Экстракорпоральное модели физиологических и патологических кровотока с применением к расследованиям клеток сосудов Ремоделирование

Резюме

Этот протокол повторяет физиологическим или патологическим поток крови в пробирке, чтобы помочь в определении клеточного ответа в патологии заболевания. Вводя давление демпфирования камеру вниз по течению от насоса крови, кровоток через сосудистую может быть наложен воспроизводятся и на монослой эндотелия сосудов или миметического совместного культивирования.

Аннотация

Сосудистые заболевания является частой причиной смерти в Соединенных Штатах. Здесь мы представляем метод для изучения вклада динамики потока к патологии сосудистого заболевания. Нездоровые артерии часто присутствует с настенным жесткости, рубцов, стеноза или частичное, которые могут повлиять на все скорости потока жидкости, и величина пульсирующего потока, или индексом пульсации. Репликация различных условий потока является результатом настройки давления потока демпфирующей камере ниже по потоку от насоса крови. Введение воздуха в системе замкнутого потока позволяет сжимаемой среды поглощать ударные давление от насоса, и, следовательно, изменяются индекс пульсации. Описываемый способ просто воспроизводить, с высоко контролируемого ввода и легко измеримых результатов. Некоторые ограничения воссоздание комплекса физиологической формы импульса, который только приближенно системой. Эндотелиальные клетки, клетки гладких мышц и фибробласты страдают от Thr кровотокаух артерию. Динамический компонент кровотока определяется выходной и артериальной стенки соответствии сердечной. Сосудистая клеток механо-трансдукции динамики потоков может вызвать высвобождение цитокинов и перекрестные помехи между типами клеток внутри артерии. Совместное культивирование клеток сосудов является более точная картина отражает взаимодействие клетка-клетка на стенки кровеносных сосудов и сосудов ответ на механическое сигнализации. Вклад динамики потоков, в том числе клеточного ответа на динамических и средних (или стационарных) компонентов потока, поэтому важным показателем в определении патологии заболевания и эффективность лечения. Путем внедрения в пробирке модель совместного культивирования и давление демпфирования ниже насоса крови, которая производит имитацию сердечного выброса, различные патологии артериальной болезни могут быть исследованы.

Введение

Заболеваемость сердечно-сосудистых заболеваний являются крупнейшим в Америке, многие в результате нездорового сосудов. Здоровые артерии состоят из эластичной ткани, с мягкой поверхности просвета покрытого эндотелиальных клеток (EC) монослоя. Артериальная потока может быть смоделирована как колебательной волновой функции с положительной средней скорости потока. Индекс пульсации (PI) является фактором колебаний величины и среднего потока (PI = (Макс. - Мин.) / Среднее), ^{1 и} был смоделирован в пробирке с переменной эластичностью сосудов ² эластичности артерий является важным хранения потока. энергия сердечных сокращений, расширяя при систолического давления, и играет важную роль в модуляции кровотока PI. Потому что сердце поддерживает последовательную, пульсирующее, объемный поток, артериальная расширение увеличивает площадь поперечного сечения, укрепления стабильности потока за счет снижения скорости потока, напряжение сдвига, и PI. Часто, нездоровые артерии представляют изменения эластичностиили соответствие, отображение жесткости из сосудистого ремоделирования, рубцовой ткани или кальцификации ^{3, 4.} Кроме того, другие сосудистые расстройства, такие как гиперплазии неоинтимы (NIH), ⁵ аневризмы и гипертонии ⁶ и сосудистой фиброза ^4, может сжиматься диаметр сосуда. Тем не менее, текущее лечение наркомании и лечение устройство сосудистых заболеваний часто пренебрегают важность соблюдения динамики стенки сосуда или кровотока в сосудистой болезни, которая часто осложняется изменениями в морфологии сосуда и свойств. Ни баллонная ангиопластика, ни стентирование ответить на усложнение стены эластичности ^7. Таким образом, моделирование в пробирке кровь течет в результате заболеваний артерий и лечения имеет важное значение в расследовании патологий болезни и будущей эффективности лечения. Здесь мы опишем метод тиражирования физиологических и патологических кровоток, предназначенный для определения реакции клеток в Pathol сосудистых заболеванийгиях. Поток жидкости вызывает напряжение сдвига на стенке сосуда, что является важным механический сигнал в здоровье сосудов, влияет на все клетки в сосудистой. Несколько механические датчики на эндотелий сосудов для жидкости сдвига были определены, в том числе первичной реснички, показанной в последних исследованиях для эндотелия mechanosensing ^8. Эндотелиальная активность клеток и морфология влияют на скорость потока, направление и пульсации. Кроме того, клетки гладкой мышцы (SMC) миграция может быть затронуты механо-сигналов низкого скорости потока через интерстициальной жидкости ^9, а также может быть через паракринной сигнализации от эндотелиальных клеток через их ответ на поток и механо-трансдукции сигналов расхода с помощью цитокина освободить ^10. К "доза" зависимость среднего сдвига, PI, и паракринной сигнализации может быть взаимозависимы. Для этого, определение реакции клеток сосудов к сдвигу жидкости с различной дозировки "" в монослоя культурыили совместное культивирование в пробирке может обеспечить механистические идеи в ремоделирования сосудов и улучшить болезни и прогноз лечения. Система подачи в этом эксперименте использовали состоит из насоса крови, выше по течению потока в воздушном резервуаре демпфирования, ниже по потоку расходомера только во время экспериментальной установки, расположенный ниже по потоку культуры клеток, проточную камеру с параллельными пластинами, и средства массовой информации резервуара. Контроль переменных сосудистых потока, такие как средняя скорость потока, ударов в минуту, и ПИ может быть достигнуто путем контроля расхода, частоты пульса, и внедрение давления демпфирования. Пульсирующие насосы крови доступны со смещением переменной инсульта, при контролируемой частоты хода, относящиеся непосредственно к виду объемный расход и частоту пульса. Введение воздушный резервуар внутри контура потока позволяет демпфирования давления, уменьшая величину колебаний потока. Медиа несжимаемой жидкости, в то время как воздух внутри камеры затухания является сжимаемым, что позволяет избыточное давление от волны потока будетпоглощается сжатия воздуха. Воздух соотношение СМИ позволяет за контроль над, как происходит большое демпфирование. Пользовательский культуры клеток проточная камера 75 мм в длину на 50 мм в ширину была создана из акрила. Поток входит через входное отверстие, и расширяет через впускной коллектор, обеспечивающий равномерную подачу по всей полноте проточную камеру. Похожие потока и структуры присутствуют на выходе камеры. Клетки высевают на функционализированных слайды, а затем прикрепляется к проточной камере. Это позволяет для больших групп населения, легко вызываются после исследования. Сотрудничество культуры эксперименты могут использовать пористую мембрану из поликарбоната для устранения клетки к клетке контакт между культурами, позволяя транспорт цитокинов / потока. Эта система была ранее использована для моделирования высокого пи поток и его влияние на эндотелиальную культуры монослоя и EC / SMC сокультуре ^{1, 10,} исследовать реакцию клеток на патологически высокой заболевания ПИ. Описывая протокол, используемый для моделирования этих кон потокаусловиях, мы надеемся помочь другим в определении вклада сигнала потока на мобильные ответ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. силанизация и биомолекулы Функционализация Slide или поликарбонат Мембрана

Примечание: Многие из химических веществ и решений в этом протоколе имеют высокие скорости испарения (этанол (EtOH), ацетон и т.п.). Другие шаги влекут за собой длинные времени инкубации для малых скоростей испарения. Парафин фильм рекомендуется для герметизации контейнеров. Внимание: Многие из химических веществ (в том числе: серная кислота, ацетон, (3-аминопропил) триэтоксисилана, глутаровый альдегид, этанол), считаются опасными или летучими. Обратитесь паспорт безопасности материала (MSDS) каждого материала для надлежащего хранения, обработки и утилизации перед использованием.

1. Поместите новый слайд стекла измерения 75 мм на 50 мм на 1 мм, в чистом стекле, окрашивание блюдо без учета ориентации, обеспечивая полное погружение. Используйте контейнер для шагов 1.1-1.12.
   Примечание: Для совместной культуры, включают в себя поликарбонат (ПК) мембрана с 0,4 мкм размером пор, нарезанные по размеру 75 мм на 50 мм, для всех последующих степс для ПК функционализации и ЕС посева.
2. Погружают слайд в серной кислоте (20%), O / N.
   Внимание: Проконсультируйтесь с MSDS для серной кислоты перед использованием.
3. Промыть слайд погружением в деионизированной воде (DI) в течение 5 мин, трижды, изменяя DI каждый раз.
4. Погружают слайд в ацетоне в течение 30 мин.
   Внимание: Проконсультируйтесь с MSDS для ацетона перед использованием.
5. Погружают в слайд 6% (3-аминопропил) триэтоксисилан / ацетонового раствора O / N.
   Внимание: Проконсультируйтесь с MSDS для (3-аминопропил) триэтоксисиланом и ацетона перед использованием.
6. Погружают слайд в ацетоне в течение 5 мин, трижды, изменяя каждый раз ацетоном.
   Внимание: Проконсультируйтесь с MSDS для ацетона перед использованием.
7. Промыть слайд погружением в DI в течение 5 мин, трижды, изменяя DI каждый раз.
8. Погрузитесь в слайд 1,5% раствора глутарового альдегида / DI в течение 60 мин.
   Внимание: Проконсультируйтесь с MSDS для глутаральдегидом перед использованием.
9. Промыть слайд погружением в DI в течение 5 мин, два раза, изменяя DI каждый раз.
10. Место слайдс в 70% этаноле (EtOH) в течение 30 мин в стерильной ламинарного потока капотом.
11. Удалить этанола и позволяют остатку испариться. Погрузитесь слайдов в стерильной DI и канализации для того, чтобы увлажняет слайдов.
    Примечание: Слайды или ПК мембрана может быть запечатаны в держатель стекло и хранили при 4 ° С в течение одной недели. При применении для культивирования клеток, повторите шаги 1.10 и 1.11.
12. Удалить слайд из держателя слайдов и поместите его в 100 мм на 100 мм квадратный Петри в капот ламинарного потока.
    Примечание: Этот контейнер будет использоваться для всех остальных стадий.
    1. Подготовка слайд или ПК для посева эндотелиальных клеток для монокультуры эксперимента.
       1. Шерсть функционализованный слайд или ПК (этап 1.11) с 1 мл раствора фибронектина (25 мкг / мл), с одной стороны, охватывающих приблизительно ту зону, подверженную клеточной культуральной камере.
       2. Инкубируйте слайдов или ПК в стерильной инкубатор при 37 ° С в течение 1-2 ч.
       3. После инкубации аспирации оставшийся раствор с помощью GLASS аспиратор пипетки подключен к вакууме.
          Примечание: Слайды теперь могут быть сохранены o / n при 4 ° С для последующего использования.
    2. Следуйте 1.12.2 шаги только для подготовки ЕС / SMC совместно культуры. Подготовка и семян гладкая мышечная клетка (SMC) культуру эксперимента сокультуры.
       1. Место силиконовые прокладки на верхней части слайда (шаг 1,11), с размерами 75 мм на 50 мм внешний диаметр, внутренний диаметр 50 мм на 30 мм, толщиной 0,5 мм и перфорации, которые выравнивают проточную камеру вакууме.
       2. Подготовка 1 мл SMC в 10% FBS / DMEM подвески. Нейтрализации 1 мл раствора 2 мг / мл коллагена типа I с 7% NaHCO ₃ и 0,1 М NaOH в растворе рН 7,4, и смешивают с суспензией SMC с конечной плотностью клеток 2 х 10 ⁶ клеток / мл.
       3. Распространение решение SMC в прокладке и инкубировать слайды при 37 ° С и 5% _СО 2 в течение 30 мин.
       4. После инкубации, покрыть слайд с 25 мл 0,1% бычьего сывороточного плода (FBS), смешанный в Игла в модификацииДульбекко (DMEM), в течение 72 ч.
13. Культура эндотелиальные клетки (ECS) на предметное стекло / поликарбонатную мембрану.
    1. Семенной 1 мл ЭК в 10% FBS / DMEM, с начальной концентрацией 6,0 х 10 ⁵ клеток / мл, по фибронектина поверхностей стекло или поликарбонатную мембрану.
    2. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 ° С, _5% СО 2 и 10% FBS, в течение 120 мин.
    3. Крышка скользит, содержащие клетки с дополнительным 10% FBS / DMEM и в инкубаторе место в 37 ° С, 5% СО _{2 O} / N, до 70% -80% сплошности.

2. Определение вязкости жидкости и объемный расход Оценить

Примечание: Поворот вискозиметры чувствительны оборудование, и руководство пользователя вискозиметр следует проконсультироваться перед калибровкой, обнуление, или при выполнении измерений.

1. Определите желаемый сдвиг жидкости (т) из литературы адресной сосудистой эксперимента в.
2. Изме 1% FBS / DMEM, вязкость (μ), используя ротационного вискозиметра.
3. Определить необходимый объемный расход (Q) из уравнения Пуазейля:
   ,
   где τ = сдвига жидкости, μ = вязкость, Q = т. расход, W = ширина камеры, и ч = высота камеры).
4. Установите насос темпы полученный в шаге 2.3 течь, и использовать для всех последующих шагов.

3. Определение индекса пульсации

Примечание: Все порты подключения в системе должно быть связано с соответствующим размером замок-кольцо-на-колючка, или женщин Луер-на-колючка соединений. Подключение трубки из ПВХ может быть подключен к анкерных фитингов, и цепь завершена.

1. Подключите циркуляционный контур как показано на рисунке 2, с затуханием камеру (рисунок 3) и ультразвуковой расходомер в правильном направлении потока.
   Примечание: Расходомер ультразвуковой является чувствительным часть оборудования, ируководство пользователя необходимо проконсультироваться перед использованием.
2. Заполните схему потока и резервуар с дистиллированной водой, обеспечивая на выходе трубки коллектора (насоса) погружен в объеме резервуара. Представьте потока сигнала с использованием расходомера.
3. Открыть выпуск воздушный клапан на демпфирования камеры, чтобы изменить соотношение жидкости / воздуха громкости. Закрыть воздуховыпускной клапан с различными интервалами уровень жидкости и расчета индекса пульсации (PI = (V _макс - _В мин) / V _{Среднее)} с помощью пикового потока сигнала (V _макс), корыто (V _мин), а значит, (V _{Среднее).} Запись значения PI в блокнот.
4. Отметить результате уровень жидкости и PI на демпфирования камеры, используя фетра, несмываемыми чернилами для использования в будущем. Определите требуемых уровней PI из патологии литературы ^11.
5. Силиконовая трубка Formation- Дополнительно, более продвинутый способ управления пульсации
   1. Смешайте базу силиконовой эластомерной и отвердитель в различных соотношениях (например, БАСотношение е-к-сшивающего агента от 10: 1 до 36: 1.) для разнообразных целевых модулей упругости, как показано ранее ²
   2. Изготовление силиконовых трубок при повторном процессе погружения отверждения, кратко погружения стального канюли (14 г) в силиконовой смеси форполимера с заданным соотношением база-сшивающего агента.
   3. Поместите форполимера покрытием канюли в сушильном шкафу при температуре 60 ° С в течение 4 ч, чтобы вылечить полимерное покрытие на канюлю, переключение направления в середине процесса отверждения.
   4. Повторите процесс погружения с тем же эластомерной смеси силиконового и поместить обратно в печь для дополнительного 4 ч, в результате чего ~ 0,3 мм толщиной труб.
   5. Извлеките ультратонкий силиконовую трубку с канюлей из нержавеющей стали.
   6. Подключите трубы, чтобы цепь вместо затухания камеру и тест PI для каждого потока, как в 3.3.

4. Насос Стерилизация

1. Погрузитесь в камеру потока (рисунок 2), трубы ПВХ, и прокладки в 10% перекись водорода _(H 2 O _2). Промыть стерильной DI перед шагом 4.
2. Поместите насос крови на запасной инкубатора полке.
   Примечание: Инкубатор полки должны быть из нержавеющей стали, и быть в состоянии выдержать вес всей цепи потока.
3. Заполните схему потока и резервуар с 10% H _{2 O 2,} обеспечивая на выходе трубки коллектора (насоса) погружен в объеме резервуара. Распространить _H 2 O 2 путем откачки через схему в течение 20 мин в ламинарном потоке с УФ-света на.
4. Аспирируйте все _H 2 O ₂ из трубы, и промыть стерильной PBS путем откачки через схему потока.

5. Расход палата Ассамблея

Примечание: Камера поток состоит из акрила, заказ пластины, с вакуумными портами и портами входе и выходе потока (рисунок 2). Палата в сборе состоит из размещения проточную камеру и прокладки на вершине культуры слайдов, проPerly выровнены, и описана ниже.

1. Разминка 1% FBS / DMEM в С на водяной бане 37 ° и подготовить проточную камеру.
   1. Возьмите EC слайд из средств массовой информации (со стадии 1.13) и место прокладки на верхней стороне с сотового вверх.
   2. (Необязательно) Возьмите PC мембраны из средств массовой информации (начиная с шага 1.13) и место прокладки на верхней стороне с сотового вверх. Поместите сокультуры слайд с посеянного SMC (шаг 1.12.2) под PC мембраны.
2. Совместите вакуумный канал проточной камеры с отверстиями в прокладке (рисунок 2).
3. Прикрепите к вакуумную трубку вакуумных портов (рисунок 2) не гарантирует отсутствие утечек в СМИ вакууме.
4. Место поликарбонат под стекло и узла камеры зажим потока с весенними зажимами, по одному на каждой стороне камеры потока (рис 2 и 5).
5. Система Место потока в инкубаторе при 37 ° С и 5% СО _2, и заполнить контур со средствами массовой информации путем откачки из заполненного резервуара при низкой пульсации.Поддерживать этот поток в течение 4 ч для предварительной подготовки клетки.
6. Отрегулируйте объем жидкости в камеру для демпфирования отмеченного уровня PI и культуры для нужного времени.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Обеспечение условий потока зависит от правильной сборки схемы потока (рис 1). Диаметр трубки является важным выбора в сборе, с большими диаметрами, снижающих сопротивление течению и последующее падение давления до и после культивирования камеры. Для обеспечения скорости, пред...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описан способ воспроизведения потока пульсирующего в пробирке, и может играть важную роль первый шаг в определении вклада условий потока в патологии болезни. Предыдущие исследования, использующие этот протокол нашли условия потока способствуют сосудистой воспали?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	34850
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	320501
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G5882
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Glass Slide (70 mm x 50 mm)	Sigma-Aldrich	CLS294775X50
Polycarbonate Membrane	Millipore Corp.	HTTP09030
Silicone Gasket	Grace Bio-Labs	RD 475464
Fibronectin (25 μg/ml)	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen Type-I	Sigma-Aldrich	C3867
NaHCO3	Fluka	36486
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
Damping Chamber			This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3.
Blood Pump	Harvard Apparatus	529552
Poly-Vinyl Carbonate Tubing	US Plastic	65066, 65063, 65062	Various sizes may be required
Luer Connections	Nordson Medical	Various	Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.
Culture Chamber	Machined in-house	Custom	Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber.
Square Petri Dish	Cole-Parmer	EW-14007-10
Glass Slide Holder	Capitol Scientific	WHE-900303
Fetal Bovine Serum	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Mediatech, Inc.	10-013-CV
Flow Meter	Sonotec, GmbH	Sonoflow co.55/060
Sylgard Elastomer Kit	Sigma-Aldrich	761036-5EA
14 G Steel Cannula	General Laboratory Supply	S8365-1