Spot исправить ткани Every Time в нескольких тканевых блоков

Резюме

Цель образца ориентации Tag (SPOT), чтобы функционировать в качестве инструмента ориентации, чтобы помочь в идентификации личности ткани в нескольких парафиновых блоков тканей. Эти протоколы показывают, как легко построены из общих, недорогих материалов и гистологии служит надежным визуальным маркером, в парафиновых блоков и секций.

Аннотация

Мульти-ткани парафиновые блоки обеспечивают высокую пропускную способность анализ с повышенной эффективностью, экспериментальной единообразия и уменьшения времени и стоимости. Тканевые микрочипы составляют большинство мульти-ткани парафиновых блоков, но и все чаще исследователи с использованием не-облеченные блоки, содержащие большие тканей из нескольких лиц, которые могут обеспечить многие преимущества тканевых микрочипов без значительных инвестиций в планировании и оборудования. Важным компонентом любого анализа мульти-ткани является метод ориентации, используемый для идентификации каждого отдельного ткани. Хотя существуют методы для поддержания правильной ориентации и идентификации тканей в нескольких тканевых блоков, большинство не очень хорошо подходит для не-облеченные блоков, может потреблять драгоценное пространство в массиве и / или трудно производить в стандартной гистологии лаборатории. Образец Ориентация тегов (спот) простой, низкая стоимость ориентации инструмента, что отчетливо видно в парафиновые блоки и всех срезов FOг надежная идентификация образцов в выстроенных и не выстроились макеты. Месте обеспечивает преимущества по сравнению с существующими методами ориентации для не-выстроены блоков, как это не требует какого-либо прямого модификации ткани и обеспечивает гибкость в расположении тканевых частей.

Введение

Возможность вставлять образцы тканей из нескольких лиц в одном парафинового блока позволяет легко бок о бок сравнение между лечения и физических лиц, устраняет вариабельность между слайдами, а также снижает стоимость и объем работы секционирования и окрашивания образцов. Эти многофункциональные блоки ткани обычно получают либо в виде тканевых микрочипов (TMA) или парафиновых блоков, содержащих ткани из нескольких индивидуумов в макете не-массива. Обслуживание идентичности образца имеет решающее значение для успеха любого анализа нескольких тканей. Исследователи использовали ТМА, так как их развитие с целью повышения эффективности анализа, снизить вариацию между слайдами, ценные ресурсы ткани, и сократить время и стоимость экспериментов ^1. Правильное положение ТМА может быть достигнуто с помощью различных методов, в том числе пустых пространств, строк или столбцов между ядрами ткани ^2-4, асимметричным расположением основных групп ^{3, 5} (например, Controл против лечения), "маяка" ядра ^6, и назначенные ядра ориентации, находящиеся за пределами матрицы ТМА ^3. Хотя эти методы хорошо работают для ТМА, наиболее отнимают основную ТМА пространство и TMAS с пробелов и пробелов в идентификаторы могут стать запутанным, как сердечники ткани исчерпаны в течение долгого времени. Кроме того, эти методы не подходят для использования в нескольких тканевых блоков без формате массива, потому что они полагаются на аномалии в плотно упорядоченной структуре единых микрочипов ядер, как идентификаторы. Большинство блоков не-облеченные нескольких тканей должны учитывать неоднородные ткани и, по определению, не отображать структурированную сетку массив, который делает эти аберрации выделяются в качестве ориентиров.

Хотя существует много преимуществ в использовании ТМА, один из самых больших недостатков является небольшой размер сердечников, которые не всегда представитель в основном гетерогенной ткани ^1. Номера выстроенные блоки мульти-ткани обеспечивают многие из тон приносит пользу из ТМА, но содержат большие образцы ткани или целые органы из исследований на животных. Тканевые микрочипы, использующие один сердечники имеют различные согласование с участками цельной ткани на основе белка, представляющего интерес, и многие требуют несколько ядер для повышения согласованности ^7-11. Из-за сложности и гетерогенной природы некоторых биомаркеров фенотипов, ТМА, используя даже большое число ядер (> 10) по-прежнему может быть недостаточно и может потребоваться другие, чем микрочипов для анализа ⁸ методов. Кроме того, ТМА строительство отнимает много времени, технически сложных, и требует первоначальных затрат и инвестиций в или доступ к ткани arrayer. Номера для упорядоченной блоки мульти-ткани могут быть сделаны в любой основной лаборатории со значительно меньшими затратами времени и усилий и реальной альтернативой для исследований, которые требуют больше ткани, чем массивы позволяют или в качестве средства, чтобы сократить расходы и упростить анализ.

Номера выстроены несколько блоки ткани аналогично требует надежной иразориентации маркер для отслеживания идентификацию образца, однако, развитие этих маркеров был ограничен. Большая часть литературы, описывающей ориентацию ткани фокусируется на правильном физиологическом ориентации для встраивания отдельных частей ткани, такие как татуировки ткани с чернилами ^12, предварительно вложение тканей в агар-желатин до обработки ^13, и маркировка определенные ткани с вырезами ¹⁴ или ¹⁵ швов , Хотя функциональный, эти методы не являются идеальными в качестве маркеров в нескольких тканевых блоков из-за ограничений. Шов будет срезы через быстро и не может быть виден в каждой секции. Предварительно вложение методы с использованием агар-желатин может сохранить ткани в правильном положении во время обработки и вложения, но не обеспечивает визуальный сигнал, чтобы дифференцировать между несколькими образцами в парафиновый блок и слайдов. Пазы или краситель на ткани может осложнить анализ или закрывают важные морфологические детали. Кроме того, идентичность тканив блоке не объединенным в массивы нескольких тканей может осуществляться с помощью встраивания кусочки ткани в асимметричном расположении, но это требует 3 или более кусочки ткани и может не позволять для оптимального расположения тканей для анализа.

Образец Ориентация тегов (SPOT) была разработана в качестве простого и недорогого способа четко определить тканей в нескольких тканевых блоков и предлагает множество преимуществ по сравнению с существующими методами ориентации. Пятно небольшое, красочные, ядро состоит из гидроксиэтил агарозном геле обработки и маркировки ткани красителя, и проникли с парафином (рис 2С). Ядро пятно встроен в конце рядом с одной ткани в парафин блока мульти-ткани и выглядит как яркие точки в блоке и в каждом разделе (рис 1А - D), четко указав правильную ориентацию блока и секций для облегчения идентификации ткани.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Строительство месте

1. Добавьте 50 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) на 1 мл тканевого маркировки красителем в 15 мл коническую пробирку или 2 мл пробирке и вихря в течение 1 мин или до полного растворения.
   Примечание: Для этого протокола, использовать биохимический Grade BSA. В то время как другие сорта и чистота не были проверены, ожидается, что оценка и чистота не будет иметь значительное влияние на успех месте.
2. Тепло 9 мл гидроксиэтил агарозном геле обработки в 15 мл коническую пробирку в микроволновой печи при 30% мощности в течение 10 сек с шагом, пока гель не полностью плавится.
3. Смешайте растопленное обработки геля и раствора красителя BSA в одном 15 мл коническую пробирку и тщательно перемешать с помощью пипетки. Vortex решение.
4. Поместите коническую трубку в холодильнике в течение нескольких часов или до твердого продукта.
5. Используйте длинный, тонкий, металлический шпатель или зонд, чтобы стравить гель вилку цветной с конической трубе.
6. Используйте скальпель или лезвие, чтобы у.е.т гель подключить в поперечном направлении в 5 мм толщиной секций. Снимите закругленные концы и распоряжаться, как отходов (рис 2А).
7. Поместите гель подключаемые разделы плоские в гистологии кассеты и удерживайте в 70% этаноле в течение 1 часа. Изменение 70% -ным раствором этанола каждые 2-4 ч в течение по крайней мере 3 изменений за период 24 ч.
8. Вручную обработать участки гель через серию этанола (1 час каждого: 70% этанола, 80% этанола, 95% этанола, 100% этанола (изменения 3x), то ясно, при очистке раствора 3 раза в течение 1 часа каждый (например, алифатические углеводороды ( ксилолы заменой)) были использованы в данном протоколе, ксилолы также приемлемы), и проникнуть с расплавленным парафином (3x в течение 1 часа каждый), либо вручную, либо в ткани processer.
   Примечание: До полного обезвоживания в 100% этаноле, краситель может вытекать из пробки геля, которые могли бы повлиять на другие ткани и жидкие реагенты в автоматическом процессора ткани. Таким образом, руководство регидратации настоятельно рекомендуется, однако автоматизированной обработки фассоюзник эффективным.
9. Код для вставки нескольких разделов обработанные гелем, используя стандартный парафин методологии (рис 2b). Разрешить блоки для охлаждения и затвердеть, а затем до комнатной температуры.
10. Используйте кожной удар иглы нужного размера, чтобы удалить месте ядра из срезов геля до блока не исчерпывается (рис 2С). Один блок может обеспечить до 20 х 2 мм ^{2 ядра.} Хранить сердечники в прохладном месте. Используйте кожных удар в этом протоколе см рисунки, 1,5 мм (рис 1D, 2D и) или 2 мм (рис 1B, 1C, 2C и).

2. Использование пятна Ориент Номера выстроены блоков

1. Создать ориентации ткани схему, чтобы указать желаемые места и личности всех отдельных частей ткани, чтобы быть встроенными вместе, и расположение пятна.
   ПРИМЕЧАНИЕ: схема ориентации ткани показано на карте, которая включает рhysical расположение всех частей тканей помеченных идентификаторов и расположения месте. Она может быть создана в электронном виде или может быть рисованной. Схема должна быть создана при помощи любой метод лучше всего подходит техник и исследователь, используя конечный продукт. Эта карта будет служить в качестве руководства для исследователя, так образцы могут быть легко определены в ходе микроскопического анализа. Карта используется в данном протоколе была нарисована. Она изображает блок ткани и стекла микроскопа с каждой части ткани и месте проведенной и надписью в том же положении, как фактического блока тканей и горкой.
2. Обработайте кусочки ткани, обычно, гарантируя, что они остаются правильно определены на протяжении кассовым и обработки шагов. Для этого протокола, обрабатывать ткани в течение 1 часа каждый: 70% этанолом, 80% этанолом, 95% этанолом, 100% этанола (изменения x3), алифатические углеводороды (ксилолы) (заменители изменения x3), и расплавленный парафин ткани инфильтрации на 60 ° C (изменения x3).
   ПРИМЕЧАНИЕ:LL ткани должны быть обработаны следующие лабораторных процедур стандарт гистологии. Это может быть из-за переменной в конкретной лаборатории процедуры, размер ткани и типа, но это не повлияет на возможность использовать месте в качестве инструмента ориентации.
3. Упорядочить кусочки ткани на вложения станции в правильных местах, назначенных в соответствии со схемой ориентации ткани. Используйте схему ориентации ткани в качестве эталона для руководства специалиста о том, как организовать месте и кусочки ткани в каждом блоке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе встраивания техник поставить рисованной ориентации карты рядом с вложением станции и расположены тканевые части на вложения станции точно так же, как организации обращается на диаграмме. Это гарантирует, что все кусочки ткани остаются правильно идентифицировать в конечном продукте. Это абсолютно решающее значение для успешного использования мульти-ткани блоков.
4. Убедитесь, ядро ​​пятно выше все кусочки ткани, чтобы быть встроен в блок,
5. Вставить куски ткани, а затем пятно на конце (поперечных) в нужных местах в зависимости от ориентации ткани схеме, используя стандартную методику вложенности. При необходимости, провести месте (ы) вертикально щипцами, пока парафин не затвердеет настолько, что пятна (ы) не упадет (1-2 мин).
6. Раздел и пятно парафиновые срезы с поверхности с помощью стандартной методики.
   1. Разрешить секции плавать на водяной бане при 40 ° С и приклеена к положительно заряженной стекло (незаряженные скользит не были протестированы). Сушат слайдов в сушильном шкафу при температуре 60 ° С в течение по меньшей мере 20 мин.
   2. Поместите слайды в автоматическом ситечко и обработан следующими реагентами: ксилолы (ксилолы 1-5 мин, ксилолы 2 и 3-2 мин, каждый), 100% -ного этанола (2 мин), 95% этанол (1 мин), 80 % этанола (30 сек), 70% -ный этанол (30 сек), проточной водопроводной водой (2 мин), гематоксилином (1,5 мин), проточной водопроводной водой (3 мин), кислоты спиртом (1 мин), проточной водопроводной водой (2 мин ), блuing реагент (1 мин), вода (2 мин), 80% -ный этанол (30 сек), эозином (1 мин), вода (10 сек), 80% этанол (1 мин), 100% -ного этанола (3 изменения, 2 мин каждый), ксилолы (3 изменения, 30 сек каждый).
   3. Обложка слайды с покровные стекла, смонтированных с монтажной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, histotechnician срезы парафиновых блоков на микротоме в 5 мкм разделов. Для этого протокола мы использовали автоматический Стайнер, однако равные результаты могут быть получены с помощью ручного окрашивания.

3. место в ТМА (Руководство Комплект ТМА)

1. Создать схему ориентации ткани, как описано в 2.1 и назначить нужное место (ы) пятна.
2. Заполните форму TMA с расплавленным парафином на вложения станции. Как форма охлаждения, вставлять месте (ы) на конце в кулуарах формы ТМА в нужных местах, указанных на диаграмме ориентации ткани. При необходимости, удерживать месте (ы) в вертикальном положении до тех пор, щипцами парафина гас затвердевает настолько, что пятна (ы) не упадет (1-2 мин).
3. Соберите ядер TMA в соответствии с указаниями изготовителя и с учетом расположения пятна (ы) в массиве маржи (рис 2D) и следуйте стандартные секционирования и окрашивания протоколы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь шаг 2,6, чтобы увидеть секционирования и окрашивания методы, используемые в настоящем протоколе.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Пятно появляется как раунд, яркие точка в парафиновый блок (рис 1А и 2D), во всех парафиновых срезах, и остается на стекле через процедуры Н & Е или IHC окрашивания (рис 1B - 1D, 2D и). Это очевидные визуальные средства кий оба histotechnician и исследователь в иденти...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Успешное подготовка и использование пятен требует тщательного соблюдения нескольких технических этапов. Таяние гидроксиэтил агарозы должно быть сделано медленно и на слабом огне. Быстро плавления при высокой температуре может привести к какой-либо аварии агарозы для менее оптималь?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histogel Specimen Processing Gel	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
Tissue Marking Dye	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	Any tissue marking dye would most likely be sufficient.
Arraymold Kit A 2 mm (60 core)	Arraymold	20015A	Any manual tissue arrayer would work similarly.