорог и других неврологических расстройств представляет сложную техническую задачу из-за небольшого физического размера молодых грызунов и их зависимость от плотины до отъема. Таким образом, существует не только явная необходимость в улучшении доклинических исследований, которые будут лучше определить те методы лечения, подходящие для перевода в клинику, но и необходимость для новых устройств, способных записи ЭЭГ непрерывный незрелых грызунов. Здесь мы опишем технологию позади и продемонстрировать использование нового миниатюрного телеметрической системы, специально спроектированный для использования в незрелых крыс оR мышей, которые также эффективны для применения у взрослых животных.

Введение

Старейший - и до сих пор наиболее широко используется - техника для записи биопотенциалов в мозгу электроэнцефалограмма (ЭЭГ). Он используется в клинике для неврологических нарушений, в том числе выявления судорожной ^1, локализации эпилептического фокуса ² и диагностики сотрясения ^3,4. Этот метод также широко используется для обеспечения фундаментальную информацию о механизмах сна и диагностики расстройств сна ^5,6.

Как и в клинической диагностике эпилепсии, ЭЭГ стал незаменимым для трансляционных исследований на животных моделях, так и приобретенной генетической эпилепсии. В современных научных приложений, "проводной" или "привязанные" записи являются стандартными, и регулярно проводится у взрослых грызунов в течение нескольких недель, в то время ^7. Тем не менее, электрические помехи, артефакты движения, и риск того, что привязал животных будет травмировать себя, потянув за кабель длинные COMPRomised эти эксперименты. Таким образом, для улучшения условий эксперимента и процент успеха, мы должны развивать новые технологии, которые позволили бы ликвидации проводного интерфейса между животным и приборов. Наиболее очевидным направлением развития является разработка и внедрение систем телеметрии, что позволяет для высококачественных записей, сохраняя длительный срок службы и свести к минимуму дискомфорт для субъектов животных. Сокращение физический размер этих устройств позволит трансляционные исследования в неонатальных и несовершеннолетних моделей грызунов неврологических расстройств.

Низкие канала подсчета ЭЭГ крыс широко используются для разработки новых методов лечения, чтобы подавить эпилептические припадки способны перевод для человека. Записи из одного или нескольких сайтов в течение длительного периода открыть много возможностей для использования моделях грызунов эпилепсии у поступательного исследования. Большая часть современных исследований в этой области направлена ​​на блокировать возникновение хронической SeizОЭС или развитие эпилепсии (т.е. эпилептогенез), и такие научно-исследовательские работы требуют обширной, если не постоянный мониторинг ЭЭГ для анализа эффективности предлагаемой терапии ^8; маленький, простой, телеметрическая система с одной, двумя или четырьмя каналами, работающими между 0,1-100 Гц на канал будет сильно способствовать этот тип трансляционных исследований. Электрографические приступы часто происходят с минимальными поведения (конечно, без судорог), что ограничивает полезность анализа на основе поведенческих судорог. Стратегия объединения запись ЭЭГ и синхронный видеомониторинг позволяет возможность захвата каждый захват; и, кроме того, эти аналитические подходы могут позволить количественную оценку интериктальных шипами, которые происходят в мозге эпилептического между "иктальных" (или захват) событий ^9. Кроме того, возможность получения непрерывного высокого качества с низким уровнем артефактов ЭЭГ, для которых беспроводные технологии, как правило,начальника, позволит развития использования компьютерных алгоритмов на основе изучения конкретных сигналов ЭЭГ (например, тета, гамма), а также автоматическое обнаружение приступов, значительно снижая нагрузку на экспериментатора.

Первичный доклинических моделью для изучения хронической эпилепсией после травмы головного мозга взрослой крысы или мыши, либо с помощью химио- судороги (т.е. каиновой кислоты или пилокарпин) или электрически индуцированные эпилептического статуса (SE), за которым следует хронической эпилепсией. В этих условиях, тяжелые судороги, связанные с SE или последующие изъятий в эпилептических животных может привести к травме от животного разрыва или потянув на привязи и, ослабив винты, которые поддерживают присоединение headcap. В конечном счете, именно это проблема, которая, как правило, заканчивается эти эксперименты, и все же необходимость получения долгосрочных ЭЭГ записи с высоким разрешением для экспериментов, направленных на разработку новых методов лечения для хроническихэпилепсия имеет первостепенное значение. Кроме того, корпус, мониторинг и анализ данных из долгосрочных имплантированных животных значительные инвестиции в обоих прямых затрат и времени следователя; Поэтому, преждевременное прекращение эксперимента может привести к значительным затратам исследователей. Поскольку эти модели эпилепсии прогресса, судороги, как правило, становятся все более частыми и более серьезными ^10-12, увеличивая вероятность того, что животные получили ранения, как их полезности для разработки новых методов лечения становится большой. Эти животные могут постоянно развиваться десятки судорожных припадков в день, часто встречающиеся в кластерах ^13.

Вероятно, это один из самых важных событий в биомедицинской науки было использование гена ориентации на мышах. Этот подход позволил, и будет продолжать, чтобы, разработка моделей животных генетической эпилепсии, что воспроизвести фактические человека синдромы ^14-16. Генетические манипуляции могут быть предприняты вдоказательство правильности принципа лечения, чтобы подавить эпилептические припадки или даже блокировать развитие эпилепсии после травмы головного мозга ^17-20. Этот тип исследования выиграют резко от способности выполнять высокой пропускной непрерывную запись ЭЭГ. В настоящее время это можно записать от мышей с привязи либо или телеметрических систем; Однако, проблемы получения высокого качества, без артефактов записи существенно сложнее, чем у крыс, и часто это требует различных форм рюкзаки, что мыши постоянно пытаются удалить. Стресс может увеличить тяжесть приступов, частоту и / или продолжительность, и, таким образом, в конечном счете, изменить эпилепсии экспериментальных животных, таким образом, не оправдав исследование. Маленький, легкий вес, низкий профиль миниатюрный телеметрии будет способствовать запись долгосрочного ЭЭГ от генетических мышиных моделях болезни человека.

В дополнение к описанным выше проблемам, ЭЭГ в незрелом модели грызуновс заболевания имеет свой собственный уникальный набор проблем. Незрелые животные могут весить немного как 6 г (P8 мыши) до 17 г (P6 крысы). Это практически невозможно сделать последовательные многодневные привязанные записи ЭЭГ в связи с увеличением напряжения из троса и неспособности, чтобы естественный выращивание щенка по плотине. До животные не отнимают от груди, они должны оставаться на попечении плотины. Плотина является склонным к уничтожить любую вовне соединительный узел на щенка, прекратить щенка, а в некоторых случаях прекратить весь помет. Кроме того, незрелые черепа грызунов затрудняет смонтировать любой электрод пьедестал к черепу с механической целостности. Эти проблемы, уникальные для незрелых грызунов, требует новое решение для создания надежной, долгосрочные электрографических записи. Здесь мы сосредоточимся на демонстрации имплантации и запись ЭЭГ с использованием нового миниатюрного беспроводного передатчика и представить три доказательства правильности принципа эксперимента в качестве примеров для использования миниатюрной беспроводной телеметрической системы: 1) имзрелая крысят модель гипоксии-ишемии, 2) для взрослых мышей, обработанных с DFP, чтобы вызвать эпилептический статус и последующие спонтанные судороги, и 3) генетическая модель сосудистых кавернозных мальформаций, которые приводят к изъятия и смерти у взрослых мышей.

Миниатюрная беспроводная система телеметрии была разработана для удовлетворения четыре основные требования: (1) минимально инвазивная хирургическая имплантация; (2) совместимость для жилья грызунов щенков с плотины и помета; (3) низкая потребляемая мощность блока, что позволяет месяцев непрерывного мониторинга без хирургического повторного имплантации; и (4) способность записывать высококачественные сигналов ЭЭГ с минимальными артефактами движения. Беспроводной передатчик весит 0,6 <2,3, и 4 г и <0,3, 0,8 и 1,4 см ³ в зависимости от батареи с след 5 х 7, 7 х 9 х 7 или 12 мм, которые легко крепится к черепу животного с цианакриловым геля. Нет костного винта якоря не нужно надежно закрепить устройствочереп, уменьшая количество отверстий, которые должны быть пробурены в черепе и время операции. Устройство способно усиливать два канала ЭЭГ или локальных потенциалов поля из глубинных структур мозга, такие как гиппокамп, в течение 2 недель, 2 месяца, 6 месяцев или в этой конфигурации. Небольшой размер беспроводного передатчика уменьшает риск инфекции, увеличивает подвижность животных, и в конечном счете, снижает заболеваемость и смертность, что в противном случае увеличивается время, деньги, и количество животных, необходимых для эксперимента. Все электроники и батареи герметизированы в лечебно-класса эпоксидной, что делает устройство водонепроницаемым и жестким, предотвращая плотину от жевания на передатчике, которые могли бы оказать устройство из строя. В отличие радиочастотных передатчиков, телеметрическая система использует емкостной связи между передатчиком и приемником антенны, которая находится ниже животного клетку, что позволяет пользователю держать животных в стандартном корпусе с грызунами. Многочисленные каналы recordiнг позволяют для записи мультимодальных биопотенциалов, таких как ЭКГ и ЭЭГ. Животные модели сопутствующих заболеваний выиграют от возможности записи биопотенциалов во поведения ^21-23. Объединение поведение с ЭЭГ-мониторинга обеспечит исследователям лучше инструмент для исследований и доклинических исследований.

протокол

Следуйте институциональные рекомендации по уходу за животными для хирургической стерилизации инструмента, и изменить протокол, необходимую для соблюдения принципов и получить одобрение Уходу за животными и использованию комитета вашей организации (IACUC) по.

1. Хирургическая подготовка

1. Очистите и подготовьте передатчик для обеспечения безопасной и стерильной хирургии. Снимите передатчик с антистатической упаковки и либо спрей или понежиться в 70% этанола. Промыть передатчик стерильным физиологическим раствором и места между стерильным ватным губки, смоченные в стерильном физиологическом растворе или держать погруженными в стерильном физиологическом растворе.
2. Сбор и стерилизовать инструменты, необходимые для операции; Автоклав для стерилизации паром. Смотрите таблицу материалов и реагентов для списка хирургических инструментов.

2. хирургической имплантации

1. Обезболить животное и поддержания анестезии в соответствии с IACUC утвержденных протоколом. При инициировании и во сюрГери проверить схождение щепотку рефлекс каждые 15 мин. Отсутствие реакции указывает достаточный уровень анестезии.
   1. Для щенков, использовать анестезию с изофлуран (4%) с О ₂ (100%). Для взрослых, использовать кетамин (100 мг / кг) с ксилазином (10 мг / кг).
2. Fix позицию в стереотаксической рамы. Поместите кончики ушей бар в слуховой проход. Не слишком затягивайте уха баров, а череп очень мягкий в маленьких крысят. Закрепите анестезия носовой конус.
   1. Держите животное в тепле во время операции, поместив его на грелку установлен до 37 ° C. У взрослых животных, применять смазочные мазь для глаз животного.
3. Стерилизовать разрез сайт и поддерживать стерильную хирургическую поле.
   1. Тампон головы с чередующимися применения 70% этанола и бетадином. Начало в центре головы и сделать более широкие концентрические круги.
   2. Накройте животное с драпировкой и провести операцию по драпированные животного. Поддерживать STERIле операционного поля, выравнивая хирургического настройка с стерильными пеленками, распылителем с 70% этанола.
   3. Носите стерильные хирургические перчатки и халат (или по мере необходимости в учреждении). Для поддержания стерильное поле, используйте хирургическую помощника.
4. Сделайте надрез на коже головы животного слегка позади глаз вдоль средней линии, примерно 2 см. Будьте осторожны при установке скальпель, как череп еще очень мягкие молодых крысят. Сделайте один разрез так разрез кровоточит меньше, и лечит быстрее.
5. Expose черепа. Подготовьте чистую и сухую зону, чтобы максимизировать связь между передатчиком и костей черепа. Используйте аневризма клипы понять головы.
   1. Осторожно потяните кожу головы от средней линии в четырех углах. Посмотрите на анатомических ориентиров, таких как брегмы и лямбда в черепе. Запомнить череп кости не срастаются у животных в этом возрасте. Используйте Paxinos атлас стереотаксических координат, чтобы найти правильное место для заусенцев отверстие.
6. Используйте Dremel типа инструмент с сверла заусенцев типа. Создайте два отверстия заусенцев в желаемых местах записи с отверстиями будучи больше, чем 300 мкм в диаметре. Поместите заусенцев отверстие для электрода сравнения в течение мозжечка за лямбда черепа.
7. Убедитесь, что провода на передатчике совмещены с отверстиями заусенцев. Если электрод провода не выровнены, клей загрязнение электродов, вероятно, и может привести к ухудшению сигнала. Чтобы выровнять провода, проверить посадку передатчика и аккуратно согнуть электроды выстраиваться за предназначенных для сайтов заусенцев отверстия.
8. Обрезать электродов ведет. Используйте хирургические ножницы, чтобы обрезать электродов до нужной длины. Глубина электрода имеет важное значение для типа записи, необходимой для эксперимента (т.е. размещать выше твердой мозговой оболочки электродов для ЭЭГ, или использовать стереотаксических координат для определенных структур головного мозга).
9. Обильно нанесите Цианоакрилат на базе передатчика ТО покрыть площадь убедившись, чтобы избежать нанесения электродов. Цианоакрилат клей электрический изолятор, загрязняя электроды с клеем приведет к отсутствию сигнала.
   1. При записи из глубоких структур головного мозга, установить датчик на держателе канюли и поместить его в руке стереотаксической контроля оси. Опустите передатчик с помощью стереотаксической руку к соответствующим глубину и место цианакрилатного гель вокруг передатчика.
10. Тщательно сухой череп до размещения передатчика, чтобы обеспечить сильное клеевого соединения. Применение передатчик, покрытую цианоакрилат к черепу. Позаботьтесь, чтобы выровнять электроды с соответствующими заусенцев отверстия.
    1. Попробуйте, чтобы не повредить основные сосудистые структуры. Держите передатчик в месте с небольшим давлением в течение одной минуты. Использование небольшое давление, чтобы сформировать сильную связь между передатчиком и черепа.
11. Применить дополнительные Цианоакрилат, достаточно, чтобы полностью запечатать интерфейс передатчик / череп. Для обеспечения AGOOD форме и прочная связь, максимизировать площадь поверхности клея, который контактирует с черепом. Нанесите клей цианакрилатного в круг вокруг передатчика, убедившись, что и череп и стены покрыты передатчика.
12. Применение химического ускорителя (0,1 мл) с помощью шприца вокруг цианоакрилат на базе имплантированного передатчика. Используйте ускоритель экономно, стараясь не применять к соседней ткани.
    Примечание: Химическая ускорение цианакриловым отверждения обеспечивает прочное соединение между передатчиком и черепа формируется быстро. Цианоакрилат ускоритель полезно скорости отверждения клея, но не является необходимым.
13. Извлеките ускоритель промыванием области тщательно стерильным физиологическим раствором. Ускоритель Цианоакрилат может вызвать раздражение ткани, если не вымывается из области разреза. Для мытья площадь, заполните 1,0 мл шприц стерильным физиологическим раствором и орошать площадь через иглу шприца. Вообще 0,5 мл физиологического раствора достаточно промытьУскоритель.
14. Шовный кожу вокруг основания передатчика, но не охватывают передатчик. Топ передатчика должна быть выше кожи, чтобы эффективно передавать нервные сигналы. Кожа должна быть достаточно жесткой вокруг передатчика и клея вокруг блока. Используйте викрил или шелковой нити (мягкая нить); Кожа в незрелых животных мягкий и легко повреждается, если мягкие швы не используются. Для взрослых животных, можно использовать любой сшивающий материал.
15. Удалить животное от стереотаксической рамы и место на нагретой одеяло для восстановления.
16. Убедитесь, животные теплой (37 ° С) и амбулаторно (то есть, полностью выздоровел), прежде чем вернуться к плотине. Убедитесь, что животное гидратированных зажимая кожу на спине животного (если животное обезвоженной, кожа останется деформированной). Если животное обезвоживается, управлять подкожной инъекции буфера лактата Рингера. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточно, чтобы поддерживатьгрудины лежачее положение.
    1. Администрирование бупренорфин (0,05 мг / кг) на животных для послеоперационной боли и подкожной инъекции 0,1 мл бупивакаина вокруг места инъекции.
       Примечание: от начала до конца вся процедура должна быть завершена в 5-10 мин для животных этого возраста (послеродовая день 6). Хирургическое время может занять больше времени, для пожилых животных.

3. Уход и дома

Примечание: Некоторые плотины не может терпеть щенков имплантированных с устройством. Плотины, возможно, потребуется выбрать, кто терпимо. Это приемлемо для плотины, чтобы переместить щенков вокруг клетки, выбирая их с помощью передатчика.

1. После того, как животные отвыкли, однократно им жилище, чтобы избежать удаление устройств из их клетки партнера.
2. Эвтаназии животных летальной дозой пентобарбитала (25 мг / кг) или изофлуран (в колпаком), когда признаки дистресса присутствуют.
3. Обратите внимание, что некоторые жилищные животных клетки с проволочными вставками могут междуФер с имплантированными передатчиков. Будьте уверены, чтобы проверить высоту проволоки вставки, чтобы убедиться, что животные не могут получить передатчик поймали между "барами" проволочной вставки. Проконсультируйтесь с вашим ветеринаром для получения помощи.

4. Запись ЭЭГ

1. Поместите животное в клетке само по себе или со-расположен с помета и плотины. Однако, место только один имплантировали животное в одном клетке. Не оставляйте щенка одного в записи камеры в течение более чем 2 часов. Монитор животных на наличие признаков дистресса и обезвоживания.
2. Подключите прилагаемый блок питания к базе приемника и убедитесь, горит индикатор питания. Подключите ресивер основание в системе сбора данных с использованием (Штык-Нил Concelman) BNC кабелей.
3. Поместите животное клетку на верхней части основания приемника (рис 2). "Сигнал" свет должен осветить что указывает передатчик был обнаружен. Данные могут теперь быть записаны.
4. ТО записи данных, подключите базовый приемник к аналого-цифрового и подключить преобразователь к компьютеру (рис 1).
5. Установите частоту дискретизации записи. Убедитесь, что данные образцы должным образом. Выберите по крайней мере, 250 Гц частоту дискретизации (500 Гц) рекомендуется для записи (пропускную способность передатчика 0,1-100 Гц).
6. Сохранить оцифрованные данные и анализировать с помощью обработки сигналов программные пакеты, такие как Matlab.

5. ЭЭГ анализ - Общие

1. Выполните БПФ (быстрое преобразование Фурье) для преобразования временных данных ЭЭГ в области частот от 0-100 Гц.
2. Выполните оценку плотности мощности спектральных (РСП) с использованием БПФ 256 сегментов Ханн-окна на основе метода Welch и нормализуется на 10 х log ₁₀ (PSD). Спектры мощности показать определенные частоты, которые доминируют сигнал ЭЭГ над требуемого периода времени.
3. Группа данных через животных, принимая среднее СДП от каждого животногос течением времени соответствием процедур. Создать 95% доверительные интервалы по 1,96 х среднего (PSD) / квадратный корень (н) где п число животных (PSD следы). Участок средние и 95% доверительные интервалы данных для создания количественной доклад всего частотного ЭЭГ через когорт животных, таких как сравнение групп, обработанных против контрольных групп.

6. Перинатальная гипоксия-ишемия (HI) Модель протокол

1. Обезболить P6 - 7 крысят с использованием ИФ анестезии (4% с 100% O ₂₎ путем размещения животное в коробке анестезии (ящик с входом из анестезии испаритель). При инициировании и во время операции проверки схождения щепотку рефлекс каждые 15 мин. Отсутствие реакции указывает достаточный уровень анестезии.
2. Поместите щенка на спину, выставить шею и скраб с чередующимися применения 70% этанола и 10% бетадином. Повторите этанол / BETADINE Скраб 3 раза.
3. Сделать 1 см разрез в коже шеи с Scissors на средней линии шеи. Подтяжка кожи пинцетом и делают разрез ножницами. Позаботьтесь, чтобы не порезать мышечной ткани, делая разрез.
4. Используйте тупой технику вскрытия подвергать сонной артерии. Для выполнения тупым, используйте две пары тупыми нос щипцами. Вставьте концы в ткани, и пусть весна действие хирургического инструмента распространения ткани. Повторяйте до тех пор сонная артерия не подвергается. Определить сонную артерию с помощью ярко-красного цвета и при наличии видимой импульса.
5. Отдельная сонной артерии от блуждающего нерва с помощью тупых щипцы. Вставьте тупым наконечником пинцет между артерией и нерва. Отпустите щипцы и пусть весна действие инструмента отделить сонную артерию от блуждающего нерва.
6. Место аневризма зажимы 4-5 мм друг от друга на сонной артерии. Позаботьтесь, чтобы не повредить артерию с зажимами, избегая быстрых движений.
7. Cauterize сонную артерию между аневризмы зажимов. Для прижечь артерииКоснитесь артерии между зажимами с наконечником горячей cauterizer. После артерия вырезать, убедитесь, что оба конца правильно прижигать, чтобы избежать кровотечения.
8. Снимите зажимы, закрыть шею разрез с 3 швами. Только шов на кожу, заботиться, чтобы не сшивать мышечной ткани.
9. Разрешить животных для восстановления в течение 1 часа. Монитор дыхания животного и кровотечение из шеи. Если кровотечение присутствует, не подвергайте животное к HI (шаг 6.10).
10. Поместите животное в контролируемой температурой камере при 37 ° С и непрерывно ввести 8% O _2/92% N ₂ смеси в камере в течение 2 ч.

Результаты

Мы разработали и внедрили концепцию записи ЭЭГ из одного взрослого грызуна, схематизированной на рисунке 1 Для процесса утверждения IACUC, дизайн должен интегрироваться в существующие институциональные средства животного. Поэтому, система была разработана, чтобы быть легко установлен в стандартном объекте животных без использования дополнительного пространства: животное находится в регулярной "животное объект-выпуск" жилья клетке, которая находится внутри приемника со встроенным клетки Фарадея, чтобы уменьшить электрический шум. Сигнал от каждого базового приемника осуществляется проводами с дигитайзера, подключенного к компьютеру (рис 1). Один компьютер необходимо собрать данные из до 32 животных, записанных одновременно, в зависимости от возможностей системы сбора данных пользователя. Этот тип установки потребляет мало энергии и производит меньше тепла, особенность совместимый с климат-контролем объектов животного. Данные могут бытьотображается в режиме реального времени на мониторе, что позволяет экспериментальный мониторинг и хранить долгосрочные внешних жестких дисков (единица хранения 10 ТБ).

Для того, чтобы минимизировать урон от мусора товарищей и детенышей раскулачивание по плотине, мы протестировали различные форм-факторы передатчик. Окончательный дизайн был куполообразный цилиндр; Форма сложно крысы кусают и повреждений. Индивидуальный передатчик на черепе взрослого крысы показано на рисунке 2А и ранняя версия высокой плотности (32 животное) приемников баз и записи установок, в которых стандартный корпус грызун размещенных показано на рисунке 2В. Энергоэффективность была чрезвычайно важным фактором; мы выбрали емкостную связь в качестве протокола передачи данных. Ниже конструкция позволяет для записи ЭЭГ непрерывный в течение 6 месяцев, в зависимости от емкости батареи (2А). Мыши, как молодые, как послеродовой день 12 (P12, рис 3а) и крысы, как молодые, как P6 (фигуре 3B) терпеть передатчик хорошо. Придерживаясь передатчик черепа с цианоакрилату позволяет животным расти с передатчиком в зрелом возрасте (рис 3C), в то время как поддержание непрерывного сбора данных ЭЭГ.

Уникальный миниатюрный форм-фактор интерфейса передатчика и беспроводной поддается для работы с моделями животных нео и перинатальных состояний. Данные на рисунке 4 показывает две каналов ЭЭГ к югу от острой судорожной активности, что следует гипоксически-ишемическая (HI) (перевязка сонной артерии с последующим 2 ч гипоксии с 8% O ₂ смеси) инфаркта в P7 Спрэг Dawley крысят ^13. Лечение HI вызывает большое поражение в полушарии ипсилатерального к лигируют сонной артерии. Вот, записи показывают, кластер из двух изъятий обобщенных над обоих полушарий мозга потерпевшей. Черный след изображает ЭЭГ в полушарии контралатеральном к поражению,синий след показывает ЭЭГ в ипсилатеральных полушарий (т.е. в области поражения). В то время как судорожная активность присутствует в обоих полушариях головного мозга, ispilateral полушарие показывает ЭЭГ подавления фона, что свидетельствует о продолжающейся повреждения мозга ^21.

Эпилептический статус может быть вызван у взрослых крыс путем инъекции животных с фосфорорганических, DFP ^22,23. Данные на рисунке 5 шоу повторяющихся разрядов на ЭЭГ, которые свидетельствуют о эпилептический статус (см временные расширения рис 5а, б). Ниже образец следов, время курс эпилептический статус в течение 12 часов была проанализирована с нелинейной смешанные эффекты модели, количественно интенсивность приступов в течение долгого времени. Тяжесть эпилептический статус определяется мощности ЭЭГ в диапазоне гамма (20-60 Гц). Здесь описано выше мощность была в среднем по 12 животных и нанесены в течение 12 ч с 95% доверительными интервалами. Чт е данные показывают заметное увеличение гамма власти в течение первого часа обработки DFP, который сохраняется в течение 12 ч, в течение которого животные непрерывно контролируется. Следующий метод анализа позволяет количественной меры степени тяжести острого эпилептического статуса, явление, ранее анализировали в первую очередь с поведенческими мерами. Мы включить этот метод анализа в качестве примера, потому что он использует вычисление мощности в классических групп ЭЭГ и широко используется в доклинических исследованиях для тестирования эффективности противосудорожных препаратов в нашей лаборатории ^24-26. Возможно, наиболее важный аспект делает продолжительный, непрерывный беспроводных записи с беспроводной телеметрии является возможность записи аномальные спонтанные события, которые происходят с низкой частотой. Эти типы данных демонстрируют широкий полезность беспроводной системы передатчика.

554fig1.jpg "/>
Рисунок 1:. Схема системы записи Epoch беспроводная система записи состоит из двух компонентов: 1) беспроводной череп монтажа передатчик, который усиливает биосигнал, и 2) Приемная плита размещены под стандартном корпусе грызунов. Выход базовый приемник аналоговый сигнал, состоящий из демодулированных биосигнала усиливается до максимум 4 В от пика до пика. Этот сигнал может затем быть подан в систему сбора данных для записи.

Рисунок 2:. Передатчик и приемник Данный передатчик () весит 4 г и смещает <1,4 см ³ объема и с след 7 х 12 мм легко монтируется к черепу крыс и мышей. Передатчик может усиливать 2 канала биопотенциалов до 6 месяцев, после чего батарея сливаредактор Большие батареи могут быть использованы в течение более длительного времени записи. Животных помещают в стандартном арретирования грызунов в верхней части приемника Epoch (B). Показанное справа ранний пример из двух отдельных установок записи каждый, способных записи с 16 животных одновременно демонстрируя сравнительно небольшой след (2 х 4 ", около 60 см х 120 см) каждого из регистрирующих установок.

Рисунок 3:. Имплантация беспроводной передатчик у крыс и мышей передатчик позволяет непрерывные записи ЭЭГ на срок до 6 месяцев в мышей, молодых, как послеродовой день 12 (P12, вверху). Средний фотография имеет P7 крысят имплантированного с миниатюрной передатчика. Передатчик остается прочно прикреплены к черепу, как животное взрослеет. Животное в нижней части находится P280 и имплантировали фиктивный передатчика в возрасте Р7. Система позволяет Simultaое и непрерывные записи ЭЭГ от нескольких животных в возрасте P7 путем отъема, уменьшая количество пометов, необходимых для доклинических, долгосрочной перспективе, мониторинговых исследований ЭЭГ.

Рисунок 4: Двухканальный записи ишемии-гипоксии, индуцированные судороги с системой телеметрии Двухканальные записи ЭЭГ ненормальным с беспроводной телеметрии в Р7 крысят после перевязки сонных (ишемия) в течение 8% O ₂ обращения (гипоксия).. (А) и (Б), расширил взгляды сигналов. Захват активность присутствует в обоих полушариях (черный, синий) с существенной подавления ЭЭГ настоящего полушария с ишемическим инфарктом (синий).

Рисунок 5: Запись состояния epileptiКас у взрослых крыс. записи ЭЭГ поверхности (т.е., дюраль) с миниатюрной беспроводной телеметрической системы в ответ на диизопропилфторфосфатом (DFP) лечение в взрослой крысы. В затененных периоды в верхней след (A и B) будут расширены виды осциллограмм в следах ниже. Данные, записанные с помощью беспроводного передатчика могут быть проанализированы в частотной области, позволяя статистических сопоставлений в когорте животных. (С) Данные являются средними и 95% доверительные интервалы власти гамма диапазона (20-60 Гц) следующие DFP-индуцированной эпилептического статуса (N = 12) в течение 12 ч после введения DFP.

Рисунок 6:. Запись изъятия и изменения в ЭЭГ в трансгенной модели мыши сосудистых кавернозных мальформаций Здесь мы записываем от трансгенной мыши () йна переживает судорожной активности. Во-первых, нормально ЭЭГ присутствует (1); непосредственно перед захватом есть период предварительного иктальной депрессии (2), за которым следует кластер из пяти припадков (3). После изъятия, аномальные иктальных разряды в сигнале (4). Управление животное не имеет судорог и аномальные особенности ЭЭГ (б).

Обсуждение

Это может быть очень дорогим, чтобы сделать долгосрочные электрографических записи в моделях малой животных болезни. Опираясь на простых электрических цепей и подчеркивая низкое энергопотребление, мы смогли создать систему передатчика (1 и 2), что снижает стоимость долгосрочных экспериментов мониторинга. Общая стоимость эксперимента мониторинга 6 месяцев может быть как низко как $ 470, плюс стоимость животного (~ $ 1,5 животных суточные, $ 200 передатчика). Небольшой размер передатчика позволяет постоянно и бесперебойно электрографических записи в небольших животных, доклинических моделей заболеваний человека, которые очень трудно получить с привязи или радиочастотная основе беспроводных систем записи (рисунок 4). Наконец, череп монтажа характер передатчика уменьшает время операции и стресс на животное, которое в противном случае может поставить под угрозу эксперимент. Здесь мы покажем, проверка и подтверждение принципа действия экспериментов из трех Diffразличны экспериментальные модели судорог: перинатальная гипоксия-ишемия ^{13, 27, 28} в крысят (Рисунок 4), DFP-индуцированной эпилептический статус (Рисунок 5) и судороги в генетически-индуцированной модели кавернозных сосудистых пороков развития (Рисунок 6).

Возможно, наиболее важным аспектом для получения артефактов бесплатно, долгосрочные электрографических записи является проверка беспрепятственный доступ электрода к корковой области интереса (рис 4-6). Это включает в себя общее задание / заземляющий электрод. Особенно важным является присоединение передатчика к черепу для эпидуральной приложений ЭЭГ. Во время этого процесса, можно непреднамеренно покрытие наконечник электродов с цианоакрилат, учитывая очень короткой длины электродов. Покрытие электродов в цианоакрилату может ослаблять сигналы ЭЭГ или полностью изолировать их в худшем случае. Точно так же, отсутствие хорошего электрического соединения бetween общий опорный / земля и мозг животного будет препятствовать правильной работе дифференциального усилителя в передатчике, в результате чего "электрически шумной" выходного сигнала. Часто, после операции, хорошего качества сигналов может быть нарушена в течение 48 часов из-за отека окружающих заусенцев отверстия в черепе. Как отек спадает, сигналы в целом улучшить. Этого можно избежать путем размещения электродов на поверхности черепа без заусенцев отверстия. Последствия этого процесса увеличивается потенциал для покрытия электродов с цианоакрилату, снижается высокочастотный деятельность в связи с нижних электрических характеристик кости черепа, и потенциал, чтобы электрически изолировать общую задания / заземления рендеринга шум в сигналах. Практика правильное размещение электродов может быть сделано с тонким куском дерева или шпона, который имитирует толщину мыши или крысы черепа. Результаты, представленные в этой рукописи иллюстрируют квамируемости записей, которые могут быть получены с помощью беспроводной технологии телеметрии.

Хирургической имплантации с использованием метода, описанного здесь, могут принимать всего 10 мин, в зависимости от сложности операции. Для хирургического доступа к глубоких структур головного мозга, таких как области СА1 гиппокампа, лучше, чтобы прикрепить передатчик к микроманипулятор установленного на стереотаксической рамы. Микроманипулятор обеспечит хирург с точностью имплантировать передатчик в соответствии с опубликованными стереотаксических координат в атласе мыши и крысы ^{29 30} мозге. Это может быть сделано путем простого лавируя кусок трубки иглы для подкожных к передатчику с цианоакрилат, а затем монтажа иглу в микроманипулятора. Микроманипулятор контроль х, у, г координаты обеспечит дополнительную устойчивость при установке передатчика к черепу до наложения швов кожи закрыты. Добавление костных винтов вокруг PErimeter передатчика может помочь закрепить передатчик в черепе, хотя они не являются необходимыми. Костные винты могут быть эффективными, однако, в некоторых моделях животных судорог и эпилепсии, таких как литий-пилокарпин обработанной взрослой крысы. Эти животные, как правило, спонтанные судорожные припадки с интенсивным двигательной активности, которые могут повредить передатчик во время захвата. Дополнительная сложность может быть добавлен в этих экспериментах. Например, передатчик совместим со многими различными моделями черепно-мозговой травмы, такие как контролируемой коркового влияния ^31. Долговечность передающего устройства была протестирована с помощью имплантации животным передатчиков на Р7, а затем корпус их на объекте животных. Через 12 месяцев, большинство имплантатов остались нетронутыми на черепе. Когда животные были умерщвлены, черепа оказались нормальными и передатчик встроен в кости черепа, требуя значительную силу, чтобы извлечь его. Будьте осторожны, когда глубинные структуры мозгаизучаются; а мозг растет, и электроды остаются неподвижными, окончательное положение электродов можно было бы ожидать, чтобы изменить. Для методов, описанных здесь, электроды, как правило, расположены над твердой мозговой оболочки, которая позволила и головного мозга и черепа, чтобы расти и для электродов оставаться в своих первоначальных позиций. Ограничивающим фактором в том, как долго передатчик может быть использован, является размер батареи (т.е. до разрядки батареи).

Автономный монолитной конструкции (т.е. передатчик встроен в жесткий эпоксидной) жилья передатчика поддается использовать с незрелыми щенков размещены с плотиной и их помета. Часто, со-жилья имплантируют животных с проволокой тросов приводит к разрушению имплантированной аппаратного или раскулачивание, детенышей по плотине. С гладкими стенками форма преобразователя позволяет для имплантации практически без сбоя или потери щенков в связи с раскулачивание оборудования.

низким энергопотреблением емкостной связью схема передачи в этой системе хорошо поддается для использования во многих различных экспериментальных сценариев, таких как размещение в инкубаторе с контролируемой температурой или даже для использования с экспериментальными аппаратов, таких как плетизмографии камеры. Точно так же, форма антенны приемника можно манипулировать, чтобы поместиться в различных поведенческих условиях, таких как повышенной Т-maze.The диапазоне передатчика находится всего в нескольких дюймах, как передатчика должны быть в состоянии "привод" (емкостной пара чтобы) антенны приемника и зависит от животного, которые будут размещены в стандартном арретирования грызунов или подходящей клетке, покрытой площади поверхности антенны приемника. Передатчик действует как один полюс электрического поля в то время как тело животного действует как другой полюс. Поле таково, что определенные ориентации, такие как 90 ° вне фазы с приемной антенной, будет не в состоянии привод антенны приемника в результате чего "выпадают", Это довольно редкое явление. Будущая работа с этой технологией позволяют записывать с нескольких животных в одной клетке, что позволит снизить затраты интернатов и позволит для социального взаимодействия. Дальнейшее развитие будет включать увеличение числа каналов, включая температуру и электромиограммы. Текущий дизайн устройства обеспечивает пропускную способность, которая оптимизирована для перекодирования классических групп ЭЭГ, которая не подходит для записи быстрых рябь или высокочастотных колебаний. В дальнейшем, устройство может быть изменен, чтобы записывать высокочастотные компоненты сигнала, но ценой жизни батареи. Различные типы датчиков будет включать в себя кровяное давление и давление-объем, и даже строительство расположения электродов передатчика к заданным пользователем размерам в соответствии с стереотаксической координат искомых структур головного мозга.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterile Surgical Gloves	Protective Industrial Products	100-3201 PF	Powder Free Sterile Latex Surgical Glove
Scalpel Handle	FST	10003-12
Scalpel Blade #15	FST	10015-00
Fine Scissors	FST	14090-09
Burr tool	Ram Products, Inc.	Microtorque II
Fine burr	FST	19007-07
Aneurism clip	ROBOZ	RS-5422
Toothed Forceps	FST	11022-14
Cotton-Tipped applicators	McKesson	24-103
Needle Driver	WPI	521725	Olsen-Hegar Needle Holder
Cyanoacrylate gel	Henkel	Loctite 4541
Cyanoacrylate accelerant	Henkel	Loctite 7452
Suture	Ethicon	Vicryl RB-1 J304
Elecrocautery disposable	Bovie	AA01	Fine Tip
Surgical Tray	FST	20311-21
Epitel Receiver Base	Epitel Inc	N/A
Epitel wireless transmitter	Epitel Inc	N/A
Biopac digitizer	Biopac	MP-150
PC-compatible computer