Модификация Colliculo-таламокортикального мозга мыши фрагмент, включающий 3-D печать палаты компонентов и нескольких масштаб оптических изображений

Резюме

Использование нескольких углов, чтобы сократить мыши щенок мозг, мы совершенствуем ранее описанной острой мозговой срез, который захватывает связи между наиболее крупных слуховых среднего мозга и переднего мозга структур.

Аннотация

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice¹, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Введение

В слуховой системы, хотя есть существенная переработка информации между сенсорной периферии и нижней бугорок, существует значительная дополнительная обработка, прежде чем он достигнет слуховую кору. Мы очень мало знаем о том, как, что обработка выполняется и поэтому немного о том, как эта трансформация позволяет мозгу интерпретировать входящий сенсорную информацию. За исключением обоняния, каждый из органов чувств имеет очень похожий организации с периферийными сигналов первоначально ретранслируется с высокой точностью, которая падает, как сигнал восходит к коре. Кора затем посылает проекции на нижних структур для дальнейшего модулировать поступающую информацию. Эта сложная система была изучена в различных формах в естественных условиях, а также в ряде препаратов в пробирке. В первом, все соединения целы, что позволяет исследователю зонд любой набор соединений, в то время как управление сенсорного ввода и измеренияВыход в любой данной области. При таком подходе, есть немного, чтобы не контролем большого разнообразия других входов, в том числе других сенсорных входов, возбуждение, и внимание, давая начало интенсивно сложной продукции. В пробирке, кусочки мозга были сокращены, чтобы захватить либо единый набор проекций, или двух областях мозга, связанных, которые позволяют исследователям, чтобы стимулировать и оценивать различные афферентные или участки мозга. Они часто либо таламокортикальных или tectothalamic ломтики где либо вход в таламус или таламус и его выход к коре сохранились ^2-5. Эти препараты позволяют для широкого спектра фармакологических, электрических и optogenetic манипуляций. Однако только два областей мозга, они в первую очередь оценить передачу информации и не имеют возможности оценить преобразования информации, как она проходит через таламус. Также ретикуло-таламических проекция, которая может играть роль в модуляции внимания ^6-9 является прESENT в этом срезе. Здесь мы показываем, улучшения на основании нашего предыдущего подготовки ^1, что позволяет контролировать следователя различных входов в таламус, чтобы дать уникальную перспективу, как таламус ворот и фильтров информации. Мы пара этот роман подготовка кусочек с изображениями флавопротеидом автофлуоресцентной для оценки связи ломтик и активационный анализ масштабную, визуализации кальция в таламусе для нейронов анализа населения, и запись одной ячейки для измерения влияния различных входов на одном уровне клетки.

Для оказания помощи в поддержании этих широко распространенных соединений мы также разработали ряд модификаций нормального среза якоря (ака "арфы") для проведения кусочек мозга в месте и мост, чтобы поднять кусочек для повышения перфузии. Арфа предназначен в модифицированной форме подковы, чтобы окружить кусочек и позволяют настраиваемых точек крепления для струн арфы. Три струныприкреплена таким образом, что I) одним лежит горизонтально вдоль медиального края среза, II) одним простирается от каудальной кромке IC к каудальной кромке AC и III) одним простирается по диагонали от медиального края среза в область ростральнее АС (рис 1А). Небольшие вмятины в кадре для склеивания (с цианакрилатного клея) арфы струны позволяют за снижение количества давления на срезе, чтобы помочь сохранить целостность ломтик (рис 1B). С помощью трехмерной печати, мы можем пользовательских арф дизайна для наших уникальных характеристик, а также мостов, которые позволяют идеального течения искусственного спинномозговой жидкости (ACSF) выше и ниже ткани. Это также поддерживает большие площади для света проникать в ткани для патч зажим электрофизиологии.

протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Институциональная по крайней университета штата Иллинойс. Все животные были размещены в учреждениях по уходу за животными, утвержденных Американской ассоциации по аккредитации в области лабораторных животных. Каждая попытка была сделана, чтобы свести к минимуму количество животных, используемых и уменьшить страдания на всех этапах исследования.

1. Подготовка и Удаление мозг от мышь для нарезки

1. Подготовка к перфузии и ломтик инкубации.
   1. Примерно за 30 минут до нарезки, подготовки высокую раствор сахарозы резки и низкий ACSF кальция для инкубации среза до записи или визуализации.
   2. Выложите все необходимые инструменты (большие тупой конец ножницы, маленькие ножницы, весенние анатомические щипцы, ножницы большие или гильотинные ножницы, ирис, ювелиры щипцы, 10 мл шприц с 27G х 1/2 дюйма иглы, небольшой кусочек в 1 см х 2 см фильтров бумаги и сломанной наконечником пипетки Пастера для SLлед передачи) для перфузии и нарезки, и подготовить перфузии лоток.
   3. Установите камеру инкубации с кислородом ACSF в С водяной бане 32 ^{вывода и} культуры блюдо, наполненный резки решение.
2. Подготовка резки этап для нарезки.
   1. Вырезать небольшой кусок 3% агара приблизительно 1 ^см 3 для использования в качестве обратного хода для мозга и 1,5 см х 1,5 мм х 3 мм для шишка будет использоваться, чтобы поддержать IC.
   2. Клей обратного хода на стадии с цианакрилатного клея, а также удар по правой стороне обратного хода так, что они образуют угол ⁸⁰ °.
3. Удалить мозга.
   1. Глубоко обезболить с p12-P20 (в идеале) p14-18 мышь с кетамином 100 мг / кг и xylaxine 3 мг / кг (или сопоставимых Комитета по этике, утвержденной процедуры).
      Примечание: Убедитесь, надлежащий уровень анестезии через отсутствие реакции на носок щепотку. Как животное под наркозом кратко, глазная мазь не является необходимым.
   2. Использование тупойконец ножницы, подвергать грудную клетку от мечевидного отростка до шеи.
      1. Найти мечевидного отростка, и сделать горизонтальный разрез приблизительно 1.5 см.
      2. Сделайте два вертикальных разрезов от концов предыдущего горизонтального разреза в плечи, примерно 1,5 см друг.
   3. Вырезать через диафрагму и реберно-хрящевой переходов, чтобы разоблачить сердце.
   4. При небольших весенних ножницами, сделать небольшой, 2-5 мм, вырезанные в правом предсердии, от вентральной к спинной стороне сердца.
   5. Используя 10 мл шприц с 27G х 1/2 дюйма иглы, инъекции в левый желудочек и быстро заливать животное с высоким содержанием сахарозы резки раствора.
   6. После того, как кровь бежит ясно, использовать больший ножницы, чтобы удалить голову.
      Примечание: Мы не систематически оценивать полезность перфузии. Однако, по нашему опыту, transcardiac перфузии у мышей этот молодой может быть сделано с почти 100% успеха, и не имеют преимущество устранения красных блOOD клетки, которые могут флюоресцируют и мешают визуализации.
   7. Разрежьте кожу вниз среднюю линию, чтобы подвергать черепа.
   8. Использование изогнутых диафрагмы ножницы, разрезать череп между глазами, то, начиная с разреза между глазами, тщательно вырезать спереди назад вдоль средней линии шва, заботясь, чтобы не повредить мозг снизу.
      Примечание: Твердая обычно отрывается с черепом. При необходимости, удалить твердую мозговую оболочку, прежде чем осторожно удалить мозг.
   9. Использование щипцов ювелиров, взломать череп и осторожно извлечь мозг, а затем поместите в мозг резки решение. Позаботьтесь, чтобы не повредить кору.

2. Подготовка мозг для нарезки

1. Подготовка мозг для монтажа на vibratome этапе.
   1. Использование слайд отмеченные двумя линиями на ⁹⁰ о и диагональную линию на ¹⁷ О с верхнего левого угла в правый нижний, пересекающихся, где две линии пересекаются, место мозга спинной стороной вверх, используялезвие, удалить 2-4 мм ростральной конца мозга, создавая ровную поверхность.
   2. Поместите мозга хвостовой стороной вверх на вновь созданный плоской поверхности, и выровнять поверхность спинной мозга с горизонтальной и срединной линии головного мозга с вертикальной линией.
   3. Выравнивание лезвие с 17 ^O линии, наклон бритвы на угол ³⁰ ° и удалить примерно 3 мм из правой коры в двойном диагональной резки (17 ^{вывода с} горизонтальной плоскости и ⁶⁰ ° от короны).
2. Монтаж мозг на vibratome этапе.
   1. Поместите кусочек фильтровальной бумаги 1 см х 2 см на брюшной стороне мозга, так что долго измерение перпендикулярно к средней линии.
   2. Осторожно нанесите небольшое количество клея цианакрилатного области перед блокиратором обратного хода (и слева от бугра).
   3. Поместите двойной диагонали вырезать лицо мозга на клей, так что хвостовой частью мозга и заднего мозга являются пропнут на удар, и правая сторона мозга против обратного хода.
   4. Тонко давить на мозг, гарантируя, что вся поверхность находится в контакте с нарезки камеры.

3. Получение Colliculo-таламокортикальных Slice

1. Быстро на сцену резания и место в vibratome, заполните этап с режущими решение.
2. Совместите лезвие с верхней (брюшной стороне) головного мозга.
3. Удалить 1-1,5 мм от верхней части мозга, удалить 300-500 мкм срезы и оценить глубину после удаления.
   Примечание: Когда СК, МГБ, и латерального коленчатого тела (ЛГН) все видно, и зубчатой ​​извилине образует "С" формы занять от одного до двух 600 мкм ломтиками. Смотрите рисунок 3A.
4. Место ломтики в нагретой (32 ^{° С)} проведение камеру.

4. Визуализация Slice

1. Подготовка к визуализации флавопротеидом автофлуоресцентной.
   1. Подготовка ACSF для перфузии ломтик в стандартной электрофизиологической записи камеры, пузырь ACSF 95% _O 2/5% CO _2.
   2. Потяните стеклянный электрод для стимуляции. Обратите внимание, что несколько различных электродов стимулирующие и конфигураций (стекло, вольфрам, углеродное волокно, монополярный, биполярный) все работает очень хорошо в сочетании с изображениями флавопротеидом автофлуоресцентной.
   3. Включите компьютер, фотоаппарат, микроманипулятора, источника света, стимуляция программное обеспечение, программное обеспечение захвата изображения.
   4. Заливать записи камеры с кислородом ACSF, разместить пользовательские мост (дизайн в дополнительные материалы), чтобы поднять кусочек в камере.
      Примечание: Скорость перфузии может меняться в зависимости от любого лица, созданной; 5-15 мл / мин здесь используется.
   5. Поместите кусочек в камере, снизить уровень жидкости в камере для предотвращения кусочек от подъема с моста при размещении специально построенную на арфе более ломтик, заботясь, чтобы избежать размещения арфа строк над путями ИнтерEST (1А). Увеличьте уровень жидкости приблизительно 1-2 мм выше среза для поддержания ACSF поток выше и ниже среза.
      Примечание: Если позиционирование необходимо, используйте сломанный конец пипетки Пастера или разрешить уровень ACSF расти и использовать щипцы с крайней осторожностью.
   6. Вставьте серебряный электрод хлорида в стеклянный электрод, наполненный ACSF вставьте стеклянный электрод в микроманипулятора и подключения к стимул изолятор, и осторожно поместите электрод в стеклянной IC / белого вещества, ведущей к таламуса (рис 1А).
2. Флавопротеида автофлуоресцентной получения изображения.
   1. Соберите изображения на 4 Гц (используя пейзажный исправлены 2X макро объектива (NA 0.13)) и камеру для 105 сек, а электрически стимулируя (каждый стимуляция состоит из 1 сек 40 Гц 2 мс импульсов ткани на 0,05 Гц пять раз) при освещении ткань с синего света 470-490 нм и захвата выше 515 нм. Убедитесь, что изображение ниТемнее, ни выдувается Рисунок 3 левый столбец для справки.
      Примечание: Время сбора, частота сбора, и частота стимуляции может быть изменен в соответствии с экспериментом, пользовательский программу включен в дополнительных материалах могут быть изменены как таковой.
   2. Экспорт изображений в Matlab, и с помощью пользовательского письменную программу доступной в дополнительных материалов для анализа спектральной мощности изображений в 0,05 Гц. Полученное изображение будет показать подключенные пути.
      Примечание: пользовательские программы использует быстрое преобразование Фурье значений пикселей во временном ряду для получения изображения.
3. Подготовка к визуализации кальция.
   1. Подготовьте небольшой инкубационный камеру с помощью 3 см культуры блюдо и поднял культуру мембраны позволяют ACSF достичь как верх и низ среза, и место на грелку, чтобы поддерживать температуру приблизительно 32 ^{о С.}
   2. Заполните небольшую инкубационный камеру с теплой ACSF и медленно пузырь с 95% O_2/5% СО _2.
   3. Смешайте 2 мкл Pluronic F-127 кислоты и 50 мкг фура-2 утра, растворенного в 48 мкл ДМСО.
   4. Место ломтик в небольшой камере инкубации на поднятой мембраны и тщательно с использованием микропипетки добавить окрашивания смеси непосредственно над МГБ (или другую структуру интересов).
   5. Обложка ломтики по предотвращению отбеливание до визуализации, позволяющие ломтики и инкубировать в течение 45 мин - 1 ч.
   6. Удалить ломтики в нагретой удерживающей камере в течение 10-15 мин смыть излишки материала.
   7. Выполните шаги 4.1.1 4.1.6 для подготовки, чтобы стимулировать и имиджа colliculo-таламокортикальных среза.
4. Кальций получения изображения.
   1. Соберите изображения с частотой 10 Гц (с использованием иммерсионного объектива 20X воды) в течение 25 сек, а электрически стимулируя (каждый стимуляция состоит из одного 2 мс импульса) ткани на 0,2 Гц в пять раз при освещении ткани с 365 нм света и захватив флуоресценции выше 510 нм.
   2. Экспорт изображений в Matlab и с помощью пользовательского письменную программу доступной в дополнительных материалов для анализа спектральной мощности изображений в 0,2 Гц. Полученное изображение будет показать активные клетки.

Результаты

Примером colliculo-таламокортикальных ломтик мозга мыши, полученные в Р15 мыши показано на рисунке 2. Идеальный кусочек будет содержать четыре основных мозга и переднего мозга слуховые структуры ИС, МГБ, РНН и переменного тока, которые все активированные когда СК стимулируется

Обсуждение

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system¹. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
High sucrose cutting solution			in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Low calcium aCSF			in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
aCSF			in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	Lot: 1572C502
Fura-2AM	Life Technologies	F1201	Lot: 144912
Pluronic F-127	Life Technologies	P3000MP	Lot: 1499369
Large culture dish	Fisherbrand	08-757-13	100 x 15 mm culture dish
Small culture dish	Falcon	353001	35 x10 mm culture dish
Raised culture membrane	Millicell	PICMORG50	Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.
Flavoprotein imaging fluorescence cube	Olympus	UMNIB	470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.  We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.
Calcium imaging fluorescence cube	Omega Optical	BX-18	XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission
Agar for blocking brain			3% by weight in water
Viper si Stereo Lithography Apparatus	3D Systems