Направленный метод Эволюция<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em&gt;: Mutant Создание и скрининг библиотеки

Резюме

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Аннотация

Направленный эволюция в Saccharomyces CEREVISIAE предлагает много привлекательных преимуществ при проектировании ферменты для биотехнологических приложений, процесс , который включает в себя строительство, клонированию и экспрессии мутантных библиотек, в сочетании с высокой частотой гомологичной рекомбинации ДНК в естественных условиях. Здесь мы приводим протокол для создания и библиотеки мутантных экрана у дрожжей, основанные на примере грибковой арил-спиртовой оксидазы (АОА), чтобы повысить его общую активность. Два сегмента белка были подвергнуты сфокусированного направленной эволюции путем случайного мутагенеза и ин виво рекомбинации ДНК. Заходами ~ 50 б.п. фланкирующих каждый сегмент позволил правильную сборку гена ААО-фьюжн в линеаризованный вектор, что приводит к полной автономно тиражирование плазмиды. Мутант библиотеки , обогащенные функциональными вариантами ААО подвергали скринингу в S. CEREVISIAE супернатанты с чувствительным анализом с высокой пропускной способностью на основе реакции Фентона. Общий процессбиблиотека строительство в S. CEREVISIAE описанные здесь , могут быть легко применены к эволюции многих других эукариотических генов, избегая дополнительных ПЦР - реакций, экстракорпоральное ДНК - рекомбинации и лигирования шаги.

Введение

Направленный молекулярная эволюция представляет собой надежный, быстрый и надежный метод для разработки ферментов ^{1, 2.} Через итеративных раундов случайной мутации, рекомбинации и скрининга, улучшенные варианты ферментов могут быть сформированы , которые действуют на новых субстратах, в новых реакций, в ненатуральных среды, или даже помочь клетке для достижения новых целей обмена веществ ^3-5. Среди хостов , используемых в направленной эволюции, дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE пивовара предлагает репертуар решений для функциональной экспрессии сложных белков эукариот, которые никаким иным образом не прокариотических аналогов ^6,7.

Используется исчерпывающе в исследованиях клеточной биологии, эта маленькая эукариотической модель имеет много преимуществ с точки зрения пост-трансляционных модификаций, легкость манипулирования и преобразования эффективности, все из которых являются важными чертами инженеру ферментов путем направленной эволюции ^8. Кроме того, высокая частотагомологичной рекомбинации ДНК в S. CEREVISIAE в сочетании с его эффективным устройством корректура открывает широкий спектр возможностей для создания библиотеки и сборки генов в живом организме , способствуя эволюции различных систем от отдельных ферментов до сложных искусственных путей ^9-12. Наша лаборатория провела прошедшее десятилетие разработки инструментов и стратегий для молекулярной эволюции различных ligninases в дрожжах (оксидоредуктаз , участвующие в деградации лигнина в процессе естественного распада древесины) ^13-14. В этой связи, мы представляем подробный протокол для подготовки и экран мутантные библиотеки в S. CEREVISIAE для модели flavooxidase, -арил-спиртовой оксидазы (ААО ¹⁵⁾ -, который может быть легко переведено на многие другие ферменты. Протокол включает в себя целенаправленный направленный метод эволюции (морфингом мутагенный Организованная Рекомбинация процесса гомологичной в естественных условиях Группировка) при содействии аппарата дрожжевых клеток ^16, А.Н.да очень чувствительный метод скрининг - анализа , основанный на реакции Фентона с целью определения активности AAO секретируемый в культуральный бульон , ^17.

протокол

1. Мутант библиотека Строительство

1. Выберите регионы , которые будут подвергнуты морфинговой с помощью вычислительных алгоритмов на основе доступных моделей кристаллической структуры или гомологии ^18.
   1. Здесь цель две области ААО из вёшенка степная для случайного мутагенеза и рекомбинации (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), в то время как усиливающей остаток гена (844 пар оснований ) с помощью High-Fidelity PCR (рисунок 1).
      Примечание: Некоторые сегменты могут быть изучены с помощью морфинга в независимом или комбинированном образом ^16.
2. Amplify целевых областей с помощью мутагенной ПЦР. Создание перекрывающихся областей между сегментами (~ 50 б.п. каждая), накладывая ПЦР реакции определенных регионов.
   1. Готовят мутагенного ПЦР целевых сегментов в конечном объеме 50 мкл, содержащих ДНК-матрицы (0,92 нг / мкл), 90 нМ чувство олиго (RMLN для сегмента MI и ААО-BP для сегмента M-II), 90 нм аntisense праймер (ААО-92С для сегмента MI и RMLC для сегмента M-II), 0,3 мМ дНТФ (0,075 мМ каждого), 3% (об / об) диметилсульфоксида (ДМСО), 1,5 мМ MgCl _2, 0,05 мМ MnCl ₂ и 0,05 ед / мкл Taq - ДНК - полимеразы. Грунтовки последовательности подробно описаны на рисунке 1.
   2. Используйте следующую программу ПЦР: 95 ° С в течение 2 мин (1 цикл); 95 ° С в течение 45 сек, 50 ° C в течение 45 сек, 74 ° С в течение 45 секунд (28 циклов); и 74 ° С в течение 10 мин (1 цикл).
3. Amplify не-мутагенными области с ультра-высокой точности воспроизведения полимеразы и включают в себя соответствующие зоны перекрытия мутагенные сегментов и / или линеаризованный вектор свесы.
   1. Подготовка реакционных смесей в конечном объеме 50 мкл, содержащем: ДНК-матрицы (0,2 нг / мкл), 250 нМ олиго чувство HFF, 250 нМ олиго антисмысловой HFR, 0,8 мМ дНТФ (0,2 мМ каждого), 3% (об / об) диметилсульфоксида (ДМСО) и 0,02 ед / мкл ДНК - полимеразы iproof. Грунтовки последовательности подробно описаны в <сильный> Рисунок 1.
   2. Используйте следующую программу ПЦР: 98 ° C в течение 30 сек (1 цикл); 98 ° С в течение 10 сек, 55 ° C в течение 25 сек, 72 ° С в течение 45 сек (28 циклов); и 72 ° С в течение 10 мин (1 цикл).
      Примечание: В условиях , описанных в 1.2 и 1.3 из 43 наложений пар оснований (плазмида-М1 область); 46 пар оснований (M1 область ВЧ-область); 47 пар оснований (HF область-M2 область) и 61 пар оснований (M2 регионализация плазмида) предназначены (Рисунок 1) с целью способствовать в естественных условиях сплайсинга у дрожжей.
   3. Очищают все фрагменты ПЦР (мутагенные и мутагенными) с использованием набора для экстракции геля коммерческого в соответствии с протоколом производителя.
4. Линеаризовать вектор таким образом, что фланговые области примерно 50 пар оснований, которые созданы гомологичны 5'- и 3'-концов гена-мишени.
   1. Готовят реакционную смесь , содержащую линеаризация 2 мкг ДНК, 7,5 U Bam HI, 7,5 U Xho I, 20 мкг БСА и 2 мкл буфера Baм HI 10x в конечном объеме 20 мкл.
   2. Инкубируют реакционную смесь при температуре 37 ° С в течение 2 ч и 40 мин. Затем продолжить инактивацию при 80 ° С в течение 20 мин.
5. Очищают линеаризованного вектора путем экстракции в геле агарозы , чтобы избежать загрязнения с остаточной кольцевой плазмиды (рисунок 2).
   1. Нагрузка реакции переваривания смесь в мега-лунку полупрепаративной с низкой температурой плавления агарозном геле (0,75%, вес: объем), а также аликвоту (5 мкл) реакционной смеси в смежный хорошо в качестве репортера.
   2. Запуск ДНК-электрофорез (5 В / см между электродами, 4 ᵒC) и отделяют агарозный гель, соответствующий мега-колодец и хранить его при температуре 4 ᵒC в 1x TAE.
   3. Пятно полосу с молекулярной массой лестницы и репортера. Визуализируйте полосы под действием УФ-света. Ник положение, в котором линеаризованный вектор места.
      Примечание: Поскольку качество очищенного линеаризованной вектора является critiкал фактором успешной рекомбинации и сборки в дрожжах, избежать гель для окрашивания электрофореза полупрепаративной ДНК. Использование красителей и УФ - облучения для экстракции геля может повлиять на стабильность вектора ДНК, ставя под угрозу в естественных условиях эффективность рекомбинации. В качестве альтернативы токсичных EtBr красителей, гель Красный и SYBR красители обычно используются для окрашивания геля.
   4. При отсутствии УФ-излучения, определить линеаризованного вектора во фрагменте мега-луночного с использованием указаний о зарубок в окрашенном репортер полосу таким образом, чтобы его можно выделить.
   5. Извлечение линеаризованного вектора из агарозы и очищают его с помощью набора для экстракции геля коммерческого в соответствии с протоколом производителя.
      Примечание: Используйте высокого копирования челночные векторы с эписомными антибиотических и ауксотрофию маркеров: В этом примере мы использовали урацил независимый и ампициллину pJRoC30 вектор под контролем промотора дрожжей GAL1.
6. Приготовьте эквимолярное миxture фрагментов ПЦР и смешать его с линеаризованной вектора в соотношении 2: 1, с не менее чем 100 нг линеаризованной плазмиды (тест различных соотношениях эквимолярная библиотеки / открытого вектора для достижения хороших урожаев трансформации).
   1. Измеряют поглощение фрагментов ПЦР и линеаризованный вектор при 260 нм и 280 нм для определения их концентрации и чистоты.
7. Transform дрожжевых компетентных клеток со смесью ДНК с использованием набора для коммерческого трансформации дрожжей (см таблицу поставок) в соответствии с инструкциями изготовителя.
   1. При этом используют дефицитный по протеазе и URA3 ^- зависимой S. CEREVISIAE штамм BJ5465. Трансформации клеток с родительским замыкают в цикл вектора в качестве внутреннего стандарта в ходе скрининга (см ниже). Кроме того, проверьте фона путем преобразования линеаризованного вектора в отсутствие ПЦР-фрагментов.
      Примечание: В случае обнаружения начальных низких уровней секреции, используют S.CEREVISIAE с дефицитом протеазы , такие как штаммы BJ5465 способствовать накоплению активного белка в супернатантах культур. Если целевой фермент подвергается гипергликозилирование, использование гликозилирования-дефицитных штаммов (например, Δ kre2 что только способен прикрепляться меньшие маннозы олигомеры) может быть подходящим вариантом.
8. Тарелка трансформированные клетки на SC отсева учащихся из пластин и инкубировать их при 30 ° С в течение трех дней. Пластина (на SC отсева учащихся из пластин , дополненной урацил) URA3 ^- S. Клетки CEREVISIAE , не имеющие плазмиды в качестве отрицательного контроля для скрининга (см ниже).

2. Высокопроизводительный скрининг анализа (рисунок 3)

1. Заполните соответствующее количество стерильных 96-луночных планшетах (23 пластин для анализа библиотеки клонов 2000) с 50 мкл минимальной среды на лунку с помощью пипетки робота.
2. Выберите отдельные колонии из SC-выпадении пластин и передавать их на 96-луночные планшеты,
   1. В каждой пластине, прививают номер столбца 6 с родительским типом в качестве внутреннего стандарта и хорошо H1 с URA3 ^- S. Клетки CEREVISIAE (в SC среде , дополненной урацил) без плазмиды в качестве отрицательного контроля.
      Примечание: Ну H1 заполняется конкретно бросивших среде с добавлением урацила. Пустое лунку, содержащую носитель без клеток, могут быть также получены в качестве дополнительного контроля стерильности.
3. Покрывал пластины с их крышками и завернуть их в парафильмом. Инкубируйте пластин в течение 48 ч при 30 ° С, 225 оборотов в минуту и ​​80% относительной влажности во влажной шейкере.
4. Удалите парафином, добавьте 160 мкл экспрессионной среды в каждую лунку с помощью пипетки робота, запечатать пластины и инкубировать их в течение еще 24 часов.
   Примечание: минимальная среда и выражение среды получают , как описано в другом месте ^19. Уровни секреции могут варьироваться в зависимости от исследуемого гена и, соответственно, тон инкубацией раз должен быть оптимизирован в каждом конкретном случае для синхронизации роста клеток во всех лунках.
5. Центрифуга пластины (мастер - пластинки) , при 2800 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
6. Передача 20 мкл надосадочной жидкости из лунок в основной пластины к репликам пластины с использованием жидкости обработки роботизированную мультистанционной.
   Примечание: Для того, чтобы благоприятствовать фермента секреции рекомендуется заменить нативный сигнальный пептид белка - мишени с помощью сигнальных пептидов , обычно используемых для гетерологичной экспрессии в дрожжах (например, коэффициент α препропоследовательность лидер, лидер K ₁ Убийца токсина из S. CEREVISIAE, или даже химерные варианты обоих пептидов ^13). В качестве альтернативы, нативный сигнальный пептид, может быть исключительно эволюционировали для секреции в дрожжах.
7. Добавьте 20 мкл 2 мМ р -methoxybenzylalcohol в 100 мМ натрий - фосфатном буфере , рН 6,0 с помощью пипетирования робота. Перемешать пластины кратко с 96-мыLL планшет-миксер и инкубировать их в течение 30 мин при комнатной температуре.
8. С пипетирования робота, добавьте 160 мкл реагента FOX на каждую реплику пластины и кратко перемешать смеситель (конечная концентрация ЛИС смеси в скважине: 100 мкМ ксиленол оранжевый, 250 мкМ Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} и 25 мМ H ₂ SO _4).
   1. Добавьте несколько добавок к реагенту для повышения чувствительности, такие как органические сорастворители (ДМСО, этанол, метанол) или сорбитол ^17. Здесь, усиливают реакцию путем добавления сорбитол до конечной концентрации 100 мМ (рисунок 4).
9. Прочитайте пластины (режим конечной точки, т ₀₎ при 560 нм на планшет - ридере.
10. Инкубируйте пластин при комнатной температуре , пока цвет не разрабатывает и измерить поглощение снова (T _1).
    1. Вычислить относительную активность от разности между значением Abs после инкубации и у исходного измерения нормирована на ПАРЕntal типа для каждой пластины (t ₁ - T _0).
11. Тема лучшие мутантные хиты в двух последовательных повторных показов, чтобы исключить ложные срабатывания.
    Примечание: Как правило, повторные скрининги включают выделения плазмид из дрожжей, амплификации и очистки в кишечной палочки, а затем трансформации свежих дрожжевых клеток с плазмидой ^19. Каждый выбранный клон повторно показан в pentaplicate.

Результаты

ААО от P. eryngii является внеклеточным flavooxidase , который поставляет грибковые пероксидазы с H ₂ O ₂ , чтобы начать атаковать лигнина. Два сегмента AAO были подвергнуты сфокусированного направленной эволюции путем морфинга в целях повышения его активности и ег...

Обсуждение

В этой статье мы суммировали большинство советы и приемы используются в нашей лаборатории для конструирования ферментов с помощью направленной эволюции в S. CEREVISIAE ( с использованием Aao в качестве примера) , таким образом , что они могут быть адаптированы для использования с многими ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Not I restriction enzyme	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
7. Plates
96-well plates	Greiner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greiner Bio-One	655161	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greiner Bio-One	656171	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)