Смелостью, агрессивностью и обмеления Анализы для данио рерио Поведенческие синдромы

Резюме

This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

Аннотация

Поведенческий синдром существует, когда определенное поведение взаимодействуют в разных контекстах. Данио были подопытные в недавних исследованиях, и важно, чтобы стандартизировать протоколы для обеспечения надлежащего анализа и интерпретации. В наших предыдущих исследованиях, мы измерили дерзновение, контролируя ряд поведения (времени вблизи поверхности, задержки в переходах, число переходов и дартс) в 1,5 л трапециевидной бак. Кроме того, мы количественно агрессию наблюдающих укусов, боковые дисплеи, дартс и время возле наклонной зеркала в прямоугольный 19 л бак. Разделив 76 л бак на три, мы также рассмотрели обмеления предпочтения. Анализ обмеление является высоко настраиваемый анализ и может быть адаптирована для конкретных гипотез. Тем не менее, протоколы для данного анализа также должны быть стандартизированы, но достаточно гибкой для настройки. В предыдущих исследованиях, торцевые камеры были либо пусты, содержат 5 или 10 данио или 5 жемчужные данио (Д. albolineatus). В ВОЛПмычание рукопись, мы представляем подробный протокол и репрезентативных данных, которые сопровождают успешного применения протокола, что позволит для репликации поведенческих экспериментов синдрома.

Введение

Существует растущее тело литературы исследования ассоциаций между различными поведения внутри отдельных животных из данной популяции. Эти ассоциации называются поведенческие синдромы, а измерения обычно включают в себя смелость, агрессивность, исследовательское поведение и коммуникабельность ^1-5. Поведенческие синдромы являются ценными для прямых и косвенных причин. Непосредственно, знание поведенческих синдромов может обеспечить более полное представление о теории эволюции, популяционной структуры и динамики популяций ^3. Косвенно, знания о поведении ассоциаций может информировать поля, количественную оценку поведения , такие как фармакологию ^{6, 7} токсикологии, генетики поведения ^8,9 и эндокринологии ^10. Из-за этих прямых и косвенных выгод, повышенное знание поведенческих синдромов особенно ценно в наиболее часто используемых модельных организмов, таких как данио. Исследования с использованием данио найдены яна разнообразие дисциплин, включая анализ поведенческих синдромов ^11-13. Для продвижения знаний в области поведенческих исследований синдрома, а также потому, что другие дисциплины также используют поведенческие измерения для проверки гипотез, надежные и емкие описания поведения необходимы для действительных анализов и интерпретаций и стандартизованных протоколов облегчит между ознакомительные сравнения внутри видов. Наш протокол был разработан для измерения дерзновение-агрессия-обмеления поведенческий синдром в популяции лабораторных выращенных данио ^14. Тем не менее, в основе протокола (отслеживание отдельных рыб, обеспечение надлежащего рандомизации, и соответствующие анализы) могут быть легко изменены для различных альтернативных поведенческих мер. Кроме того, смелость, агрессивность, или обмеления анализы могут выполняться индивидуально для тестирования различных гипотез. Поэтому, в то время как наша цель, чтобы описать, как провести исследование поведенческих синдрома и протокол для успешной индивидуальной лEvel поведенческое измерение, каждый аспект этой процедуры может стоять отдельно.

В литературе по поведенческим синдромов охватывает несколько таксономических групп, от членистоногих к человеку ^4, и для того , чтобы измерить поведенческого синдрома, по крайней мере , два поведенческие контексты должны быть определены количественно. К сожалению, часто мало последовательности в анализах, которые используются для количественного определения поведенческого измерения поперек осей поведения. Например, в рыбе, дерзновение может быть измерена с помощью T-лабиринту анализы, открытые полевые анализы, или введение романа или иностранного стимула ^15. Агрессивность исследования в рыбе может включать в себя диады взаимодействия, видео стимула анализы или глины модели анализов ^12,16,17. Подобным же образом, анализ поведения мелеющий, который обычно включает измерение shoalmate предпочтения, могут быть выполнены в различных типах резервуаров, с различными методами для определения временной ассоциации ^21-23. В этом протоколе конкретное подмножество Overaповеденческий анализ Л.Л. репертуар представлен. В частности, этот протокол представляет методологию для отслеживания людей через смелостью, агрессии и обмеления анализов таким образом, что облегчает сравнение внутри отдельных лиц, чтобы определить, являются ли сравнения согласуются во всех особей в пределах популяции. Мы выполнили этот протокол с данио и арестантских цихлид (Amatitlania nigrofasciata) в предыдущих исследованиях ^14,18, и он будет работать с любым же размера пресноводных рыб.

Дерзновение анализы проводили в 1,5 л трапециевидной бак, который имеет горизонтальную линию очерчивания равные по размеру области, в верхней и нижней частях бака. Количественные модели поведения включают число переходов с помощью теста рыбы между верхней и нижней части резервуара, время, проведенное в каждой порции, количество дротиков, а также задержки, чтобы войти в верхнюю часть. Анализ агрессии производится в 19L прямоугольной резервуар, который включает3 дюйма х 5 дюймов зеркало наклонены приблизительно 22 ° , расположенные в нижнем левом углу резервуара ^19. Количественные модели поведения включают в себя общее количество времени , затрачиваемое целевой рыбы , взаимодействующей с зеркалом ^20, наряду с конкретными агрессивными показателями - количество укусов, боковые дисплеи, дартс между тестовым рыбы и ее отражение. Для этих конкретных показателей, укусы определяются как быстро выпады в сторону зеркала с открытым ртом, боковые дисплеи определяются как сжиганию боковая, грудные, анальных и спинных плавников в сторону зеркала, и дартс любые беспорядочные движения, которые не направлен к зеркалу. И, наконец, анализ обмеление квантифицирует поведение тест-рыб в центральной камере три-камерные танка. Боковые камеры резервуара являются либо пустыми, либо содержать "мишень" косяк рыбы, а время тест рыба проводит вблизи каждой боковой камеры измеряется ^21-23. Один составной показатель, называемый СтренGTH из Шаолинь (КНС), рассчитывается для каждого отдельного теста рыбы, определенной на раздражители, и могут быть использованы в анализе ниже по течению ^14. Все модели поведения оцениваются одним зрителем или нескольких зрителей с помощью бесплатного программного обеспечения поведенческого квантификации известный как JWatcher ^24.

Тестирование на наличие поведенческого синдрома, прежде всего , статистический стремиться, и желательно , чтобы следовать рекомендациям, представленные Budeav 2010 ^25. В частности, рекомендуется провести анализ главных компонент (PCA) на сосредоточенных и нормированных данных , в которых входы векторы поведения индивидуума в анализах с несколькими поведенческими измерениями (т.е., смелостью и агрессии). PCA, выполненный на корреляционной матрицы, уменьшает размерность поведенческих измерений, и, таким образом извлекает наиболее важные знания, что объясняет большую часть вариации. Извлеченные компоненты затем могут быть интерпретированы БАВред на высоких нагрузках фактором для индивидуального поведения процентных ставок и регрессии оценки могут быть извлечены для каждого человека на основе пояснительных компонентов. Эти оценки регрессии можно затем сравнить с измерением SoS и других различных не-поведенческих измерений, таких как размер рыбы или пола.

Этот рабочий процесс был реализован при изучении данио поведенческих синдромов , в которых был обнаружен секс специфический поведенческого синдрома , который существует между смелостью и обмеления ^14. В этой ситуации смелее данио мужчины более склонны ассоциировать с более крупными, более агрессивные виды (D. albolineatus), но эта связь теряется у самок. Этот рабочий процесс был также реализован в исследовании молоди цихлид каторжной родственников (Amatitlania nigrofasciata) ¹⁸ , в котором поведенческий синдром не был обнаружен, потенциально указывает на поведенческую пластичность вида. Таким образом, следующий протокол представлен WIth с целью оконтуривания природы трех конкретных анализов (дерзость, агрессивность, и обмеления) в рамках изучения в поведенческого синдрома индивидуальном уровне.

протокол

Следующие методики для жилищного строительства, ухода и исследования данио были одобрены университета IACUC Святого Иосифа.

1. рерио жилье и уход

1. Получить предмет данио от местного поставщика, или из пойманных населения. Пожалуйста, обратите внимание, что размещение данио подлежит директивам IACUC и дополнительных разрешений, необходимых для жилищного пойманных населения.
2. Выявление и отдельный данио по половому признаку. В качестве альтернативы, пропустить этот шаг или заменить другим методом разделения на основе исследования гипотезы.
   Примечание: половые признаки трудно определить в данио, особенно у женщин. Обратитесь к этим рекомендациям ¹⁰ или полезные интерактивные руководства отличить секс.
3. Случайным образом разделить население дополнительно в соответствующее отношение фокусного рыбы стимул рыбы. Примечание: Focal рыбы испытуемые следовали через серию behavioанализы, RAL и стимул рыбы являются физические лица, которые будут занимать раздражителя камеры в агрессии и обмеления анализов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Традиционно, от 1 до 5 особей на раздражитель фокальной рыбы в обмеления анализах и 1: 1 стимул: светосила рыбы в агрессии анализах ^14,17 используются. Тем не менее, исследователь должен специально разработать исследование с гипотезой в виду (то есть, должно стимул рыбы оставаться постоянной , чтобы поддерживать согласованность в фокальной поведения рыб, или должны стимул рыбы быть повернуты между каждым анализом , чтобы обеспечить надлежащее рандомизации).
4. Храните всю рыбу в данио жилищных стойках (27.5-28.5 ° C) под строгим 12:12 циклом свет / темнота. Подача всех фокусных и раздражитель рыбы чешуйчатый пищу ежедневно и еженедельно артемии, на не-исследовательских дней.
5. Убедитесь , что все тестирование проводится между ZT1 и ZT5 (время zeitgeber) , чтобы избежать циркадного ритма эффектов ^26.

2. Рандомизация и Tank установки

1. Randomize всех индивидов априори определенной последовательности поведенческих анализов. Настройка последовательной схемы рандомизации с использованием онлайн - генератор случайных последовательностей ²⁷ или генератор случайных последовательностей из статистического пакета программного обеспечения (R).
   1. Добавьте описание каждого анализа от 1 до 3 и держать это задание последовательно. Назначают случайную последовательность для каждого человека и отображают последовательность в соответствии с поведенческой наклейке анализа. Например, в течение трех полных анализов (1, отображенных в Шаолинь, 2 отображенной в дерзновением и 3, отображенных в агрессии), данное лицо может иметь рандомизированное последовательность '2,3,1', который будет требовать от них, чтобы выполнить конкретный поведенческие тесты в указанной последовательности.
2. Проводите анализ танков (дерзость, агрессивность, и обмеления) в лаборатории в тех местах, которые сводят к минимуму возможность неблагоприятных внешних раздражителей и быть уверены, чтобы иметь достаточно места для видеокамеры, чтобы захватить весь бак. Убедитесь, что видеокамера enougч ясность для просмотра танковые этикетки, а также быть в состоянии различить тонкие поведения фокальной рыбы и установки видеокамеры в этом положении.
3. Запишите все поведенческие анализы с помощью камеры, поддерживаемой в том же положении, с полным учетом указанного резервуара, чтобы свести к минимуму непреднамеренные различия в поведенческой скоринга в результате дифференциальных записей.
   Примечание: Избегайте размещения резервуаров в тяжелых торговли районах, а также двери, как движение и звук будет влиять на поведение данио.
4. Создание уникальных JWatcher протоколов ²⁴ для оценки каждого поведенческого анализа. Обратитесь к руководству JWatcher, чтобы узнать, как создать координационные мастер-файлы, чтобы назначить поведение на нажатие клавиш и очаговых файлов анализа для обобщения собранных данных.
   Примечание: JWatcher является поведенческая программа подсчета очков , что позволяет надежно и многократно подгонять поведенческого скоринга ^24.
5. Определить схему маркировки для отслеживания даты, количество рыбы, и количество анализа для всех поведенческих анализов (например,'F5-B-123115' подразумевая Рыба 5, Смелость анализ, на 31 декабря 2015 - ^го,) и разметить снаружи цистерны с лентой в поле зрения и в фокусе камеры. Хранить и записывать эту информацию в лаборатории ноутбук для быстрого ознакомления и дальнейшего контроля качества.
6. Установите бак акклиматизации, который будет использоваться между всеми анализами, а также непосредственно после того, как отдельные лица удаляются из корпуса стойки.
   Примечание: акклиматизации цистерны и терминальные цистерны небольшие аквариумы (40 см х 20 см х 25 см) с гравием и фильтр, который близко напоминают корпуса стойки.
7. После того, как анализы все завершено, передача индивида в отдельный резервуар терминала, который будет служить в качестве конечного резервуара назначения для всех используемых фокусных лиц. Используйте танк , который является достаточно большим , чтобы вместить группу лиц на оставшуюся часть своей жизни (например, 25 галлонов).
   Примечание: Очень важно поддерживать последовательные и одинаковые температуры и состояния воды ACROSs все танки. Это включает в себя корпус, акклиматизацию, и все танки тестирования.

3. Проведение Агрессия Пробирной

1. Проведение анализа агрессии в 19 л прямоугольного резервуара измерения 30 см х 15 см х 10 см. Оборудуйте бак во внешних непрозрачных перегородок, окружающих с трех сторон агрессии резервуара, оставляя переднюю открытую для просмотра, чтобы уменьшить нежелательные внешние раздражители. Разделите бак с внешней маркировки на четыре равные прямоугольные квадранта и закрепить зеркало на постоянной основе (с силиконовым затыкают) в нижнем левом квадранте, наклоненной под 22,5 ° образуя прямоугольный треугольник против дальней левой стороне бака.
2. Убедитесь, что температура воды в баке акклиматизации и агрессии бак находится в пределах 2 ° C от корпуса стойки. Для этого были свежее, в возрасте от воды, предварительно подогревают до 27.5-28.5 ° С готовы добавить к агрессии бак. Обратите внимание, что важно, чтобы изменить воду между каждого анализа исключить необоснованноеобонятельные сигналы.
3. Перевод, кровопускание, фокусного рыбу из корпуса стойки в отдельный акклиматизации резервуар, где он будет акклиматизироваться в течение 10 мин.
   Примечание: Важно, чтобы уменьшить стимулы, введенные для рыбы из-за неправильного обращения с ним. Передача лица , как описано ранее ^27.
   1. В частности, вручную и аккуратно поместите маленькую прозрачную пластиковую чашку в бак интерес. Не нарушая рыбы столько, сколько передачи, используя сеть, медленно выкопать рыбу в чашку.
4. Убедитесь, что видеокамера готова к записи, подтвердив, что агрессия анализа бак (см шаг 3.1) находится в фокусе и непосредственно перед передачей индивида в агрессии танка, пресс-записи на устройстве. Передача фокусного рыбы через кровопускание из акклиматизации бака агрессии бака.
   Примечание: Важно, чтобы записать до рыбы, поступающей в бак агрессии отслеживать точное время записи.
5. Запись Aggression бак в течение 10 мин и 30 сек, а затем чашка фокусного рыбы от агрессии бака обратно в бак акклиматизации.
6. При просмотре записи, подождите 30 секунд после того, как рыба была введена в бак в качестве дополнительного периода акклиматизации до голевых поведений.
7. Используя систему подсчета очков JWatcher, определенный для агрессивного поведения, количественно следующие модели поведения в течение 10 мин: время, проведенное рядом с зеркалом, количество зеркальных подходов, количество стрел, количество попыток укусов (открытие рта в направлении зеркала), а также количество боковых дисплеев (спинные, грудные, анальный, и монтаж хвостового плавника) ^9.
8. Оценка единого анализа агрессии, по крайней мере в два раза, пока анализ не забил с высокой степенью согласия между витками.

4. Проведение смелостью Пробирной

1. Проведение анализа дерзновение в небольшой 1,5 л трапециевидной бак, размером 15 см высотой х 26,5 см х 22,5 верх см Ширина нижней х 6 см. Оберните непрозрачную бумагу вокруг всех сторон ое цистерны, но оставить переднюю открытую для просмотра. Одиночные, тонкий кусочек ленты с наружной стороны корпуса, чтобы разграничить верхнюю от нижней части резервуара.
2. Убедитесь в том, что температура воды в резервуаре смелостью находится в пределах 2 ° С корпуса стойки (см шаг 3.2)
3. Передача фокусного рыбы из корпуса стойки к акклиматизации бака (см шаг 3.3), и пусть акклиматизироваться в течение 10 мин.
4. Убедитесь, что видеокамера готова к записи анализа смелостью и после того, как готов передать фокусного рыбу, нажмите запись на устройстве. Передача фокусного рыбы из акклиматизации бака в бак смелостью и записи в течение 8 минут и 30 секунд.
5. При просмотре записи, позволяют еще в течение 30 сек периода акклиматизации после того, как рыба вводится в бак перед скоринг.
6. Использование ПО JWatcher, количественно поведение смелость в течение 8 мин. В частности, количественно оценить следующие варианты поведения: времени вблизи поверхности, время задержки, чтобы ввести верхнюю часть, количество траnsitions в верхней части, и количество беспорядочных движений (дартс) ^29.
7. Оценка единого анализа смелости, по крайней мере в два раза, пока анализ не забил с высокой степенью согласия между витками.

5. Проведение обмеления Пробирной

1. Проведение анализа обмеления в 76 л бак, который имеет три отсека, разделенных двумя стеклянными перегородками залиты силиконовым затыкают (результирующие три отсека состоит из двух стимулов зон и одного центрального отсека). Внешне, отметьте две привилегированные зоны , обозначенные 6,35 см от каждого из стеклянной перегородки стимула зон ", что указывает на два тела Длины ^30. Применение непрозрачные перегородки снаружи вокруг трех сторон обмеление резервуара, но оставить переднюю открытую для просмотра.
   Примечание: Это предпочтение зона может быть настроена для проверки конкретных гипотез для разных видов размеров.
2. В зависимости от характера исследования, выберите стимула косяки акклиматизироваться в течение по крайней мере 12 часов BEFORе тестирования и оставаться в обмеления баке на протяжении всего эксперимента.
   Примечание: Стимул отмели представляют собой наборы отдельных рыб, которые используются для оценки того, как фокусное рыба ведет себя в присутствии или отсутствии этих отмелей. Различные комбинации стимула Shoal могут быть выбраны, чтобы проверить ряд разнообразных мелеющий гипотез. Убедитесь, что стимул косяки вращаются между каждой зоны стимула, чтобы избежать бокового смещения и также могут акклиматизироваться в течение по крайней мере 12 часов перед испытанием.
3. Перенести фокусного рыбу в акклиматизации резервуар, как описано выше (см 3.3)
4. Перевод, кровопускание, фокусного рыбу из промежуточного резервуара акклиматизации в центральный отсек в обмеления баке.
5. Разрешить в течение 10-минутного периода акклиматизации до 10 мин периода наблюдения живой забил. В качестве альтернативы, запись обмеление анализы и оценка позже с помощью JWatcher. Рыба определяются быть мелеющий, когда они находятся в пределах привилегированной зоны в камережилье целевой косяк.
6. Количественно время, проведенное в каждой зоне предпочтений и времени, затраченного в объеме центра.
7. В качестве дополнительной меры описательной, вычислить 'силу обмеления' (СЦ). Присвоить значение между -1 и +1, где величина описывает, как часто отдельные косяки рыб.
8. Рассчитывают соотношение времени, затраченного обмеления, деленное на площади обмеления зон и вычесть соотношение количества времени, затраченного не обмеления и площадь не-обмеления зон. Поместите эту величину по сумме времени, затраченного в каждой зоне, деленная на объем каждой зоны в отдельности. Более подробную информацию об этом расчета можно найти в предыдущем исследовании ^14.

6. Контроль качества данных

1. Анализ данных с использованием традиционных инструментов анализа данных ^31-32.
2. Тест на однородность дисперсии с использованием непараметрического теста Levene для всех форм поведения. Если поведение является неоднородным выполнить лог-преобразование33.
3. Убедитесь , что нет последовательности эффектов (то есть, что порядок рандомизации не влияет на поведение физических лиц ") с использованием Крускала-Уоллиса ANOVA на однородных данных ^34.
4. Убедитесь , что нет никаких побочных уклоны для анализа обмеления путем создания унивариантный общие линейные модели на индексы Сос со стороной в качестве фиксированного фактора ^35.
   Примечание: При наличии практически нет проблем с данными, вниз по течению анализ может быть проведен. Если есть вопросы, согласовать с дополнительными преобразованиями, рационализировать с биологически правдоподобные объяснения, и / или увеличить размер выборки.

7. Анализ данных

1. Вычислить двухвостый Спирмен ранговые корреляции ³⁶ для всех поведения отдельно в пределах смелостью и агрессии анализов.
2. Вычислить внутриклассовых коэффициенты корреляции (ICC) в качестве двусторонней смешанной модели с последовательностью поведенческих анализов, которые были проведены более одного тиме для данного индивида ^36. В этой установке ICC является измерение того, как последовательно рыбы вели себя в данном тесте измеряется более чем один раз.
3. Предварительная обработка смелостью и агрессивность поведения по центрирование и нормирование все типы поведения , чтобы подготовиться к входу к анализу главных компонент (PCA) ^25.
   Примечание: Предварительная обработка результатов измерений с помощью центрирования и нормированием является жизненно важным шагом. Без этой предварительной обработки ступенчатых поведения, которые происходят с большей частотой и более переменно будет чрезмерно влиять на интерпретацию извлеченных компонентов. Процесс центровки и нормированием удалит эту предвзятость.
4. Выполните PCA с корреляционной матрицей, чтобы определить, является ли дерзость и агрессия связаны друг с другом как поведенческого синдрома. Интерпретировать поведенческие нагрузки каждого компонента значим на> 0,6. См Будаев 2010 ²⁴ для всеобъемлющего руководства по отчетности РСА для изучения поведения. Осыпи сюжет будет информативен, на котором eigenvectors должны быть сохранены для интерпретации.
5. С помощью статистического пакета программного обеспечения , таких как R или SPSS ^31,32, извлекать оценки для каждого компонента для каждого индивидуума. Оценки представляют, насколько поведение данного индивида может быть объяснено конкретным компонентом.
6. Вычислить ранг Спирмена корреляции между фактором регрессии и оценки прочности мелел ^36.
   Примечание: поведенческий синдром считается, если присутствует смелость и агрессивность поведения нагрузки на том же компоненте или, если какой-либо компонент со значительными интерпретируемых нагрузок коррелирует с силой обмеления. Кроме того, обратите внимание, что сила обмеления не входит в РСА для обеспечения лучшего интерпретации более сложных поведенческих количественными (смелостью и агрессии). PCA будет ортогонально разрушаться дерзновение и агрессии в особенности собственных векторов, чтобы максимизировать количество объяснимых колебаний и хорошо подходит для этих сложных измерений. толкованияв результате собственных векторов и регрессирует наши силы измерений обмеления на каждом из них дает гораздо более интуитивным интерпретацию того , как каждый из сложного поведения (смелостью и агрессии) связаны с более четко определенной измерения двоичный обмеления (т.е. рыба мелел или не мелел).

Результаты

В зависимости от характера исследования и конкретного протокола, используемого, несколько различных результатов возможны в поведенческих синдромов эксперимента. В приведенных ниже таблицах и цифры, где указаны, взяты из нашего предыдущего исследования , опубликова?...

Обсуждение

Протокол будет определить, есть ли последовательные ассоциации в смелостью, агрессии и обмеления поведения в данио. Если существуют последовательные ассоциации в данной популяции между любыми из этих поведений, то поведенческого синдрома присутствует. Изучая естественный поведенче?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish Rack System	Aquaneering Inc	Cat. # ZS550
Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g	Pet Valu	Cat. # 31700
Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz	Brine Shrimp Direct
1.5 L Trapezoidal Tank	Pentair Aquatic Ecosystems	Cat. # itsts-a
19 L rectangular tank	That Fish Place	211932
76 L rectangular tank	That Fish Place	212180
Hitachi KP-D20A CCD Camera	Prescott's, Inc.
Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens	Nikon Corporation
ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3"	Michaels	Cat. # 10334162
Jwatcher
SPSS Statistics Base	IBM
R	The R Foundation