Органоиды как модель для инфекционных болезней: Культура человека и мыши желудка органоидов и Микроинъекция Helicobacter Pylori

Резюме

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Аннотация

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Введение

Изучение патогенных микроорганизмов зависит от адекватных модельных систем для имитации в естественных условиях заражение. Для некоторых инфекционных агентов, адекватные модели системы не хватает, а некоторые из используемых систем далеки от оптимальных. Одним из примеров является бактерия желудка Helicobacter Pylori (H.), который причинно связаны с развитием рака желудка. Тем не менее, в отсутствие более подходящей системы для культивирования клеток, многие исследования, направленные на анализ молекулярных механизмов, лежащих в основе линий Использование клеточного рака развитие рака, которые представляют собой конечную раковой каскада. Первичные, нетрансформированные клетки будет лучше модель для этих исследований. Тем не менее, первичные элементы доступны только с небольшим количеством доноров и не может быть культивировали в течение более длительных периодов времени. В последние годы исследования стволовых клеток был достигнут значительный прогресс, чтобы обеспечить новые источники первичных клеточных культур для изучения инфекции биологии.

Культуры сбыли использованы три источника стволовых клеток: Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) или взрослые стволовые клетки. Они были использованы для моделирования инфекции с вирусами, такими как цитомегаловирус ^1,2 или вируса гепатита С ^{3 ​​- 7,} паразиты, такие как Plasmodium малярийного ⁸ или ⁹ токсоплазма и бактерий, таких как Bacterioides thetaiotaomicron ¹⁰ или Salmonella enterica ^11. Совсем недавно, несколько подходов были опубликованы моделировать инфекцию с H. пилори с органоидов, полученных из ЭСК или плюрипотентных клеток ^12, стволовых клеток мыши взрослых ^21,22 или взрослого человека стволовые клетки ^{13 - 15.}

Развитие Органоид культур от взрослых стволовых клеток происходит от исследования, в котором единичные стволовые клетки, выделенные из мышиного кишечного эпителия высевали в 3-мерном матрицы ивстроенные в среде, имитировал окружающую среду кишечника стволовых клеток, содержащих EGF, как митоген, R-spondin для повышения сигналов Wnt и Noggin ингибировать кости морфогенного белок (BMP) сигналов ^16. Примечательно эти культуры не требуют совместного культивирования с мезенхимных клеток. В этих условиях, стволовые клетки пролиферируют и образуют небольшие структуры с доменов укрывает клетки из кишечных крипт и домены, которые содержат клетки кишечника ворсинки. В органоиды, таким образом, самоорганизуются, чтобы имитировать в естественных условиях ситуацию. Сегодня, взрослые стволовые клетки из многих мышей и гуманных тканей могут быть выращены в пробирке и самоорганизации в органоидов, которые напоминают их аналогов в естественных условиях, таких как тонкой и толстой кишки, желудка ^{17 13,18,} печени ^{19,20, 21 и} поджелудочной железы простаты ^22.

Здесь мы предлагаем видео протокола к культуре мыши или органоидов желудка человека от взрослых стволовых челLs и microinject их H. пилори. Этот протокол основан на предыдущих докладах ^13,18. Этот метод может быть адаптирован для культивирования и заражения других Органоид культур, таких как кишечной органоидов.

протокол

1. Установление желудка Органоид культуры

Примечание: Этот протокол может быть использован для выделения желудочных желез от мыши или тканей человека. Рекомендуется использовать ткани примерно 1 см. Человека ткань может быть получена из желудка резекции или биопсии.

1. Подготовка материала
   Примечание: используется матрица подвал Матригель. Держите подвал матрицу на льду во все времена. Хранить в подвал матрицу при -20 ° С и оттаивают на льду перед использованием. Базальная среда относится к Расширенный DMEM / F12, дополненной HEPES; соответствующий источник глютамина, таких как Glutamax и соответствующих антибиотиков, таких как 1x Primocin. Инкубатор используется стандартная культуры клеток инкубаторе (37 ° С, увлажненной атмосфере 5% СО ₂₎
   1. Стерилизовать подготовки посуду в автоклаве или с использованием 100% изопропиловый спирт: острые щипцы, ножницы, скальпель и стекло микроскопа слайда.
   2. Накануне изоляции, место 24 WELл клеточной культуры пластины в инкубатор.
   3. Подготовка подвал матрицу в соответствии с рекомендациями производителей. Подготовка аликвоты 1 мл, чтобы избежать повторных циклов замораживания и оттаивания.
   4. Подготовьте 500 мл хелатирующие буфер и прохладно на льду. Приготовьте 1х буфер из стерильной дистиллированной воды с 5,6 мм Na ₂ HPO _4, 8,0 мМ KH _{2 PO 4,} 96,2 мМ NaCl, 1,6 мМ KCl, 43,4 мМ сахарозы, 54,9 мМ D-сорбит, 0,5 мМ DL-дитиотреитола (ВНИМАНИЕ), рН 7. Если вы планируете несколько обособления, подготовить 5x концентрированный раствор без DL-дитиотреитола. Стерильный фильтр буфер. Перед изоляции, разбавить буфер 5x стерильной водой для 1x и добавить DL-дитиотреитола перед изоляции.
   5. Подготовка и разбавить все факторы роста в соответствии с рекомендациями производителей. Используйте маленькие размера аликвоты и избежать циклов замораживания-оттаивания. Функциональные факторы роста имеют решающее значение для результатов.
   6. Холодный базальной среде на льду и охладить до 4 центрифуги6; С.
   7. Теплый другой аликвоты минимальной среде до 37 ° С.
2. Выделение желез
   1. Соберите примерно 1 см ткани в ледяной базальной среде. Держите на льду до подготовки. Хотя предпочтительно, чтобы обрабатывать ткань как можно быстрее, магазин ткани в среде на льду, если необходимо.
   2. Поместите ткань в чашке Петри 10 см и покрыть ее холодной 1x хелаторной буфера. Вымойте осторожно двигаться вперед и назад.
   3. Поместите ткань в сухом 10 см чашку Петри. Использование щипцов, тщательно удалить слизь, а также мышечного слоя под стереомикроскопа. Вымойте ткань в холодной 1x хелатного буфера, осторожно двигаться вперед и назад.
   4. Поместите 1 см ² ткани на новой, сухой 10 см чашку Петри. Использование ножницами вырезать его в 20-50 маленьких кусочков примерно 2-5 мм ² размера.
   5. Использование щипцов, поместить все кусочки в 50 мл трубки.
   6. Возьмите стерильную 10 мл пластиковой пипетки. Намочите пипетки в буфер 1x хелатирующего. Держатьс помощью этого же пипетку в течение всей процедуры.
   7. Добавить 10 мл холодного буфера 1x хелатирующую в 50 мл трубки. Вымойте части энергично пипетки вверх и вниз 10 раз. Пусть штук решить. Удалить супернатант.
   8. Повторите промывание (стадия 1.2.7) до супернатанта ясно. Это займет примерно 50-100 мл 1x буфер хелатного 1 кв.см ткани человека.
   9. Инкубируйте части ткани в 20 мл 1x хелатирующего буфера с добавлением 10 мМ ЭДТА при комнатной температуре в течение 10 мин при осторожном инвертирования каждые 2 мин.
      Примечание: Время и температура инкубации может быть оптимизирована для каждой скорости и / или сохранения железистого архитектуры. Они могут варьироваться от нескольких часов инкубации при 4 ° С на постоянной платформы 5 мин при 37 ° С в шейкере со 200 оборотов в минуту. Хорошие отправные точки для желудка мыши на 30 мин при 4 ° С на платформе прокатки и для человеческого желудка, 10 мин при комнатной температуре.
   10. Внесите раз мягко вверх и вниз с помощью 10 мл пипетки. Разрешить пиECES, чтобы обосноваться. Удалите супернатант.
   11. Использование пипетки, передача части на чистую 10 см чашку Петри. Удалить жидкость.
   12. Поставьте стакан микроскопии слайд сверху тканевые части. Соблюдайте нетронутыми ткани под инвертированным микроскопом для культуры клеток с 10-кратным увеличением.
   13. Надавите на стекле и Петри. Держите как в руке (с стерильные перчатки) и нажав стакан с пальцем. Обод ткани появится облачно указывая, что железы выпущен из ткани.
   14. Соблюдайте выпущенные железы под инвертированным микроскопом для культуры клеток с 10-кратным увеличением.
   15. Сбор железы и ткани в 30 мл холодного базальной среде. Пусть крупные фрагменты ткани поселиться.
   16. Сбор супернатант, содержащий желез в двух 15 мл пробирок.
   17. Центрифуга 5 мин при 200g и 4 ° С. Удалите супернатант. Осадок содержит изолированные железы. Держите их на льду.
3. Посев желез
   1. Для посева держите подвал матрица ледяной на все времена, так что он будет оставаться жидкость.
   2. Вариант 1: Семенной 6 скважин разбавления подряд.
      1. Приостановить осадок в 60 мкл подвал матрицы.
      2. Подготовка 5 стерильные 1,5 мл пробирки на лед с содержащие 50 мкл базальной матрицы. Передача 10 мкл железы / подвал матрицы суспензии в первую пробирку 1,5 мл. Приостановка железы и передачи 10 мкл этого раствора к следующему 1,5 мл пробирку. Повторите в течение следующих труб.
   3. Вариант 2: Заполнение расчетного количества желез на лунку. Начало 100 желез на 50 мкл базальной матрицы в одну лунку 24-луночного планшета.
      1. Тщательно приостановить осаждали железы в 10 мл базальной среды. Поместите 50 мкл на чистую 10 мл чашки Петри. Подсчитать количество желез под инвертированным микроскопом для культуры клеток с 10-кратным увеличением.
      2. Рассчитать концентрацию желез в растворе. Перевести объем, который Контамодули 400 железы в новую пробирку 15 мл.
      3. Центрифуга 5 мин при 200g и 4 ° С. Удалите супернатант и держать трубку на льду. Добавить 200 мкл подвал матрицу и тщательно ресуспендируют. Держите на льду.
   4. Возьмите C теплую тарелку 24-а 37 ° (см шаг 1.1.2) из ​​инкубатора. Положите одну каплю 50 мкл желез в подвале матрицы в центре колодца. Падение образуют купол.
   5. Тщательно передачи пластины обратно в инкубатор для культивирования клеток. Пусть матрица подвал укрепить 10 мин.
   6. Подготовьте теплую среду со всеми факторами роста.
      1. Для человека желез: Дополнение базальной среды со следующими факторами роста для органоидам желудка человека: 50 нг / мл EGF, 10% Noggin-кондиционированной среды, 10% R-spondin1-кондиционированной среды, 50% Wnt-кондиционированной среды, 200 нг / мл фактора роста фибробластов (FGF) 10, 1 нМ гастрина и 2 мкМ ингибитора TGF-бета и 10 мкМ Rho-ассоциированной гибкой катушки формируя белок серин / треонин киназа ингибитор (RHOKi).
      2. Для мышиных желез: Дополнение базальной среды со следующими факторами роста для мыши органоидам желудка: 50 нг / мл EGF, 10% Noggin-кондиционированной среды, 10% R-spondin1-кондиционированной среды, 50% Wnt-кондиционированной среды, 100 нг / FGF10 мл, 10 нМ гастрина, 0,5 мМ ингибитора TGF-бета и 10 мкМ RHOKi.
   7. Возьмите пластину из инкубатора. Осторожно добавить 500 мкл среды со всеми факторами роста (1.3.6) в каждую лунку, не нарушая подвал матрицу. Поместите его обратно в инкубатор.
   8. Обновите среднего 3 раза в неделю (каждые 2-3 дней). Для освежающий среду, удалите старую среду с уходом каплю подвал матрицы нетронутыми. Осторожно добавить свежий, теплый среду со всеми факторами роста. Не добавлять RHOKi. Только добавить RHOKi непосредственно после посева желез или после расщепления органоидов (шаг 2).

2. Прохождение желудка Органоид культуры Перед микроинъекции.

ove_content "> Примечание: Каждый тип культуры имеет Органоид свое время удвоения мышь кишечного, а также желудка культуры, как правило, разделить 1: 5. каждые 5-7 дней человека кишечные культуры делятся 1:.. 5 каждые 10-12 дней человека желудочные культуры делятся 1: 5 каждые 14 дней Если инициатором от отдельных клеток, органоиды человека желудочные может также принимать 20 дней, чтобы должным образом сформировать Это хороший знак, если начинающие структуры окружают центральные просвет В этом протоколе, органоиды делятся в... 4 также пластины для микроинъекции. Обслуживание органоидов следует тот же протокол, но можно использовать любой другой культуры клеток пластину, например, стандартных клеточных культур пластин 24 а.

1. Подготовка материала
   1. Автоклав пипетки Пастера.
   2. За день до прохождения, место культуральный планшет 4 а в инкубаторе при 37 ° С. Хорошо пластины 4 имеют низкие края и позволит микроманипуляции.
   3. Подготовка подвал матрицу в соответствии с рекомендациями производителей. В день passagiнг, оттепель подвал матрицу на льду.
   4. Подготовка и разбавить все факторы роста в соответствии с рекомендациями производителей.
   5. Холодный базальной среде на льду и охладить центрифуге 4 ° С.
2. Прохождение Органоид культур
   1. Возьмите пластину с органоидов из инкубатора. Удалить среду из одной скважины.
   2. Добавить 1 мл холодной базальной среде в подвал матрицы в скважину. Использование 1 мл микропипетки, энергично пипетки вверх и вниз до тех пор, подвал матрица не распалась. Переход к 15 мл пробирку. Поместите на льду.
   3. Возьмите стеклянную пипетку Пастера и источник такого пожара как горелку.
      1. Держите кончик пипетки в огне, пока открытие наконечника не сократился с 1,5 мм до примерно 0,5 мм (рис 1). Пусть пипетки охлаждали до КТ.
      2. Намочите пипетки в базальной среде. Оптимально сужается пипетки займет среду заметно медленнее, чем не-сузился пипетки, но это будет по-прежнему всевл пипетки также.
   4. Возьмите органоиды в пипетку и энергично пипетки 10x вверх и вниз. Нарушение органоидов можно наблюдать невооруженным глазом.
   5. Добавить 9 мл холодной базальной среде и центрифугируют в течение 5 мин при 200g и 4 ° С.
   6. Осторожно удалите все супернатант. Приостановить осадок в 250 мкл подвал матрицы. Держите на льду.
   7. Возьмите 37 ° C теплый культуры пластину 4 а и поместить каплю 50 мкл органоиды / подвал матрицы в каждую лунку.
   8. Передача пластины тщательно обратно в инкубатор. Пусть матрица подвал затвердевать при температуре 37 ° С в течение 10 мин.
   9. Подготовьте соответствующий носитель для мыши либо или человека органоидов, как указано в шаге 1.3.6.
   10. Возьмите пластину из инкубатора и накладывать каждый подвал падение матрицу с 500 мкл среды.
   11. Передача пластины в инкубатор.
   12. Обновить среды 3 раза в неделю раз в 2-3 дня (см 1.3.8.).
   13. Для замораживания органоидов, Mechanчески нарушить органоиды, как описано для расщепления в этом протоколе (этапы 2.2.1-2.2.5.). Приостановить Органоид фрагменты в 500 мл замораживания среды и заморозить до -80 ° C с помощью криопробирок и морозильной контейнера. Для долгосрочного хранения, передачи трубы, чтобы жидкий азот.
   14. Для оттаивания органоидов, подготовить культуру пластину, подвал матрицу, факторы роста, холодной и теплой среды, как описано в пунктах 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7. Теплый замороженного флакон с использованием водяной бани и передачи клеток сразу после оттаивания в 15 мл пробирку с 10 мл холодного базальной среде. Центрифуга и пластины клеток, как описано в 2.2.5 2.2.12.
       Примечание: Микроинъекция органоидов является трудоемким, но позволяет уникальная возможность изучить взаимодействие в формате 3D.
   15. Если 3D исследования не нужны, семена органоиды в двух измерениях. Для этого, сорвать органоиды, как изложено в пунктах 2.2.1 2.2.6. Добавить 2250 мкл холодного среду со всеми факторами роста 250 мкл подвал маТрикс с Органоид фрагментов.
       1. Семена в 5 лунках 24-луночного планшета с 500 мкл на лунку. Изменение среды 3 раза в неделю, с тщательно замены только верхние 400 мкл, чтобы сохранить подвал матрицу в нижней части пластины ненарушенной.
          Примечание: органоиды будет приложить к культуре клеток пластину и расширяться в 2D. Электронно-микроскопическое показало, что апикальной стороне клеток сталкивается среды в скважине (данные не показаны).
       2. Перед инфекции, обменять все средние включая подвал матрицы, чтобы позволить бактериям прикрепляться к клеткам. Аналогичный протокол был также описан для инфекции с Н. пилори ^14. Слои 2D клеточные может содержать не все типы клеток, которые присутствуют в 3D органоидов.

3. Микроинъекция Органоид культуры.

Примечание: Этот протокол может быть использован для microinject бактерии в органоидам. Это может быть полезно, чтобы начать инъекцию органоидовкоторые являются более снисходительными к микроинъекции. Например, мыши органоиды желудка может вырасти в очень больших кистозных органоидов, которые легко настроить таргетинг.

1. Подготовка материала
   1. Вытяните стеклянный капилляр в двух инъекционных игл с использованием микропипетки съемник, в соответствии с рекомендациями производителей. Микропипетку съемник нагреет стеклянный капилляр в середине и будет тянуть капилляр в двух частях, таким образом, генерируя две стеклянные иглы. Это практично, чтобы вытащить несколько игл и хранить их в чистую чашку Петри.
   2. Чтобы бактериальной инфекции, антибиотики удалить из всех средств массовой информации, по крайней мере 3 средних изменений (= одна неделя). Это будет разбавлять антибиотики из подвала матрицы. При использовании бактериального штамма, который устойчив к определенному антибиотику, добавить этот конкретный антибиотик, чтобы минимизировать шансы на загрязнения.
   3. Подготовка верстак для микроинъекций. Для работы на разных уровнях биологической безопасности это может быть необходимо, чтобы поместить стереоМикроскоп внутри стерильной скамейке. В этом протоколе, придать Н. пилори под уровнем биобезопасности 2 условия под стереомикроскопа внутри стерильной скамейке.
   4. Культура бактерий по стандартным протоколам ^13,23.
   5. Чтобы оценить множественность заражения (МВД), оценить по двум параметрам: количество бактерий и количество клеток в Органоид как описано ниже. МВД может коррелировать с результатами, например с узлами IL-8 экспрессии мРНК ^13.
      1. Для вычисления бактериальной плотности в растворе инфекции, сначала установить стандартную кривую плотности и колониеобразующих единиц (КОЕ оптических) в соответствии со стандартными протоколами ^24. Оптическую плотность 0,1 при 550 нм должно дать примерно 10 ⁷ КОЕ / мл.
      2. Чтобы оценить количество клеток на Органоид, рассчитывать количество органоидов в 1 хорошо. Лишить органоиды, как описано в пунктах 2.2.1-2.2.4. После центрифугирования 5 мин при 200g и 4 ° С,добавить 1 мл ферментативного раствора диссоциации и ресуспендируют.
         1. Инкубируют при 37 ° С с повторными встряхивания в течение 5-10 мин. Определите, какие клетки распадается на отдельные клетки под микроскопом (инвертированного микроскопа, такие как Leica DMIL на 10-кратным увеличением). При необходимости продлить инкубацию.
         2. Граф клеток за органоид использованием гемоцитометра и подсчитать количество клеток на Органоид. Человеческие органоиды желудка диаметром около 200 мкм имеют примерно 4000 клеток. Инъекция 0,2 мкл бактериального раствора с 1 х 10 ⁹ бактерий на мл результатов в приблизительной МВД 50.
2. Инъекция органоиды.
   Примечание: микроинъекции, стекло иглы стабилизируется в держателе, который можно маневрировать в 3-х измерениях с помощью микроманипулятора. Органоиды оставаться в подвале матрицы в скважину. Из-за размера и расположения в яме, не все органоиды являются равной степениmenable инъекцией. Как правило, 30 крупнейших органоиды в одной скважине может быть направлена ​​в течение 5 мин.
   1. Урожай бактерии и мыть их в основной среде в соответствии со стандартными протоколами ^24.
   2. Рассчитать количество бактерий на мл в соответствии с оптической плотностью (см шаг 3.1.5.1). Развести бактерии 1 ^· 10 9 бактерий на мл в основной среде.
   3. Возьмите стеклянную иглу. Использование щипцов сломать кончик так, чтобы отверстие будет примерно 10 мкм в ширину.
   4. Вставьте иглу в держатель впрыска и исправить это микроманипулятора.
   5. Возьмите примерно 10 мкл бактериального раствора в иглу.
   6. Поместите 4 лунками с низкими краями, содержащих Органоид культур под стереомикроскопа.
   7. Навигация с помощью микроманипулятора, нацеленных на одну органоиды с иглой. Расположите иглу близко к Органоид, а затем вставить иглу в Органоид с одним быстрым движением. Вводите approximatelу 0,2 мкл бактериального раствора в каждую Органоид помощью microinjector.
3. Урожай органоиды для любого анализа.
   1. В качестве примера, исправить органоиды после 4 ч. Удалить супернатант и добавить 1 мл 2% формальдегида и инкубируют 20 мин при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Органоидам могут быть обработаны для иммуногистохимии соответствии со стандартными процедурами ^25.

Результаты

Этот протокол позволяет изоляции желудочных желез (рисунок 2). Железы высевают в подвале матрицы, которая затвердевает, как капли в скважине, обеспечивая 3-мерного рамки богатой ламинином и коллагена, чтобы позволить железы расти в органоидов (рисунок 3). Органоиды, как ...

Обсуждение

This protocol describes the use of ever-expanding, untransformed primary organoids from adult stem cells for infection biology. Critical steps are i) the isolation of viable glands, ii) expansion of organoids and iii) the microinjection. Below are some suggestions for modifications, troubleshooting and technical considerations.

Compared to other isolation methods, which use vigorous shaking or pipetting to release glands and can be equally successful, the technique presented here has the adva...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium
HEPES	Invitrogen	15630-056
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
Matrigel, GFR, phenol free	BD	356231
GlutaMAX	Invitrogen	35050-079	Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM
B27	Invitrogen	17504-044	Stock concentration 50 x, final concentration 1x
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Murine recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	Stock concentration 500 µg/ml, final concentration 50 ng/ml
Human recombinant FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 200 ng/ml
TGFβi A-83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM
[Leu15]-Gastrin	Sigma-Aldrich	G9145	Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM
RHOKi Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Wnt3A conditioned medium			Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers.
R-spondin1 conditioned medium			Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford.
Noggin conditioned medium			Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers.
R-spondin3	R&D	3500-RS/CF	Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/ml), but not yet on gastric organoids.
Noggin	Peprotech	120-10	Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/ml), but not yet on gastric organoids.
TrypLE express	Life Technologies	12605036	Enzymatic dissociation solution
CoolCell® Alcohol-free Cell Freezing Containers	biocision	BCS-405
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Invitrogen	12648-010
Antibiotics
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none.
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Stock concentration 10,000/10,000 U/ml, final concentration 100/100 U/ml. Can be used alternatively to Primocin in long term culture.
Other
Tweezers	Neolabs	2-1033	Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue.
4 Well Multidishes	Thermo Scientific	144444	You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator.
Micromanipulator	Narishige	M-152
Microinjector	Narishige	IM-5B
Stereomicroscope	Leica	MZ75
Workbench	Clean Air		Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition
Capillaries	Harvard Apparatus	GC100T-10	1 mm outer diameter, 0.78 mm inner diameter.
Micropipette Puller	Sutter Instruments	Flaming Brown Micropipette Puller
anti Cag A antibody	Santa Cruz	sc-25766