Справочное Отвар микроразведения Метод Dalbavancin<em&gt; In Vitro</em&gt; Восприимчивость Тестирование бактерий, которые растут аэробной

Резюме

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Аннотация

Тестирование антимикробной восприимчивости (АСТ) выполняется для оценки активности в пробирке антимикробных агентов против различных бактерий. Результаты АСТ, которые выражаются в минимальные ингибирующие концентрации (МИК) используются в научных исследованиях для антимикробной развития и мониторинга развития резистентности и в клинических условиях для антимикробной терапии руководством. Dalbavancin является полусинтетический lipoglycopeptide антимикробный агент, который был утвержден в 2014 году мая за продуктами и лекарствами США (FDA) для лечения острых бактериальных кожи и структуры кожи инфекций, вызванных грам-положительных организмов. Преимущество далбаванцина над текущим анти-стафилококковых терапии является его длительный период полувыведения, что позволяет один раз в неделю дозирования. Dalbavancin обладает активностью в отношении золотистого стафилококка (в том числе как метициллиночувствительные золотистого стафилококка [MSSA] и метициллин-устойчивый золотистого стафилококка MRSA []), коагулазонегативными стафилококков, стрептококк группы anginosus, β-гемолитический стрептококк и ванкомицин подвержены энтерококки. Как и в других недавних агентов lipoglycopeptide, оптимизации методов испытаний восприимчивость CLSI и ИСО бульона включает в себя использование диметилсульфоксида (ДМСО) в качестве растворителя при приготовлении исходных растворов и полисорбат 80 (P80), чтобы облегчить прилипание агента пластика. До клинических исследований и в ходе первоначального развития далбаванцина, восприимчивость исследования не проводились с использованием Р-80 и МИК, как правило, 2-4 раза выше, и аналогично выше МИК результаты были получены с агаровой методом разведения восприимчивости. Dalbavancin был впервые включен в CLSI бульон микроразведений таблиц методологии в 2005 году и внесены изменения в 2006 году для уточнения использования ДМСО и P-80. Отвар микроразведений (БМД) порядок, показанный здесь, специфичные для далбаванцина и в соответствии с CLSI и ISO методов, с шаг за шагом подробно и ВОКнам на критических шагов добавил для ясности.

Введение

Dalbavancin является полусинтетический lipoglycopeptide, который был одобрен FDA в мая 2014 года для лечения острых бактериальных кожи и структуры кожи инфекций, вызванных грам-положительных организмов ^1. Основная цель подробно этот метод в видео формате, чтобы обеспечить четкое руководство к клинической лабораторной и научно-исследовательских ученых для тестирования и отчетности точных и воспроизводимых результатов Dalbavancin восприимчивости.

Регулярно осуществляется Определение антимикробного агента MIC коммерческими методами в клинических лабораториях для оценки деятельности агента в пробирке против патогенных бактерий. Метод, описанный здесь метод микроразведений бульон, как рекомендовано CLSI и ISO ^2,3,4. Так Dalbavancin коммерческие методы восприимчивость не доступны в данный момент (на момент данной публикации) и диффузии диска и агар методов разведения в настоящее время не рекомендуется Fили Dalbavancin, методы разведения ссылка бульон текущие варианты ^12,14. Как это эталонный метод не является коммерческим и FDA очищается диагностический метод в пробирке, клинические лаборатории в США, которые используют эту процедуру для тестирования пациента должны соблюдать нормативные требования для лабораторного испытания разработанной (LDT). Предполагается, что по мере увеличения использования Dalbavancin, больше лабораторий будет иметь необходимость проверить это соединение. Ванкомицин тестирование как суррогат для определения Dalbavancin восприимчивости S. стафилококк был утвержден ^5. Тем не менее, Dalbavancin могут быть активными против устойчивых к ванкомицину S. промежуточной стафилококк (VISA) и, следовательно, врачи могут запросить результаты Dalbavancin MIC. Кроме того, МИК для других видов бактерий могут быть запрошены.

В FDA подвержены останова для далбаванцина против S. стафилококк был установлен в ≤0.12 мкг / мл. FDA назначается только susceptiBLE категории из-за отсутствия данных о резистентных штаммов. Нормальное распределение МИК среди дикого типа S. стафилококк изолятов между 0.03-0.12 мкг / мл, с четким модальной МИК 0,06 мкг / мл. Небольшое изменение в МИК-за разницы метода, в дополнение к присущей изменения МПК ± одним разведения, может оказать существенное влияние на темпы восприимчивости. ⁶ Как и в других lipoglycopeptide агентов, Dalbavancin восприимчивость тестирования может быть сложной задачей в результате растворимости и относительно большого размера молекулы и ее связывающими свойствами ^7,8,9. Ссылка метод БМД описано здесь включает в себя два конкретных шагов, которые являются уникальными для нерастворимых веществ и / или lipoglycopeptide агентов: (1) использование ДМСО для приготовления растворов и (2) добавлением 0,002% P-80 в конечном панели MIC разведения. Целью данного видео публикации чтобы обеспечить ясность методу Dalbavancin BMD и specificaLLY сосредоточиться на этих ключевых шагов, чтобы обеспечить точные и воспроизводимые результаты MIC.

протокол

Примечание: Обратитесь к CLSI документов M7-A10 и М100-S25 и / или ISO / FDIS 20776-1 для полных деталей методом ссылка бульон микроразведений для антимикробной восприимчивости ^{2, 3, 4} Опорные методы позволяют опций некоторые. Процедуры, относящиеся к подготовке посевной и ВПК панели производства для достижения того же результата. Метод подробно описаны здесь, относится к одному антимикробный агент, далбаванцина, и некоторые из шагов представляют собой один из потенциально нескольких способов ссылка процедура может быть выполнена. Меры предосторожности Соответствующее безопасности (в соответствии с уровнем безопасности 2) должны быть использованы ^10. МИК формате панель, используемая для целей настоящего видео публикации показано в таблице 1.

1. Хранить порошок Dalbavancin

1. После получения диагностической класса Dalbavancin порошка, хранить при температуре -20 ^{° С} в высушенном среды в не-оттаивания морозильной камеры. Перед использованием порошок должен равновесие сдостичь RT перед открытием.

2. Подготовьте ВПК панели разведения

1. Приготовить рабочий раствор не выше, чем 1600 мкг / мл далбаванцина в аккуратный (чистой) ДМСО в стерильные стеклянные или пластиковые пробирки и использовать в тот же день подготовки или магазин при -20 до -60 ^{° С или} ниже для будущего использования в не-оттаивания морозильной. Примите во внимание потенции далбаванцина, как это предусмотрено в документации, полученной с порошком, при взвешивании порошка (см Уравнение 1 например 800 мкг / мл массоподготовки).
2. Развести разбавление акций, аналогичную схеме, как показано в столбце 1 ("Источник концентрация») в таблице 2 с аккуратным ДМСО в стерильные стеклянные или пластиковые пробирки. Использование одного пипетки для измерения разбавитель и другой пипетки для добавления начального Dalbavancin запас для первой трубки. Для каждого последующего концентрации Dalbavancin фондовой использовать новую пипетку.
3. Подготовка окончательного 100X ВПК панели ОБОГАЩЕНИЯрацион разведения (промежуточные концентрации) с аккуратным ДМСО. Как показано в столбцах 2-4 таблицы 2, объединить соответствующие объемы источника и ДМСО, чтобы получить желаемого промежуточного концентрации (объем для использования будет зависеть от количества MIC панелей, которые будут сделаны).
4. Подготовка 0,004% P80: Подготовьте свежий рабочий маточный раствор 2% P80, добавив 0,1 мл P80 до 4,9 мл _дН 2 O. Стерилизация пропусканием через 0,22 микронный фильтр и использовании решение в тот же день подготовки. Готовят 0,004% P80 разбавитель, сделав 1: 500 разбавление 2% Р80 (например, 0,3 мл 2% Р80, чтобы 149,7 мл CAMHB).
5. Далее разбавить промежуточные концентрации, полученного на стадии 2.2 1: 100 в катионной регулировать Мюллера Хинтона (CAMHB) с добавлением 0,004% (об / об), полисорбат-80 (Р-80) Р-80 и / или LHB (для стрептококков) добавили в двойном конечной концентрации, так как добавление инокулята (этап 4.3) приведет к в разведении 1: 2. См столбцы 6 и 7 в таблице 2 .

3. Подготовить MIC панели

1. Разлить по 50 мкл каждого раствора Dalbavancin, полученного на стадии 2.3 в соответствующие лунки MIC панели и включать в себя носители только в одной скважине (контроль роста и). Многоканальный пипеткой А с стерильные наконечники пипеток можно использовать для этого шага.
2. Использовать немедленно панели или печать с пластиковой пленки, места в пластиковые мешки и сразу поместить в не-оттаивания морозильной камере при ≤-20 ^{° С} (предпочтительно при ≤-60 ^{° С)} до тех пор, пока это необходимо. Если замороженные панели используются, снимите уплотнения и поместить отдельные панели на лабораторном столе в течение 15-30 мин (до содержание также не размораживают) перед переходом к панели прививки.

4. Привить MIC панели, выполните чистоты и установки количество колоний

1. Выберите несколько хорошо изолированных колоний из агара крови 18-24 ч или другой неселективного агаром. Нажмите в верхней части каждой колонии с помощью стерильной петли или тампоном и передачи 1-5 мл CAMHB или сАлина до мутности эквивалентно стандарту 0.5 McFarland. Оценка мутности при визуальном сравнении с 0,5 McFarland или с помощью фотометрического устройства.
2. В 15-30 мин подготовки, разбавленным инокулята 1: 100 в CAMHB (100 мкл в 10 мл CAMHB). Для большинства испытуемых бактерий против далбаванцина, за исключением S. пневмонии, это разведение обеспечит конечную концентрацию также 5 х 10 ⁵ КОЕ / мл (допустимый диапазон 2-8 х 10 ⁵ КОЕ / мл). Для S. пневмонии, концентрация бактерий на основе сравнения мутности на 0,5 McFarland, как правило, значительно меньше, следовательно, разбавленных 1:25 инокулята (400 мкл в 10 мл CAMHB + 10% + LHB).
3. В пределах 15 минут после приготовления инокулята, передавать по 50 мкл окончательного инокулята в каждую лунку (за исключением контроля стерильности а) ВПК панели, полученного на стадии 3. пипетки многоканальный А, используя стерильные наконечники могут быть использованы для этого шага.
4. Выполните проверку на чистотупутем передачи и распространения в 1-10 мкл аликвоты из положительного контроля роста и с помощью стерильной петлей с агара неселективного (например, Триптиказно соевом агаре с 5% овечьей крови).
5. Настройка количество колоний путем удаления 10 мкл из-под контроля роста также с одним пипетки канала и стерильной иглой и передачи в 10 мл физиологического раствора (1: 1000 разведение). Смешайте и передачи 100 мкл с помощью одного пипетки канала и стерильной кончика к подходящему, неселективного агаровой среде (например, Триптиказно соевом агаре с 5% овечьей крови) и распределяют по всей поверхности агара стерильной петлей, повторяя два раза в разных направлениях чтобы обеспечить равномерное распределение посевного (1:10).

5. Инкубировать MIC Панели количество колоний и чистоты Плиты

1. Печать каждый MIC панели или стопку не более 4 панелей в полиэтиленовом пакете, с пластиковой лентой или плотно закрывающейся крышкой до пластической инкубации. Кроме того, место пустое MIC панель на топ стека не более 4 микрофонных панелей, поместите влажную бумажную салфетку в пластиковый контейнер, место MIC панели в пластиковом контейнере и тесном контейнере с крышкой надежно.
2. Выдержите MIC панелей в окружающей воздушной инкубаторе при 35 ° C ± 2 ° С в течение 16-20 ч (стафилококки и энтерококки) и 20-24 ч (стрептококки) в течение 30 мин прививки. Выдержите подсчет колоний и чистоты пластин при тех же условиях, за исключением стрептококков инкубировать в 5% _СО 2 инкубатора.

6. Прочитайте MIC и количество колоний пластины; Проверку чистоты плиты

1. Читайте MIC как низкой концентрации, что полностью ингибирует рост бактерий в скважинах, как обнаруженных невооруженным глазом.
2. Граф колонии на счета колонии пластины. Умножение каждой колонии на фактор разведения (1: 10000) (например, 50 колонии эквивалентно 5 ^× 10 5 КОЕ / мл). Приемлемый диапазон 20-80 колонии (2-8 ^× 10 5 КОЕ / мл) и используется в качестве соответствуюximate руководство.
3. Проверьте пластины чистоты. Если все колонии похожи на колонии, используемого на стадии 4.1, то посевной можно считать чистым. Если есть какие-либо другие колонии, присутствующие, то есть потенциал для загрязнителем присутствовать в MIC панели и тест необходимо повторить.

7. Проверить Результаты контроля качества.

1. Обратитесь к таблице 3 для ожидаемых диапазонов штаммов контроля качества CLSI. Только сообщить результаты теста изолятов, если Dalbavancin МИК для контроля качества организма (ов) находятся в пределах ожидаемого диапазона.
2. Если МИК ≥0.25 мкг / мл достигается при любой клинической S. стафилококк изолировать, повторите тестирование Dalbavancin MIC и / или отправить референс-лабораторию для проверки.

Результаты

Стандартизированные MIC методы необходимы для того, чтобы контролировать развитие резистентности, важную цель различных программ антимикробных наблюдения. Результаты Dalbavancin MIC для изолятов, собранных в Европе и США в 2011-2013 гг были <0,25 мкг / мл для 99,9% S.aureus и 100% стрептококков (таблица 4).

Для оценки важности свежих (запечатанный) ДМСО, тройное тестирование Dalbavancin ПРО МИК для контроля качества штаммов S. стафилококк АТСС 29213, и E. фекальный АТСС 29212 и дублировать тестирование на S. пневмонии ATCC 49619 проводили с использованием (1) ДМСО из герметичных ампулах, (2) ДМСО от 1 л бутылке, который был в пределах срока годности и были использованы ранее в течение 2 лет и (3) аликвоту ДМСО из того же 1 л Бутылка (образец 2), что было позволено сидеть в открытом химическом стакане в течение 72 ч перед использованием. Dalbavancin результаты MIC с использованием панели из всех трех образцов ДМСО были похожи и жithin приемлемые диапазоны КК (Таблица 5).

Потеря активности Dalbavancin после воздействия исходного раствора до пластика и без добавления P-80 были хорошо документированы ^7. В 2-х дополнительных исследований, добавление Р-80, начальных и промежуточных растворов (таблица 6) и использованием стеклянных или пластиковых труб для подготовки исходных и промежуточных растворов (таблица 7) не имеют силу результаты Dalbavancin MIC. Там также не было влияние на Dalbavancin результатов MIC, когда полипропилена и полистирола пластины из трех производителей были использованы (Таблица 7).

Наличие лизированных лошадиной крови в бульоне сред для тестирования стрептококков, как было показано, чтобы иметь поверхностно-подобную активность, сравнимую с Р-80 ^{7, 8.} Ссылка Dalbavancin способ стрептококка же включать как P-80 и лизируют лошадиной крови ,Однако, в отличие от стафилококков и энтерококков, результаты Dalbavancin MIC для стрептококков схожи (в пределах +/- 1 разведение) с и без добавления P-80.

Как уже ранее представлены и показаны на рисунке 1, разбавление Dalbavancin агар (AD) МИК, как правило, 2-8 раза выше по сравнению с текущей BMD ссылкой ^{12, 13, 14.} В отличие от МПК, добавлением 0,002% Р-80 не влияет Dalbavancin AD МИК ^12.

Уравнение 1: Пример Dalbavancin маточного раствора Приготовление шагов подготовки к 25 мл 800 мкг / мл раствора Dalbavancin..

Рисунок 1. Сравнение Dalbavancin и ванкомицин ПРО в AD. Результаты исследования, по сравнению dalbavancin и ванкомицин БМД и AD ВПК Результаты грамположительных выберите бактериальных изолятов. Средняя (А) Dalbavancin и (Б) Ванкомицин Отвар микроразведения и агар Разведение MIC Результаты в мкг / мл для 15 золотистый стафилококк, 8 Коагулазонегативные стафилококков (ЦНС), 5 Enterococcus фекальный и 14 стрептококков (группы А, В и С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Даль 0.03

DAL; 0.06

DAL 0.12

DAL 0.25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Поз Ctrl.

В

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Даль 0.03

DAL 0.06

DAL 0.12

DAL 0.25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Поз Ctrl.

С

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Даль 0.03

DAL 0.06

DAL0.12

DAL 0.25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Поз Ctrl.

D

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Даль 0.03

DAL 0.06

DAL 0.12

DAL 0.25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Поз Ctrl.

Е

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Даль 0.03

DAL 0.06

DAL 0.12

DAL 0.25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Поз Ctrl.

F

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Даль 0.03

DAL 0.06

DAL 0.12

DAL 0.25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Поз Ctrl.

Г

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Даль 0.03

DAL 0.06

DAL 0.12

DAL 0.25

DAL 00,5

DAL 1

DAL 2

Поз Ctrl.

Н

DAL 0,002

DAL 0,004

DAL 0,008

DAL 0,015

Даль 0.03

DAL 0.06

DAL 0.12

DAL 0.25

DAL 0,5

DAL 1

DAL 2

Поз Ctrl.

DAL

Dalbavancin

Концентрации приведены в мкг / мл после 50 мкл / лунку инокуляции

Таблица 1. MIC плиты Формат. Показ расположение 96 Формат также пластина Dalbavancin разведения и положительных лунок контроля используется в качестве примера в этом видео публикации

1	2	3	4	5	6	7	8
Источник Конц. (мкг / мл)	Объем Источник (мл)	Объем ДМСО (мл)	Промежуточный Конц. в ДМСО (мкг / мл)	Объем средний Конц. (мл)	Объем CAMHB + 0,004% Р80 * (мл)	2X Конц. После разведение 1: 100 в CAMHB (мкг / мл)	Финал Группа Конц. После инокуляции (мкг / мл)
800	1.0	1.0	400	0.02	1.98	4	2
400	0,5	0,5	200	0.02	1.98	2	1
400	0,5	1.5	100	0.02	1.98	1	0,5
400	0,5	3.5	50	0.02	1.98	0,5	0,25
50	0,5	0,5	25	0.02	1.98	0,25	0,125
50	0,5	1.5	12,5	0.02	1.98	0,125	0.06
50	0,5	3.5	6.25	0.02	1.98	0.06	0.03
6.25	0,5	0,5	3.13	0.02	1.98	0.03	0,015
6.25	0,5	1.5	1.5	0.02	1.98	0,015	0,008
6.25	0,5	3.5	0,8	0.02	1.98	0,008	0,004
0,8	0,5	0,5	0,4	0.02	1.98	0,004	0,002
Эта таблица была изменена с CLSI M100-S25, Таблица 8B 3

Таблица 2. Схема Подготовка разведения нерастворимых в воде противомикробным препаратам, подлежащие использованию в бульоне Растворы восприимчивость тестирования. Объемы Dalbavancin рабочих растворов и разбавителей для подготовки окончательного MICDalbavancin растворы 0.002-2 мкг / мл.

Процедить Контроль качества	Ожидаемое Dalbavancin MIC (мкг / мл)
Золотистого стафилококка ATCC 29213	0.03-0.12
Е. фекальный АТСС 29212	0.03-0.12
С. пневмонии ATCC 49619	0.008-0.03

Таблица 3. Ожидаемое Dalbavancin MIC Результаты для контроля качества штаммов ^{3, 11.} Результатов контроля качества CLSI для предложенных штаммов для тестирования наряду с клинических изолятов для того, чтобы проверить правильность методологии

Таблица 4. Распределение Dalbavancin МИК (номер на каждом MIC) от США и Европейского 2011-2013 SurveillANCE Исследование ^15. Результаты Dalbavancin MIC из опубликованного исследования последних клинических изолятов в качестве индикатора текущего далбаванцина в пробирке деятельности.

Изолировать #	Dalbavancin MIC (мкг / мл)
	ДМСО 1	ДМСО 2	ДМСО 3
Золотистого стафилококка ATCC 29213	0.12	0.06	0.06
	0.12	0.06	0.06
	0.06	0.06	0.06
Е. фекальный АТСС 29212	0.06	0.06	0.06
	0.06	0.06	0.06
	0.06	0.06	0.06
S. пневмонии ATCC 49619	0,015	0,015	0,015
	0.03	0,015	0,015
ДМСО 1 = Неоткрытое пламя запечатаны мл ампулы 10
ДМСО 2 = Часто открыл бутылку 1л
ДМСО 3 = Часто открыл бутылку 1л - сидел на скамейке в непокрытого стакане в течение 72 ч

Таблица 5. Результаты Dalbavancin MIC (мкг / мл) с использованием ДМСО и промежуточных разведения препарат с ДМСО от 3 ​​источников. Итоги Dalbavancin MIC исследования, по сравнению эффект от использования различных растворителей ДМСО в подготовке Dalbavancin складе и промежуточных разведениях.

Изолировать Номер	Репликация Номер	Dalbavancin MIC (мкг / мл)
		DALB ж / Р80 в ДМСО	DALB без P80 в ДМСО
Золотистого стафилококка ATCC 29213	1	0.06	0.06
	2	0.06	0.06
	3	0.06	0.06
	4	0.06	0.06
Золотистого стафилококка клиническая DP80-002SA	1	0.03	0.03
Золотистого стафилококка ATCC 700699	1	0,5	0,5
С. пневмонии ATCC 49619	1	0.03	0,015
	2	0.03	0,015
	3	0.03	0,015
	4	0.03	0,015
С. Пирролидонилпептидаза клинические:
DP80-004PY	1	0,015	0,015
DP80-005PY	1	0.03	0.03
DP80-006PY	1	0.03	0,015
DP80-007PY	1	0.06	0.03
DP80-008PY	1	0.03	0,015
С. agalactiae клинической:
DP80-009AG	1	0.06	0.12
DP80-010AG	1	0.06	0.03
DP80-011AG	1	0.06	0.06
DP80-012AG	1	0.06	0.06
С. Клини dysgalactiaeкал DP80-013DY	1	0.03	0.03
С. пневмонии клинической:
DP80-014SP	1	0.06	0.06
DP80-015SP	1	0.03	0.03
DP80-016SP	1	0.03	0.03
DP80-017SP	1	0.06	0.06

Таблица 6. Dalbavancin MIC Результаты использования ДМСО и промежуточных разведения препарат с и без 0,002% Р-80. Результаты Dalbavancin MIC исследования, по сравнению эффект добавления 0,002% Р-80 до Dalbavancin акции и промежуточные разведения.

Изолировать	Репликация Номер	Фото Разведение Трубы				Микротитровальные пластины (пластик Тип)
						Поли-пропилен, Greiner	Полистирол
		Стакан	Пластик	Пластиковые 1 час	Пластиковые 1 час / 1 час средний		Greiner	Гранулирование	Nunc
Золотистого стафилококка ATCC 29213	1	0.06	0.03	0.03	0.03	0.06	0.03	0.06	0.03
	2	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.06
	3	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03
Е. фекальный АТСС 29212	1	0.06	0.06	0.06	0.06	0.03	0.03	0.06	0.03
	2	0.06	0.06	0.06	0.06	0.03	0.03	0.06	0.03
	3	0.06	0.06	0.06	0.06	0.03	0.03	0.06	0.03
С. пневмонии ATCC 49619	1	0,015	0,015	0,015	0,015	0,008	0,008	0,008	0,008
	2	0,015	0,015	0,015	0,015	0,008	0,015	0,008	0,008
Стекло = Исходный сделал в стеклянной бутылке, использовать сразу, чтобы сделать промежуточный концентрациис в пластиковых труб, используемых немедленно сделать отвар разведения.
Пластиковые = Исходный выполнен в пластмассовом центрифужную пробирку, использовать сразу, чтобы сделать промежуточные концентрации в пластиковых труб, используемых немедленно сделать отвар разведения.
Пластиковые 1 час = Исходный выполнен в пластмассовом центрифужную пробирку, пусть сидят на скамейке в течение 1 ч, затем используется, чтобы сделать промежуточные концентрации в пластиковых труб, используемых немедленно сделать концентрации в бульоне.
Пластиковые 1 час / 1 час средний = Исходный выполнен в пластмассовом центрифужную пробирку, пусть сидят на скамейке в течение 1 ч, затем используется, чтобы сделать промежуточные концентрации в пластиковых трубах, пусть сидят на скамейке в течение 1 ч, затем используется, чтобы сделать концентрации в бульоне.

Таблица 7. Dalbavancin MIC Результаты использования со разведения препарата в пластмассовых и стеклянных трубок и ВПК типов пластин пластика. Результаты оFA Dalbavancin ВПК исследование, что по сравнению эффект от использования пластиковых или стеклянных трубок при подготовке растворы, а также эффект от использования различных источников и видов пластика для микротитровальных пластин.

Обсуждение

Следующие сведения метод представлены дополнительные соображения при подготовке к Dalbavancin MIC тестирования. Конструкция MIC панели будет зависеть от количества антимикробных агентов, которые будут проверены (т.е.., По отдельности или несколько агентов Dalbavancin) и видов бактерий, которые будут проверены. Концентрации Dalbavancin должен охватывать толкования точки останова для всех видов бактерий, чтобы быть проверены и весь спектр разведения ожидаемых по крайней мере одного штамма контроля качества. Серия противомикробное разбавления могут быть организованы либо в строках или столбцах в зависимости от количества антимикробных агентов и / или изолирует / пластину и способ прививки. Объем Dalbavancin порошка и отвара должна быть рассчитана заверить, что оптимальные суммы производится и отходы минимальны. Для примера, используемого в данной публикации, объемы основаны на подготовке двух микрофонных панелей. Катион регулировать Мюллер Хинтон бульон должен быть подготовлен и в автоклаве в соответствии с человекаинструкции и стерильность СМИ ufacturer в проверке. MIC панели могут быть получены и использованы на тот же день подготовки или они могут быть проверены с соответствующими контроля качества организмов и проверенных панелей хранят в замороженном для использования в будущем. Важно использовать стерильные методики в течение всей процедуры.

Там нет строгих критериев для проверки концентрации инокулята с подсчета колоний. Подсчета колоний может быть проверено первоначально для каждого испытанного и / или периодически проверять на стадии разбавления, выполненного на этапе 4.2 видов. Важно, что действия стандарта 0.5 Макфарланда также проверяется регулярно с Е. палочка АТСС 25922, используя методику, аналогичную шагу 4.5. Если результаты не эквивалентны 1-2 х 10 ⁸ КОЕ / мл, новый стандарт 0,5 McFarland должны быть получены. Если колония насчитывает от ВПК скважин за пределами допустимого диапазона (2-8 х 10 ⁵ КОЕ / мл и MIC Результаты клинического изолята (ов) варьируются от йе Ожидается, нормальное распределение (например. 0.03-0.12 мкг / мл для золотистого стафилококка) и / или MIC Результаты контроля качества изолята (ов) находятся за пределами ожидаемых диапазонов, тестирование проверки необходимо и модификация метода может быть оправдано. Он предположил, что подтверждено стандартом 0.5 Макфарлэнд используется, чтобы повторить отсчет (ы) колонии, и если результаты вновь находятся за пределами ожидаемых результатов, разведение посевной, как выполняется на этапе 4.2, должны быть соответствующим образом скорректированы и ВПК повторяется. Обратите внимание, что проверка чистота необходимо, даже если количество колоний выполняется потому, что процедура подсчета колонии использует разбавленный объем, который не обязательно обнаружения низких концентраций загрязняющих организмов.

Для ВПК тест считается действительным, приемлемой рост должен происходить в контроле роста также. Для большинства бактерий, которые будут испытаны в отношении далбаванцина (т.е.., Стафилококки, стрептококки и энтерококки, рост будет рассматриваться как кнопки (обычно> 2 мм) и менее FRequently, рост может появиться мутности в скважине. В отличие от некоторых антимикробных агентов, которые могут проявлять силу, как конечные концентрации возрастают, конечные точки Dalbavancin, как правило, четко определены. Есть различные устройства, предназначенные для просмотра облегчить чтение микроразведений тесты, которые могут быть использованы для чтения Dalbavancin, содержащие пластины, пока нет никакого компромисса в способности различать рост в лунках.

Критические шаги в протоколе, связанные с частями в порядке, которые имеют отношение к растворимости далбаванцина и добавления P80. Важно, чтобы максимальная концентрация далбаванцина используется не превышает 1600 мкг / мл, что ДМСО используется в качестве растворителя, и что промежуточные концентрации готовят в ДМСО до принятия бульона разведений, так что конечная концентрация ДМСО в ВПК Панель скважин не больше, чем на 1%. ДМСО гигроскопичен и, следовательно, использование старых бутылок ДМСО был consideratиона с учетом растворимости Dalbavancin. Тем не менее, в то время как небольшое исследование БМД штаммами контроля качества показали, что это не будет важной переменной (см результаты раздел), это хорошая практика, чтобы использовать новые или недавно открытые бутылки ДМСО. Важно также, что Р80 добавляется к бульону на конечной стадии подготовки разведений лекарственного средства и при конечной концентрации 0,002% в ВПК скважины.

Процедура БМД включены использует препарат МИК панелей с использованием 50 мкл / лунку в далбаванцина и Р-80 концентрации в два раза, чтобы конечная концентрация и добавлением инокулята с 50 мкл / лунку так, чтобы конечный объем / лунку в 100 мкл. Этот метод позволяет в течение одного ВПК Формат панели должны быть произведены для тестирования как S. стафилококк и С. пневмонии, потому что лизируют лошадиной крови могут быть добавлены к инокулята. Альтернативные способы получения МИК панелей с использованием 100 мкл / лунку с добавлением до 10 мкл / лунку описаны вCLSI и ISO процедуры.

Dalbavancin подвержены останова для S. стафилококк является ≤0.12 мкг / мл (FDA пакет вставки). Как показано на недавнем наблюдением, большинство штаммов ингибируется Dalbavancin в количестве 0,06 мкг / мл ^15. С чувствительными останова недалеко от модального MIC, любое изменение в ВПК, в результате различий метод может повлиять на восприимчивость ставок. Поскольку процедура БМД для далбаванцина включает в себя несколько уникальных шагов (в частности, использование ДМСО в подготовке акции и промежуточных разведений наркотиков и 0,002% P80 в ВПК Ну, это важно, что метод выполняется в точности. Организм золотистого стафилококка КК (АТСС 29213) с очень четким Dalbavancin модального MIC 0,06 мкг / мл, был хорошим индикатором метода вариации и должен быть регулярно использован для проверки метода BMD. Если MIC результаты с ожидаемого диапазона 0.03-0.12 мкг / мл, но имеют тенденцию либо к низкой или HIGч сторона этого диапазона, дальнейшая проверка метода является оправданным.

Добавление 0,002% P80 рекомендуется для всех значимых грамположительных организмов (staphylococcci, энтерококков, и стрептококки.) Тем не менее, следует отметить, что было показано, что лизису лошадиной крови действует аналогично Р-80 по отношению к его анти-связывания Возможность и добавлением P-80 до + CAMHB LHB не имеет никакого дополнительного эффекта на Dalbavancin стрептококков МИК.

Там в настоящее время нет метода диск диффузии тестирования далбаванцина и из-за плохого соотношения МПК и результатов AD, восприимчивости тестирования далбаванцина методом AD не рекомендуется ^{12, 14.} Метод БМД должны быть использованы для будущей оценки Dalbavancin восприимчивости и как золотой стандарт для разработки коммерческих антимикробных испытаний чувствительности.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dalbavancin	Metrics, Inc.	Greenville, NC	BI-397
Vancomycin	Sigma-Aldrich	St. Louis, MO	C5793
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth	Becton Dickinson	Sparks, MD	212322
Lysed horse blood	Cleveland Scientific	Bath, OH
Dose-it peristaltic pump	Integra Biosciences	Hudson, NH
Multi-channel pipet (Viaflo II)	Integra	Hudson, NH	4164
12 channel pipet (Matrix)	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
Single channelpPipets (Ovation 10 µl - 100 µl)	VistaLab	Brewster, NY
96 well microplate	Greiner Bio-one	Monroe, NC	650161
50 ml flat cap conical bottom centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
16x125 mm disposable glass tubes	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
12x17 mm snap cap, polystyrene tubes	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
16 ml centrifuge tubes	BioExpress	Kaysville, UT	C-3394-2
Reagent reservoirs	Integra Biosciences	Hudson, NH	4312
Disposable sterilelLoops (1 µl & 10 µl)	Biologix	Lenexa, KA	65-0001,65-0010
Tryptic soy agar + 5% sheep blood	Becton Dickinson	Sparks, MD
Incubator (ambient)	Sanyo
Incubator (5% CO2)	Sanyo
Analytical balance	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
Gloves	Kimberly-Clark		52817
Lab coats